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Artículo de método

Los métodos para la determinación de las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de Trabajo

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DOI:

10.3791/54497

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28 de septiembre de 2016

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1Department of Physiology and Biophysics, Mississippi Center for Obesity Research, Cardiovascular-Renal Research Center, University of Mississippi Medical Center

En este artículo

Resumen

El siguiente protocolo describe la preparación y utilización de tampones para la medición cuantitativa de las tasas de oxidación de glucosa y ácidos grasos en el corazón de rata en funcionamiento aislado. También se discuten los métodos utilizados para el análisis de muestras y la interpretación de datos.

Resumen

El corazón de los mamíferos es un gran consumidor de ATP y requiere un suministro constante de sustratos de energía para la contracción. No es sorprendente, alteraciones del metabolismo del miocardio se han relacionado con el desarrollo de la disfunción contráctil y la insuficiencia cardíaca. Por lo tanto, desentrañar la relación entre el metabolismo y la contracción debe arrojar luz sobre algunos de los mecanismos que regulan la adaptación cardiaca o mala adaptación en estados de enfermedad. La preparación de corazón de rata aislado de trabajo se puede utilizar para seguir, de forma simultánea y en tiempo real, la función contráctil cardiaca y el flujo de la energía proporcionando sustratos en las vías metabólicas oxidativas. El presente protocolo tiene como objetivo proporcionar una descripción detallada de los métodos utilizados en la preparación y la utilización de tampones para la medición cuantitativa de las tasas de oxidación de glucosa y los ácidos grasos, la energía principal que proporciona sustratos del corazón. También se discuten los métodos utilizados para el análisis de muestras y la interpretación de datos.En resumen, la técnica se basa en el suministro de 14 C-glucosa marcada radiactivamente y un ácido graso de cadena larga radiomarcado 3 H- a un corazón latiendo a través de la perfusión ex vivo cristaloides normotérmica. 14 CO 2 y 3 H 2 O, subproductos finales de las reacciones enzimáticas implicadas en la utilización de estos sustratos de energía que proporciona, a continuación, se recuperaron cuantitativamente a partir del efluente coronario. Con el conocimiento de la actividad específica de los sustratos radiomarcados usados, es entonces posible cuantificar de forma individual el flujo de glucosa y ácidos grasos en las vías de oxidación. la función contráctil del corazón aislado se puede determinar en paralelo con el equipo de grabación apropiada y directamente correlacionado con los valores de flujo metabólico. La técnica es muy útil para estudiar la relación metabolismo / contracción en respuesta a diversas condiciones de estrés, tales como alteraciones en pre y después de la carga y de la isquemia, un fármaco o una Circulafactor de ting, o después de la alteración en la expresión de un producto génico.

Introducción

Relevancia clínica

En el corazón de los mamíferos, hay una fuerte relación positiva entre el flujo de sustratos a través de las vías metabólicas oxidativas, la generación de ATP y el trabajo cardíaco 1. Durante las últimas dos décadas, la investigación de la intrincada relación entre el metabolismo y la función cardíaca se ha llevado a reconocer que las alteraciones en el metabolismo cardíaco son una causa para la disfunción contráctil y remodelación estructural posiblemente patológica en la fijación de diferentes tipos de enfermedades del corazón 2-4. por lo tanto, se espera que nuestra comprensión de los mecanismos que regulan la remodelación metabólica del corazón subrayado dará lugar a la identificación de dianas terapéuticas para la prevención o tratamiento de la insuficiencia cardíaca 5-7. La reciente publicación de una declaración científica de la American Heart Association sobre "Evaluación de metabolismo cardíaco", subraya el creciente interés de la comunidad científica para tsu campo de investigación 8. Sin embargo, aunque los avances tecnológicos en imagen cardiaca ahora permiten una evaluación rápida y precisa de la morfología y la función cardíaca, el estudio in vivo del metabolismo cardiaco sigue siendo limitado y onerosa: la espectroscopia y resonancia magnética nuclear (RMN) Tomografía por Emisión de Positrones (TEP) puede se utiliza para seguir el metabolismo del fosfato de alta energía cardiaca y la actividad del ciclo de Krebs, pero estas técnicas se ven afectadas por los altos costos de operación y por su incapacidad para determinar la contribución de diversos sustratos para el metabolismo oxidativo en condiciones de estado estacionario 9 .Para esta fecha, el ex vivo trabajando preparación de corazón representa la sola y única técnica disponible para estudiar, de forma simultánea y en tiempo real, la función contráctil y el flujo de sustratos metabólicos oxidativos en las vías de 7,9. El siguiente protocolo tiene como objetivo proporcionar directrices para la preparación y utilización de los reactivos utilizados para determinar la rataes la utilización de sustratos en el corazón de rata aislado de trabajo.

