El siguiente protocolo describe la preparación y utilización de tampones para la medición cuantitativa de las tasas de oxidación de glucosa y ácidos grasos en el corazón de rata en funcionamiento aislado. También se discuten los métodos utilizados para el análisis de muestras y la interpretación de datos.
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Artículo de método
Los métodos para la determinación de las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de Trabajo
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Resumen
Resumen
El corazón de los mamíferos es un gran consumidor de ATP y requiere un suministro constante de sustratos de energía para la contracción. No es sorprendente, alteraciones del metabolismo del miocardio se han relacionado con el desarrollo de la disfunción contráctil y la insuficiencia cardíaca. Por lo tanto, desentrañar la relación entre el metabolismo y la contracción debe arrojar luz sobre algunos de los mecanismos que regulan la adaptación cardiaca o mala adaptación en estados de enfermedad. La preparación de corazón de rata aislado de trabajo se puede utilizar para seguir, de forma simultánea y en tiempo real, la función contráctil cardiaca y el flujo de la energía proporcionando sustratos en las vías metabólicas oxidativas. El presente protocolo tiene como objetivo proporcionar una descripción detallada de los métodos utilizados en la preparación y la utilización de tampones para la medición cuantitativa de las tasas de oxidación de glucosa y los ácidos grasos, la energía principal que proporciona sustratos del corazón. También se discuten los métodos utilizados para el análisis de muestras y la interpretación de datos.En resumen, la técnica se basa en el suministro de 14 C-glucosa marcada radiactivamente y un ácido graso de cadena larga radiomarcado 3 H- a un corazón latiendo a través de la perfusión ex vivo cristaloides normotérmica. 14 CO 2 y 3 H 2 O, subproductos finales de las reacciones enzimáticas implicadas en la utilización de estos sustratos de energía que proporciona, a continuación, se recuperaron cuantitativamente a partir del efluente coronario. Con el conocimiento de la actividad específica de los sustratos radiomarcados usados, es entonces posible cuantificar de forma individual el flujo de glucosa y ácidos grasos en las vías de oxidación. la función contráctil del corazón aislado se puede determinar en paralelo con el equipo de grabación apropiada y directamente correlacionado con los valores de flujo metabólico. La técnica es muy útil para estudiar la relación metabolismo / contracción en respuesta a diversas condiciones de estrés, tales como alteraciones en pre y después de la carga y de la isquemia, un fármaco o una Circulafactor de ting, o después de la alteración en la expresión de un producto génico.
Introducción
Relevancia clínica
En el corazón de los mamíferos, hay una fuerte relación positiva entre el flujo de sustratos a través de las vías metabólicas oxidativas, la generación de ATP y el trabajo cardíaco 1. Durante las últimas dos décadas, la investigación de la intrincada relación entre el metabolismo y la función cardíaca se ha llevado a reconocer que las alteraciones en el metabolismo cardíaco son una causa para la disfunción contráctil y remodelación estructural posiblemente patológica en la fijación de diferentes tipos de enfermedades del corazón 2-4. por lo tanto, se espera que nuestra comprensión de los mecanismos....
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Protocolo
NOTA: Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con la Política de Servicio de Salud Pública de los NIH sobre el Cuidado Humano y Uso de Animales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Mississippi Medical Center. Todos los procedimientos que implican el uso de radioisótopos se aprobaron y se realizaron de acuerdo con las directrices establecidas por la oficina de la seguridad radiológica de la Universidad de Mississippi Medical Center.
1. Preparación de soluciones de estabilización y Reactivos
- Krebs-Henseleit (KH) Soluciones para la reserva de estabi....
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Resultados
Dos experimentos representativos se describen en las siguientes figuras. En ambos casos, se aisló el corazón de un 16 semanas de edad macho Sprague Dawley de rata perfundido y en el modo de trabajo con tampón KH preparado de acuerdo con el protocolo anterior. En cada experimento, el corazón se sometió a una condición de estrés para afectar el trabajo cardíaco. la función contráctil cardiaca se evaluó por registro continuo de la presión de pulso a través de la inserción de un transductor .......