El aparato aislado del corazón de roedores de Trabajo

Aunque la técnica es casi la mitad de un siglo de antigüedad, la preparación aislada de corazón de rata de trabajo sigue siendo un método de elección para la investigación cardiovascular. Al igual que con la preparación de corazón Langendorff, el corazón de roedores de trabajo ofrece una manera relativamente simple, fiable y de bajo costo para medir una amplia gama de parámetros cardíacos independientemente de los efectos de confusión de otros órganos, y otros factores neurohormonales circulantes. Pero en contraste con el corazón perfundido Langendorff, el corazón trabaja sigue llevando a cabo el trabajo cardíaco cercanas a las fisiológicas, un requisito previo para la generación de flujo metabólico oxidativo a niveles que son relevantes a las condiciones in vivo. Esto se logra mediante la entrega de la memoria intermedia de perfusión en el ventrículo izquierdo (VI) a través de una cánula conectada a la aurícula izquierda, y como el LV se llena y se contrae, latampón es expulsado a través de la línea aórtica frente a una presión hidrostática de la poscarga determinado. El diseño del aparato de perfusión descrito originalmente por Neely et al 10 fue mejorado posteriormente por Taegtmeyer, dobladillos y Krebs 11, pero ha cambiado muy poco desde entonces. Como se describe en el aparato original, la función contráctil se puede evaluar mediante la determinación del gasto cardíaco, utilizando no más de probetas graduadas y un cronómetro para medir los flujos aórtico y coronario 10,11. Varios vendedores ofrecen ahora sistemas completos de roedores de trabajo de perfusión del corazón. Estos aparatos disponibles en el mercado se puede adquirir con flowprobes, transductores de presión, un catéter de presión-volumen y todo el equipo necesario para la adquisición de datos de la función cardíaca y el análisis. Los proveedores ofrecen extensas sesiones de documentación y formación para familiarizar a los nuevos usuarios con sus equipos. Varios artículos de revisión también protocolos de detalle en el corazón trabaja instrumentación y en el uso de catéteres para medir la función cardiaca en los roedores 12-15. Por esta razón, sólo mencionaremos brevemente la configuración del aparato de perfusión y el aparato de control. El presente protocolo y no tiene por objeto complementar la información ya disponible con una descripción de los métodos que se pueden implementar para medir simultáneamente las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos de cadena larga, los dos principales sustratos energéticos que proporciona en el corazón normal. Describimos aquí todos los pasos implicados en el uso de sustratos de energía radiomarcados para la evaluación del metabolismo oxidativo del miocardio, de la preparación de los reactivos y tampones a la recuperación y procesamiento de las muestras, al análisis de datos.

Principios del método

Cardiomiocitos generan la mayor parte de su energía para la contracción de la fosforilación oxidativa de los ácidos grasos (ácidos grasos de cadena larga principalmente) y carbohidratos (Glucose y lactato). El corazón se ha muy limitada reservas energéticas y depende de un suministro constante de estos sustratos de energía que proporciona a partir de la circulación. El catabolismo de la glucosa a través de la vía glucolítica produce piruvato que después se descarboxila por el complejo piruvato deshidrogenasa de la membrana mitocondrial interna. ácidos grasos de cadena larga, extraídos de circulación de albúmina o lipoproteína de triglicéridos, se activan primero en moléculas de acil-CoA en el citosol y posteriormente transportados dentro de la matriz mitocondrial a través de la lanzadera de la carnitina para entrar en la vía de oxidación beta. Las moléculas de acetil-CoA producidos por el catabolismo de la glucosa y los ácidos grasos combustible el ciclo de Krebs para generar los equivalentes reductores (NADH y FADH 2) que son utilizados por la cadena de transporte de electrones para construir la fuerza protón-motriz través de la membrana mitocondrial interna y generar ATP a través de la actividad de la ATP sintasa. Agua y dióxido de carbono son los subproductos de extremo delas reacciones enzimáticas que tienen lugar dentro del ciclo de Krebs. El suministro de 14 C y 3 H- sustratos radiomarcados (como 14 C-glucosa radiomarcada y ácido oleico 3 H-radiomarcado) para el corazón aislado de trabajo será por consiguiente dar lugar a la producción de 14 CO 2 y 3 H 2 O que puede recuperar cuantitativamente a partir del efluente coronario. La colección de 14 CO 2 se lleva a cabo manteniendo el corazón aislado y perfundido en una cámara sellada y por la recuperación inmediatamente el efluente coronario a medida que sale del corazón. Una columna pequeña de intercambio aniónico se usa para separar y recuperar 3 H 2 O del efluente coronario. La radiactividad de las muestras procesadas se mide con un contador de centelleo líquido, y con el conocimiento de la actividad específica de los sustratos radiomarcados utilizado, entonces es posible cuantificar de forma individual el flujo de glucosa y ácido graso en lala oxidación vías 16,17.

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Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con la Política de Servicio de Salud Pública de los NIH sobre el Cuidado Humano y Uso de Animales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Mississippi Medical Center. Todos los procedimientos que implican el uso de radioisótopos se aprobaron y se realizaron de acuerdo con las directrices establecidas por la oficina de la seguridad radiológica de la Universidad de Mississippi Medical Center.

1. Preparación de soluciones de estabilización y Reactivos

  1. Krebs-Henseleit (KH) Soluciones para la reserva de estabilización
    1. Preparar 2 L de una solución concentrada 20x sal de reserva que contenía (en mol / L) 2,37 NaCl, KCl 0,0948, 0,0236 KH 2 PO 4, y 0.0236 MgSO 4 * 7H 2 O. Filtrar en una unidad de filtración de 0,45 micras de poro y se almacena a temperatura ambiente hasta por 1 mes.
    2. Preparar 2 L de una solución de 20x concentrado (0,5 mol / L) de NaHCO3. La solución puede seralmacenado a temperatura ambiente durante un período indefinido de tiempo.
    3. Preparar 250 ml de una / L solución de reserva 1 mol de CaCl 2. Filtrar en una unidad de filtración de 0,45 micras de poro y se almacena a temperatura ambiente hasta por 1 mes.
  2. La conversión de intercambio de aniones de la resina de la forma de cloruro a la forma de hidróxido
    1. Se lava la resina de intercambio aniónico mediante la resuspensión en agua ultrapura 1 L. Deje que la resina se asiente y verter el exceso de agua. Repita este paso 4 veces más.
    2. Se vierte la resina en un soporte de filtro de vacío microanálisis de vidrio montada en un matraz de filtración.
    3. Convertir la resina a la forma de hidróxido haciendo pasar lentamente a través de 22 volúmenes de NaOH 1 N. Mezclar la suspensión de forma intermitente con una espátula de acero inoxidable.
    4. Se lava la resina con agua ultrapura hasta que el pH cae por debajo de 9,0. Comprobar el pH regularmente por inmersión de una tira de prueba de pH cerca de la superficie de la suspensión de resina. Tapar y guardar la resina con agua ultrapura en un borosilicate botella de vidrio y protegerlo de la luz. No permita que la resina se seque antes de su uso.
      NOTA: Cuando se almacena adecuadamente, la resina tendrá una duración de al menos 3 meses.
  3. Ácido oleico-albúmina 8x Concentrado de Solución
    1. En un matraz de 4 L Erlenmeyer, mezclar 200 ml de la solución madre 20x de sal concentrada y 200 ml de la solución concentrada de NaHCO3 20x con agua ultrapura 3,6 L.
    2. El uso de un tubo de dispersión de gas con un cilindro poroso, el gas de la solución durante 15 min con una mezcla de dióxido de carbono 5% y oxígeno 95% para estabilizar el pH.
    3. Pour buffer de 470 ml en un vaso de precipitados de vidrio de 1 L. Añadir 8,75 ml de la 1 mol / L de solución de CaCl 2 stock en el búfer de 3530 ml restante en el matraz Erlenmeyer de 4 litros y dejar de lado.
    4. Añadir 40 g de ácidos grasos libres de BSA al vaso de precipitados de vidrio de 1 litro y se agita con una varilla de agitación hasta que se disuelva.
    5. En un tubo cónico de 15 ml, preparar 4 ml de un 50% (v: v) de etanol en agua ultrapura. Añadir 487 mg sodium oleato y agitar hasta que el polvo se haya disuelto completamente.
      NOTA: Algunos investigadores utilizan ácido palmítico en lugar de ácido oleico en el tampón de perfusión. Una solución de ácido palmítico albúmina se puede preparar siguiendo el mismo procedimiento. Sin embargo, se recomienda calentar la solución a 70 ºC para lograr la solubilización completa de palmitato de sodio.
    6. Añadir gota a gota la solución de oleato a la solución de BSA libre de ácidos grasos con agitación constante y esperar 10 minutos más para el complejo de ácido oleico-BSA para formar.
      NOTA: La solución debe tener un color amarillo claro y estar desprovisto de partículas visibles. La presencia de un precipitado o partículas insolubles puede indicar conjugación incompleta del ácido graso a BSA. Si esto sucede, la solución debe ser desechado y el proceso iniciado de nuevo.
      NOTA: palmitato precipitará si se le permite sentarse en una pipeta y no se puede añadir gota a gota. La solución agitada de BSA se puede calentar a 37 ºC para facilitar binding de ácido palmítico. No calentar demasiado ya que esto puede causar la desnaturalización y agregación de BSA.
      PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos de este protocolo implica la manipulación de material radiactivo. Use el EPP apropiado y siga las normas de eliminación de residuos y de seguridad establecidos por la oficina de la seguridad radiológica de la institución.
    7. Añadir 160 l (0,8 mCi) [9,10- 3 H] ácido oleico a la solución en agitación de ácido oleico-BSA y se agita durante otros 10 min.
    8. Añadir 2,5 ml de la 1 mol / L de solución de CaCl 2 stock a la solución en agitación de ácido oleico-BSA.
    9. Cortar aproximadamente 1,2 m de tubo de membrana de diálisis y enjuague tanto dentro como fuera con agua del grifo. Frote los tubos de diálisis vigorosamente con agua del grifo durante 10 a 15 min para eliminar el revestimiento de glicerol de la membrana. Como alternativa, eliminar el recubrimiento por inmersión del tubo de diálisis en agua caliente durante 1 hora antes de su uso. Finalizar enjuagando los tubos de diálisis con finales ultrapurar.
    10. Segura atar un extremo del tubo de diálisis. Rellenar con la solución de ácido oleico-BSA y atar el otro extremo del tubo de diálisis.
    11. Colocar el tubo de diálisis se introduce en el matraz Erlenmeyer 4 L de tampón KH y permitir dializar durante la noche a 4 ºC con agitación suave con una barra de agitación.
    12. Al día siguiente, se retira la solución concentrada 8x ácido oleico-BSA a partir de los tubos de diálisis. Use la solución de ácido oleico-BSA inmediatamente para la perfusión o alícuota y almacenar a -20 ºC. alícuotas congeladas son estables durante al menos 2 meses. Evitar ciclos de congelación-descongelación, ya que puede poner en peligro la solubilidad del complejo de ácido oleico-BSA.
      NOTA: Use sólo agua ultrapura (resistividad de 18,2 MΩ.cm a 25 ºC, carbono orgánico total <10 ppb, microorganismos ≤ 1 UFC / ml, partículas con un tamaño de más de 0,22 micras ≤1 / ml) para preparar los reactivos y tampones utilizado para la perfusión del corazón. La conversión de la resina de intercambio aniónico de su cloruro dem a la forma hidróxido se puede evitar la compra directa de la forma de hidróxido en un gasto adicional (ver Tabla de Materiales). Además de oleato o palmitato, cualquier otro tipo de ácido graso de origen natural también se puede utilizar, siempre y cuando una versión tritiada del ácido graso está disponible para seguir su oxidación.