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Discusión
El protocolo anterior detalla los métodos para cuantificar simultáneamente el flujo de sustrato a través de la oxidación de la glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de trabajo. Las mediciones se pueden superponer a los parámetros funcionales cardíacos registrados, para determinar la relación entre el metabolismo de los sustratos y el trabajo cardíaco en condiciones basales y de estrés (cambio en la carga de trabajo, por isquemia-reperfusión, etc ...). También es posible evaluar c.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R00 HL112952 (a R. H.), R01 HL108618 (a J.P.G.), P01 HL051971 y P20 GM104357. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cloruro de sodio (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Cloruro de potasio (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Sulfato de magnesio Heptahidrato (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Bicarbonato de sodio (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Cloruro de calcio (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resina, forma de cloruro, tamaño de malla seca 100 - 200, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | Este artículo se puede reemplazar comprando directamente la forma de óxido de hidrógeno (ver referencia más abajo), pero esto costará casi 8 veces más |
| resina AG 1-X8, forma de hidróxido, tamaño de malla seca de 100 a 200, 100 g | de 1432445 Bio-Rad | La compra de este artículo permite evitar la conversión de la resina de intercambio aniónico de la forma de cloruro a la forma de hidróxido (ver sección 1.2 del protocolo) | |
| Microanálisis de vidrio Portafiltros al vacío | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Hidróxido de sodio (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosivo. Consulte la MSDS del producto para conocer su manejo y almacenamiento adecuados. |
| Tubo de dispersión de gas con cilindro fritado | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Albúmina sérica bovina sin ácidos grasos, polvo | EMD Millipore | 820027 | Recomendamos el uso de un BSA desgrasado con carbón, ya que otros procesos de purificación, como el fraccionamiento de etanol en frío, pueden dejar residuos tóxicos para el corazón. |
| Oleato de sodio | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Ácido oleico, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Material radiactivo. Siga las pautas de la oficina de seguridad radiológica de su institución para realizar pedidos y manipularlos. |
| Tubo de membrana de diálisis, 29 mm de diámetro | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucosa | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucosa, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Material radiactivo. Siga las pautas de la oficina de seguridad radiológica de su institución para realizar pedidos y manipularlos. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Sustancia controlada en USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10x Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Altamente tóxico y causa quemaduras graves. Consulte la hoja de datos de seguridad del producto para un manejo y almacenamiento adecuados Viales |
| centelleo de vidrio de 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25E | Utilice viales de vidrio para la recuperación cuantitativa de 14CO2 |
| 20 ml Viales de centelleo de HDPE | Fisher Scientific | 03-337-23B | Utilice viales de HDPE para la recuperación cuantitativa de 3H2O |
| Red Tapones de goma | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit viales de centelleo de 20 mL; Aguja BD |
| PrecisionGlide reutilizable 23G x 40 mm | BD | 305194 | Úselo para inyectar ácido perclórico a través del tapón de goma de la trampa de CO2 |
| Ácido perclórico, 60% | Fisher Scientific | A228 | Altamente corrosivo y puede actuar como oxidante y/o causar un peligro de explosión. Consulte la ficha de seguridad del producto MSDS para un manejo y almacenamiento adecuados |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Lana de vidrio | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergente en polvo | Fisher Scientific | 04-355 | Para la limpieza de cristalería, piezas de plástico y tubos |
| Alconox Tergazyme Detergente con energía enzimática | Fisher Scientific | 16-000-115 | Para la limpieza de superficies de "difícil acceso" (tubos, cristalería) contaminadas por residuos de ácidos grasos-BSA |
Referencias
- Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
- Sen, S., et al. Glucose regulation of load-induced mTOR signalin....
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Reimpresiones y permisos