2. Preparación del tampón de perfusión

  1. En un matraz de 4 L Erlenmeyer, mezclar 200 ml de la solución madre 20x de sal concentrada y 200 ml de la solución concentrada de NaHCO3 20x con agua ultrapura 3,6 L. Gas de la solución durante 15 min con una mezcla de dióxido de carbono 5% y oxígeno 95%, y a continuación, añadir 10 ml de la / L CaCl solución 2 stock 1 mol para ajustar la concentración de Ca2 + libre en 2,5 mmol / L.
    PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos implican la manipulación de material radiactivo. Use el EPP apropiado y siga las normas de seguridad y eliminación de residuos establecidos por la AR de la instituciónoficina de seguridad diación.
  2. Transferir 1.750 l de tampón KH a una botella de vidrio de borosilicato de 2 l. Añadir 250 ml de la solución de ácido 8x concentraron-BSA oleico, 1,802 g de D-glucosa, insulina 400 l a 0.4 U / ml, y 200 l (0,2 mCi) [U-14C] glucosa. Invertir botella para mezclar. Esto dará a 2 L de tampón de perfusión completa que contiene ácido oleico (0,4 mmol / L), D-glucosa (5 mmol / L), y la insulina (40 mU / ml).
    NOTA: Un volumen de 2 L es suficiente para perfundir un corazón de rata adulta trabajando en condiciones no de recirculación durante un mínimo de 60 min.
  3. Use un poco de la memoria intermedia de KH no radiactivo para llenar dos platos de disección y colocar en hielo para enfriar.

3. Preparación del aparato de perfusión

NOTA: El investigador puede elegir utilizar un aparato de perfusión hecha a la medida, tal como la descrita por Taegtmeyer, dobladillos y Krebs 11, o uno de los sistemas disponibles en el mercado. sistemas de perfusión se componen típicamente de laelementos descritos en la Figura 1 a continuación. Además de la tubería y la cristalería, el resto del aparato de control es opcional y su utilización dependerá de las necesidades del investigador para abordar la cuestión experimental que se preguntó. No obstante, se recomienda el uso de microelectrodos de oxígeno para determinar la concentración de O 2 en la entrada y salida de búfer de la circulación coronaria (Figura 1). Esto ayudará al control de investigador que el corazón se suministra con una cantidad adecuada de oxígeno, y que el suministro de oxígeno no varía entre los experimentos. Además, la determinación de la diferencia de oxígeno "arteriovenosa" se puede utilizar para calcular el consumo de oxígeno del miocardio y eficacia cardiaca 16,18.

  1. Encienda el baño de agua circulante y regulado a 37 ° C para calentar el aparato de perfusión.
  2. Encienda el ordenador y el sistema de adquisición de datos que seser utilizado para medir la función cardiaca.
  3. Conectar los dispositivos de grabación (catéter de presión, el catéter de presión-volumen, microelectrodos de oxígeno, medidores de flujo, etc.) al sistema de adquisición de datos y realizar la calibración de los instrumentos siguientes instrucciones del fabricante.
  4. Llenar el depósito de regulación con agua ultrapura. Encienda la bomba peristáltica y expulsar el agua a través de toda la tubería y cristalería para enjuagar el sistema. Apagar la bomba peristáltica y asegúrese de que no hay agua se queda en el tubo y / o material de vidrio ya que esto puede afectar a la concentración del tampón de perfusión y la preparación del corazón.
  5. Conectar un nuevo filtro de fibra de vidrio 1,0 micras en el sistema. Conectar el depósito de gas que contiene una mezcla de dióxido de carbono 5% y oxígeno 95% a la cámara de oxigenación.
    PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos implican la manipulación de material radiactivo. Use el EPP apropiado y siga las normas de seguridad y eliminación de residuos establecidos por la institución'S oficina de la seguridad radiológica.
  6. Llenar el depósito de regulación con tampón de perfusión. Encienda la bomba y asegurar el llenado de todos los tubos y cristalería con el tampón de perfusión. Ejecutar el tampón de perfusión a través del aparato de perfusión en el modo de recirculación de compuestos oxigenados y por lo menos 30 min antes de su uso.
  7. Estrechamente unir el tubo de una jeringa 20 ml debajo de la cámara del corazón para recuperar el efluente coronario. Conectar la punta de la jeringa a la parte superior de una llave de paso de tres vías. Conectar el brazo lateral a una jeringa de 3 ml. Conectar el brazo inferior mediante un tubo a un recipiente para residuos radiactivos líquidos.
    NOTA: Cuando se utiliza el complejo de ácido graso-BSA, la oxigenación del tampón de perfusión no se puede llevar a cabo a través de burbujeo directo con un tubo de dispersión de gas ya que esto hará excesiva formación de espuma de la solución. Use un oxigenador de membrana (Figura 1) o de una cámara de oxigenación flujo hoja para ese propósito. Es muy recomendable para verificar que un nivel adecuado of oxigenación se alcanza mediante la colocación de un microelectrodo de oxígeno en el circuito de perfusión (Figura 1).

4. Aislamiento de la rata del corazón y canulación

  1. Pesar de rata en una escala.
  2. Preparar una jeringa con la dosis de anestesia de 150 mg / kg tiobutabarbital hidrato de sal de sodio y una jeringa de tuberculina con 200 unidades USP de heparina.
  3. Inyectar tiobutabarbital IP y esperar a que el animal pierda la consciencia. Otros agentes de inducción pueden ser utilizados siempre que esto no interfiera con la finalidad del experimento (véase Elección del anestésico en la sección de discusión más adelante).
  4. Compruebe que el nivel adecuado de anestesia mediante la confirmación de la falta de reflejo de los pies pellizco. Asegúrese de mantener la adecuada profundidad de la anestesia para asegurar que el animal no siente dolor durante el procedimiento.
  5. Una vez que la rata es totalmente inconsciente y no responde a la pizca dedo del pie, lo coloca en la espalda a la mesa de operaciones y secure extremidades con cinta adhesiva o alfileres.
  6. Clip de la libre abdomen del cabello y realizar una incisión en la línea media del abdomen. No abrir la cavidad torácica en este punto todavía. Mueva el estómago y el intestino lado para revelar la vena cava inferior. Inyectar la heparina directamente en la vena cava inferior y esperar 5 a 10 seg antes de continuar.
  7. Usando tijeras cortan el diafragma y los lados de la caja torácica para exponer el contenido de la cavidad torácica.
  8. Delicadamente agarrar el corazón entre los dedos pulgar, índice y medio y los impuestos especiales tanto corazón y los pulmones juntos. Cortar a nivel de la aorta descendente, teniendo cuidado de no dañar el arco aórtico y la aorta ascendente en el proceso. Inmediatamente transferir corazón y los pulmones a uno de los platos de disección llenos con tampón KH enfriado con hielo.
  9. Después de que el corazón deja de latir, la transferencia a la segunda plato de disección y recortar los grandes fragmentos de tejido pulmonar adjuntos, manteniendo el corazón sumergido en tampón KH helada. Cortar el descensoing aorta justo por encima del arco aórtico.
    PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos implican la manipulación de material radiactivo. Use el EPP apropiado y siga las normas de eliminación de residuos y de seguridad establecidos por la oficina de la seguridad radiológica de la institución.
  10. Enjuague la línea aórtica del aparato de perfusión para llenar la cánula aórtica con tampón caliente y para eliminar cualquier agua o aire que todavía puede estar presente en el tubo. Dejar que el tampón de perfusión gotee de la cánula aórtica para minimizar la posibilidad de embolia de aire en el momento que el corazón está unido a la cánula.
  11. El uso de dos pinzas de disección micro abierto con cuidado a la aorta y el corazón deslice hacia arriba en la cánula aórtica. Fije la aorta en la cánula con un clip de micro e iniciar Langendorff perfusión del corazón. Observe el corazón comience a latir de nuevo y expulsar toda la sangre que queda en la vasculatura coronaria en los segundos siguientes al inicio de la perfusión.
    NOTA: Es muy importante llevar a cabo los pasos 4.6 a través de 4,10 tan rápido como sea posible para evitar el daño isquémico irreversible al corazón. Con la experiencia, todo el procedimiento debe tener entre 1 y 2 minutos. Al deslizar la aorta arriba en la cánula, tener cuidado de no pasar a la raíz aórtica ya que esto puede dar lugar a una hipoperfusión miocárdica y daños a la válvula aórtica.
  12. Ate la aorta a la cánula aórtica con una sutura de seda 3-0 y quitar la pinza micro. Localizar la vena pulmonar. Puede ser necesario recortar los tejidos no cardíacos para encontrarlo, pero no cortar demasiado de los tejidos no cardíacos, ya que servirán para atar la aurícula izquierda a la cánula.
  13. Enjuague la línea de la aurícula izquierda del aparato de perfusión para llenar la cánula auricular con tampón caliente y para eliminar cualquier agua o aire que todavía puede estar presente en el tubo. Tenga especial cuidado de eliminar cualquier burbuja de aire del aparato para minimizar la posibilidad de embolia de aire en el momento que el corazón está unido a la cánula.
  14. El uso de dos forc micro diseccióneps agarran con delicadeza la apertura de la vena pulmonar y el corazón se deslizan arriba sobre la cánula auricular. Puede ser necesario cambiar la posición del corazón haciendo girar suavemente la cánula de la aurícula y / o aórtica para llevar a cabo este paso. En cualquier caso, asegúrese de que el procedimiento no impone una carga excesiva sobre el corazón y causar la flexión de la aorta. Atar la aurícula izquierda a la cánula auricular con una sutura de seda 3-0.
  15. Abra la línea de fibrilación y al mismo tiempo cambiar la línea aórtica desde el modo de Langendorff al modo de trabajo. Si hay fugas de búfer fuera de la aurícula izquierda, cerca de la línea de la fibrilación, cambiar de nuevo la línea de perfusión de Langendorff aórtica, y el uso de otra sutura de seda 3-0 para empatar la aurícula izquierda con más seguridad a la cánula.

5. La medición de la función cardiaca y Toma de Muestra

NOTA: La determinación de los flujos metabólicos requerirá el conocimiento del flujo coronario (CF). Como se describe a continuación, los valores de flujo coronario puede serobtenida con el simple uso de un cronómetro. Además, la medición de flujo aórtico (FA) con el mismo método permitirá la determinación del gasto cardíaco (CO = CF + AF), que luego se puede utilizar para calcular la potencia cardiaca (CP) como una medida general de la función cardíaca mediante la aplicación de la fórmula CP = CO (m3 / s) * poscarga (Pa). Otro método disponible para la evaluación de la función cardiaca se basa en la medición del tiempo real de la presión de pulso con un transductor de presión (figuras 3 y 4). Aunque es opcional, las mediciones más precisas y detalladas de la función contráctil cardiaca y hemodinámica, incluyendo la determinación de la presión sistólica ventricular izquierda y diastólica funciones, se consiguen con el uso de un catéter de conductancia de presión-volumen (PV). En esta sección se describe brevemente la cateterización del corazón aislado. Información adicional acerca de la calibración de los catéteres PV y el análisis de datos con el software estadístico puede serencontrado en las referencias 14,15.
PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos implican la manipulación de material radiactivo. Use el EPP apropiado y siga las normas de eliminación de residuos y de seguridad establecidos por la oficina de la seguridad radiológica de la institución.

  1. Si el experimento incluye la medición directa de la función ventricular izquierda con un catéter, perforar el ápice del VI con una aguja de 26 G e introducir el catéter a través de la punción.
  2. Cuando se utiliza un catéter de presión-volumen, posicionar cuidadosamente el catéter de manera que su eje está alineado con el eje longitudinal del VI, con el electrodo distal derecho por debajo de la válvula aórtica y adyacente a la frontera endocárdica, y el electrodo proximal justo dentro de la pared ventricular.
  3. Sellar el corazón en la cámara del corazón con camisa de agua y controlar los parámetros funcionales cardíacos con el software de adquisición de datos. Iniciar la grabación después de los parámetros cardíacos de línea de base se han mantenido estables durante más de 5 minutos.
  4. Determinar el flujo coronario por measuring el tiempo requerido para llenar el tubo de la jeringa 20 ml unido por debajo de la cámara del corazón. Después de la medición, abrir la llave de tres vías para vaciar el efluente coronario en el contenedor de residuos radiactivos líquidos.
    NOTA: Las mediciones de flujo también se pueden realizar utilizando un medidor de flujo y flowprobes.
  5. Usar la jeringa 3 ml unido al brazo lateral de la llave de tres vías para recuperar ~ 2 ml efluente coronario a medida que sale del corazón. Transferir 0,5 ml del efluente coronario en un tubo sin tapón de microcentrífuga de 2 ml y proceder inmediatamente con la determinación de las tasas de oxidación de la glucosa (Sección 6 más adelante).
  6. Transferir el resto de la muestra del efluente coronario (~ 1,5 ml) en un tubo de microcentrífuga debidamente etiquetados y almacenar en hielo.
  7. Repita los pasos 5.4 hasta 5.6 a intervalos regulares (por ejemplo, cada 5 o 10 minutos) hasta el final del experimento de perfusión.
  8. Si se utiliza un catéter de presión-volumen, inyectar un bolo de 10 l de la solución salina hipertónica (15%)en la línea de la aurícula derecha y antes de la cánula auricular antes de concluir el experimento. Utilice esta inyección en bolo para calcular la conductancia en paralelo (V p), que es crítica para la determinación exacta del volumen cardíaco 15.
  9. Quitar el sello de la cámara del corazón y retirar el catéter del LV si uno se utilizó en el experimento. Recuperar el corazón utilizando una de las siguientes opciones:
    1. Si no hay necesidad de aislar zonas específicas del corazón para los análisis posteriores y si el aparato de perfusión permite, tanto los tubos de auriculares y la aorta cerca e inmediatamente congelar-abrazadera del corazón en sus cánulas utilizando pinzas Wollenberger previamente enfriado en nitrógeno líquido.
    2. Como alternativa, cortar el corazón de las cánulas y soltarlo en tampón KH helada. secar rápidamente el corazón en una toalla de papel y medir su peso en húmedo. El corazón puede ser diseccionado y recogido muestras de tejido para realizar mediciones específicas. Congelar el tejido restante usando pinzas Wollenbergers pre-enfriado en nitrógeno líquido.
  10. Almacenar el tejido del corazón congelado a -80 ° C hasta la determinación del peso en seco (ver sección 8. Los cálculos).

6. Determinación del infarto de oxidación de la glucosa tarifas

NOTA: El método consiste en la recuperación cuantitativa de 14 CO 2 a partir del efluente coronario con una solución de captura de hidróxido de hiamina. El 14 de CO 2 disuelto como H 14 CO3- se recupera después de la acidificación del tampón con ácido perclórico. Las muestras deben ser procesadas inmediatamente después de su recuperación como difusión pasiva de gas entre el aire y la muestra se traducirá en una pérdida de 14 CO 2 en el tiempo. Los viales de centelleo deben estar bien selladas con los tapones de la manga de goma para evitar la pérdida de 14 CO 2 después de la adición de ácido perclórico. Si es necesario, Parafilm puede ser usado para asegurar los tapones de goma a la mangaviales (Figura 2).

  1. Añadir 1 ml de 10x concentrada de hidróxido de hiamina a viales de centelleo de vidrio (un vial por muestra + dos viales adicionales para la determinación de la actividad de fondo).
    PRECAUCIÓN: Hidróxido de hiamina es altamente tóxico y provoca graves quemaduras. Consultar la ficha de seguridad de productos para el manejo y almacenamiento apropiado.
  2. Con ayuda de pinzas delicadamente transfieren el tubo sin tapón de microcentrífuga de 2 ml que contiene la muestra de efluente 0,5 ml coronaria a un vial precargada con el hidróxido de hiamina. Use 0,5 ml de tampón de perfusión para la determinación de la actividad de fondo.
  3. Se tapa el vial con un tapón de manguito de goma. Parafilm puede ser usado para asegurar el sellado del vial. Usando una jeringa de 1 ml y una aguja larga 23 G, inyectar 200 l de ácido perclórico (60% w: w%) a través del tapón de manguito de goma y directamente en el tubo sin tapón 2 ml.
    NOTA: El efluente coronario debe girar blanco debido a la precipitación de BSA.
  4. Dejar que los viales sdurante la noche.
    PRECAUCIÓN: El ácido perclórico es altamente corrosivo, puede actuar como un oxidante y / o provocar un riesgo de explosión. Consultar la ficha de seguridad de productos para el manejo y almacenamiento apropiado.
  5. Al día siguiente, quitar los tapones de goma de la manga. recuperar cuidadosamente cada tubo sin tapón 2 ml con unas pinzas y se lava la parte inferior del tubo en la parte superior del vial abierto con 1 ml de cóctel de centelleo para recuperar todo el hidróxido de hiamina. Desechar el tubo sin tapón en un contenedor de residuos radiactivos debidamente etiquetado.
  6. Añadir un cóctel de centelleo 9 ml por vial adicional. Añadir 0,5 ml de tampón de perfusión directamente a dos viales llenos con 10 ml de cóctel de centelleo líquido para la determinación de la actividad específica. Agitar vigorosamente los viales con la mano y esperar por lo menos 6 horas para permitir que las burbujas de aire se disipe antes de la medición en un contador de centelleo líquido configurado de forma adecuada para los experimentos de marcado doble.
    NOTA: Usar frascos de vidrio transparente para visualizar el NEedle al perforar los tapones de goma de la manga. No deje caer el ácido perclórico en el hidróxido de hiamina ya que esto va a arruinar la reacción. La adición de los comunicados de ácido perclórico al 14 CO 2 a partir del efluente coronario en el aire. A pesar de que los viales se deben encerrar y todo el 14 de CO 2 deben quedar atrapadas en el hiamina de hidróxido, se recomienda realizar este ensayo bajo la campana química.

7. Determinación de miocardio oleato de oxidación tarifas

NOTA: El método se basa en la separación cuantitativa y recuperación de 3 H 2 O del efluente coronario usando una resina de intercambio aniónico fuerte. A diferencia de la recuperación de 14 CO 2, no hay problema de estabilidad de la muestra y el efluente coronario se puede mantener en hielo o se almacena en el congelador antes de realizar el ensayo.

  1. Preparar columnas de resina de intercambio de aniones (una columna por ejemplo t +wo columnas adicionales para la determinación de la actividad de fondo) llenando la punta de los tubos de jeringas de 3 ml con lana de vidrio. Añadir la suspensión de resina / agua con una pipeta de transferencia hasta que la resina alcanza la marca de 2 ml en el tubo de la jeringa.
  2. Lavar la resina haciendo pasar 2 ml de agua ultrapura a través de la columna. Repita este paso dos veces más.
  3. Coloque viales de centelleo abiertas en las columnas y la carga de 0,5 ml del efluente coronario por columna. Cargar 0,5 ml de tampón de perfusión para la determinación de la actividad de fondo.
  4. Se lavan las columnas sucesivamente con 0,5, 1 y 2 ml de agua ultrapura. Una vez que se realiza la elución, desechar las columnas en un contenedor de residuos radiactivos debidamente etiquetado.
  5. Añadir cóctel de centelleo de 13 ml de líquido por vial de centelleo. Añadir 0,5 ml de tampón de perfusión directamente a dos viales llenos con 13 ml de cóctel de centelleo líquido para la determinación de la actividad específica. Agitar vigorosamente los viales y esperar al menos 6 horas antes de medir en un líquido de cienciacontador ntillation valor apropiado para experimentos de marcado doble.

8. Cálculos

  1. Si no lo ha hecho, determinar el peso húmedo de todo el corazón perfundido.
    NOTA: No permita que el tejido congelado se descongele si los análisis moleculares y bioquímicos se van a realizar posteriormente en el tejido restante.
  2. Determinar el peso húmedo de una muestra de tejido del conjunto perfuse-corazón (utilice aproximadamente 15 a 30% de todo el corazón). Colocar la muestra de tejido en un horno a 50 ° C durante la noche y medir su peso en seco. Utilice la proporción peso húmedo / peso seco de la muestra de tejido para determinar el peso en seco de todo el corazón en gramos (g de peso seco.).
  3. Para cada punto de tiempo x expresar el valor de flujo coronario CF x en ml / min.
  4. Determinación de la tasa de oxidación de la glucosa
    1. Se promedian los dos desintegración / min (dpm) los valores medidos para la actividad de fondo de 14 C a DETERMIne el factor de corrección 14C dpm ba.
    2. Determinar el promedio de 14C valor de actividad específica 14C dpm sa.
    3. Determinar la radiactividad específica de la glucosa en dpm / mol (F Glu) mediante la aplicación de la fórmula
      figure-protocol-1
      NOTA: Cuando n Glu (mol) = C Glu (mol / L) * volumen de la muestra (L) = 2,5 cuando se utiliza la glucosa a 5 mmol / L y una muestra de 0,5 ml.
    4. Determinar, para cada punto de tiempo x la velocidad de producción de 14 CO 2 en dpm / min (A) mediante la aplicación de la fórmula
      figure-protocol-2
      NOTA: En caso Vol x (ml) = 0,5
    5. Una brecha entre el valor determinado del peso del corazón seco para obtener la tasa normalizada de producción de 14 CO 2 (una norma ) en dpm / min por peso seco g.
    6. Aplicar la fórmula GO = A Norma / F Glu para obtener la velocidad de oxidación de la glucosa (GO) en mol de glucosa / min por g de peso seco.
  5. Determinación de la velocidad de oxidación de oleato
    1. La media de los valores de dos desintegración / min (dpm) medidos para la actividad de fondo de 3 H para determinar el factor de corrección 3H dpm ba.
    2. Determinar el promedio de 3H valor de actividad específica 3H dpm sa.
    3. Determinar la radiactividad específica de oleato en dpm / mol (F Ol e) mediante la aplicación de la fórmula
      figure-protocol-3
      NOTA: Cuando n Ole (mol) = C Ole (mol / L) * volumen de la muestra (L) = 0,2 cuando se utiliza oleato a 0,4 mmol / L y una muestra de 0,5 ml.
    4. Determinar para cada timpunto e x la velocidad de producción de 3 H 2 O en dpm / min (B) mediante la aplicación de la fórmula
      figure-protocol-4
      NOTA: En caso Vol x (ml) = 0,5
    5. Divide B por el valor determinado de peso del corazón seco para obtener la tasa normalizada de producción de H 2 O 3 (B Norma) en dpm / min por g de peso seco.
    6. Aplicar la fórmula OO = B Norma / F Ole para obtener la tasa de oxidación de oleato (OO) en mol de oleato / min por g de peso seco.

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Resultados

Dos experimentos representativos se describen en las siguientes figuras. En ambos casos, se aisló el corazón de un 16 semanas de edad macho Sprague Dawley de rata perfundido y en el modo de trabajo con tampón KH preparado de acuerdo con el protocolo anterior. En cada experimento, el corazón se sometió a una condición de estrés para afectar el trabajo cardíaco. la función contráctil cardiaca se evaluó por registro continuo de la presión de pulso a través de la inserción de un transductor ...

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Discusión

El protocolo anterior detalla los métodos para cuantificar simultáneamente el flujo de sustrato a través de la oxidación de la glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de trabajo. Las mediciones se pueden superponer a los parámetros funcionales cardíacos registrados, para determinar la relación entre el metabolismo de los sustratos y el trabajo cardíaco en condiciones basales y de estrés (cambio en la carga de trabajo, por isquemia-reperfusión, etc ...). También es posible evaluar c...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R00 HL112952 (a R. H.), R01 HL108618 (a J.P.G.), P01 HL051971 y P20 GM104357. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cloruro de sodio (NaCl)Fisher ScientificBP358
Cloruro de potasio (KCl)Fisher ScientificBP366
Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)Fisher ScientificP284
Sulfato de magnesio Heptahidrato (MgSO4*7H2O)Fisher ScientificM63
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)Fisher ScientificS233
Cloruro de calcio (CaCl2)Sigma-AldrichC5670
AG 1-X8 resina, forma de cloruro, tamaño de malla seca 100 - 200, 500 gBio-Rad1401441Este artículo se puede reemplazar comprando directamente la forma de óxido de hidrógeno  (ver referencia más abajo), pero esto costará casi 8 veces más
resina AG 1-X8, forma de hidróxido, tamaño de malla seca de 100 a 200, 100 gde 1432445 Bio-RadLa compra de este artículo permite evitar la conversión de la resina de intercambio aniónico de la forma de cloruro a la forma de hidróxido (ver sección 1.2 del protocolo)
Microanálisis de vidrio Portafiltros al vacíoFisher Scientific09-753-2
Hidróxido de sodio (NaOH)Fisher ScientificS318Corrosivo. Consulte la MSDS del producto para conocer su manejo y almacenamiento adecuados.
Tubo de dispersión de gas con cilindro fritadoFisher Scientific11-138B
Probumin Albúmina sérica bovina sin ácidos grasos, polvoEMD Millipore820027Recomendamos el uso de un BSA desgrasado con carbón, ya que otros procesos de purificación, como el fraccionamiento de etanol en frío, pueden dejar residuos tóxicos para el corazón.
Oleato de sodioSigma-AldrichO7501
Ácido oleico, [9,10-3H(N)]-PerkinElmerNET289005MCMaterial radiactivo. Siga las pautas de la oficina de seguridad radiológica de su institución para realizar pedidos y manipularlos.
Tubo de membrana de diálisis, 29 mm de diámetroFisher Scientific08-667E
D-(+)-GlucosaSigma-AldrichG7021
Glucosa, D-[14C(U)]-PerkinElmerNEC042B005MCMaterial radiactivo. Siga las pautas de la oficina de seguridad radiológica de su institución para realizar pedidos y manipularlos.
Humulin R U-100Eli Lilly and CompanyNDC 0002-8215-01 (HI-210)
Inactin HydrateSigma-AldrichT133Sustancia controlada en USDEA Schedule III
3-0 Silk Black BraidRoboz SurgicalSUT-15-3
10x Hyamine HydroxidePerkinElmer6003005Altamente tóxico y causa quemaduras graves. Consulte la hoja de datos de seguridad del producto para un manejo y almacenamiento adecuados Viales
centelleo de vidrio de 20 mlFisher Scientific03-341-25EUtilice viales de vidrio para la recuperación cuantitativa de 14CO2
20 ml Viales de centelleo de HDPEFisher Scientific03-337-23BUtilice viales de HDPE para la recuperación cuantitativa de 3H2O
Red Tapones de gomaFisher Scientific14-126DDFit viales de centelleo de 20 mL; Aguja BD
PrecisionGlide reutilizable 23G x 40 mmBD305194Úselo para inyectar ácido perclórico a través del tapón de goma de la trampa de CO2
Ácido perclórico, 60%Fisher ScientificA228Altamente corrosivo y puede actuar como oxidante y/o causar un peligro de explosión. Consulte la ficha de seguridad del producto MSDS para un manejo y almacenamiento adecuados
Ultima Gold, Scintillation CocktailPerkinElmer6013327
Lana de vidrioFisher ScientificAC38606
Decon Dri-Clean Detergente en polvoFisher Scientific04-355Para la limpieza de cristalería, piezas de plástico y tubos
Alconox Tergazyme Detergente con energía enzimáticaFisher Scientific16-000-115Para la limpieza de superficies de "difícil acceso" (tubos, cristalería) contaminadas por residuos de ácidos grasos-BSA
de

Referencias

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