Un método no invasivo y técnicamente no intensivos para la inducción y Fenotipificación Experimental de neumonía bacteriana en ratones

Summary

Varios métodos han sido descritos en la literatura para el modelado de la neumonía bacteriana en ratones. En este documento, se describe un método no invasivo, de bajo costo, rápida para inducir neumonía a través de aspiración (es decir, inhalación) de un inóculo bacteriano pipeteó en la orofaringe. métodos aguas abajo para la evaluación de la respuesta inmune innata pulmonar también se detallan.

Abstract

Aunque la neumonía adquirida en la comunidad sigue siendo un problema importante de salud pública, los modelos murinos de neumonía bacteriana han facilitado recientemente importantes avances preclínicos en nuestra comprensión de la patogénesis molecular y celular subyacente. En vivo modelos de ratón capturan la fisiología integrada y capacidad de recuperación de la respuesta de defensa del huésped en de una manera no reveló por enfoques alternativos, simplificados ex vivo. Varios métodos han sido descritos en la literatura para la inoculación intrapulmonar de bacterias en ratones, incluyendo la aerosolización, la administración intranasal, la canulación endotraqueal peroral en condiciones "ciego" y visualizados, y la canulación endotraqueal transcutánea. Todos los métodos tienen ventajas relativas y limitaciones. En este documento, se describe en detalle un método no invasivo, técnicamente no intensiva, barato y rápido para la entrega intratraqueal de bacterias que consiste en la aspiración (es decir, inhalación) por el ratónde un inóculo infeccioso pipeteó en la orofaringe, mientras que bajo anestesia general. Este método se puede utilizar para la administración pulmonar de una amplia variedad de agentes biológicos y químicos no cáusticos, y es relativamente fácil de aprender, incluso para los laboratorios con experiencia previa mínima con procedimientos pulmonares. Además de describir el método de la neumonía por aspiración, también ofrecemos procedimientos paso a paso para ensayar la posterior in vivo la respuesta inmune innata pulmonar del ratón, en particular, los métodos para cuantificar la eliminación de bacterias y la respuesta inmune celular de las vías respiratorias infectadas. Este enfoque integrado y sencillo de evaluación neumonía permite la evaluación rápida y robusta de los efectos de las manipulaciones genéticas y ambientales en la inmunidad innata pulmonar.

Introduction

Neumonía adquirida en la comunidad sigue siendo la causa principal de muerte por infección en los EE.UU., con poco cambio en las tasas de mortalidad en los últimos 40 años a pesar de las mejoras en la vacunación y estrategias de antibióticos ^1,2. A pesar de la falta de progresos importantes en el ámbito de la salud pública, en los últimos años dramáticos avances se han hecho en nuestra comprensión de la patogénesis molecular y celular de la neumonía, con muchos de estos avances hechos posibles por el uso de modelos de ratón de infección pulmonar. La trazabilidad genética del ratón, la similitud de la murina y el sistema inmunológico humano, y la gran varie....

Protocol

Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con la Ley de Bienestar Animal y la Política de Servicio de Salud Pública de Estados Unidos sobre la Integridad Personal Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio después de la revisión por el Cuidado de Animales y el empleo del NIEHS.

1. Preparación de K. pneumoniae Cultura

Precaución: Realizar todos los pasos del 2 campana (BSL2) nivel de bioseguridad u otra área designada BSL2 y desechar los residuos según las pautas BSL2 instituto.

1. Para el crecimiento suspensión de K. pneumoniae, descongelar un stock de glicerol de bacteri....

Results

C57BL / 6 ratones fueron infectados con 2000 UFC de K. pneumoniae 43816 (serotipo 2) a través de la aspiración orofaríngea en los pulmones. A esta dosis, los ratones normalmente comienzan a mostrar síntomas clínicos 12-24 horas después de la infección, incluyendo letargo, pelo erizado, y la pérdida de peso del 5-10% (Figura 2). Dentro de 48-72 horas después de la infección, muchos de los ratones muestran síntomas de la enfermedad y la morbilidad que por lo gener.......

Discussion

Los modelos murinos de neumonía bacteriana, se asociaron con la orientación de genes y en las intervenciones biológicas y farmacológicas in vivo, han proporcionado una perspectiva crítica en la respuesta de defensa del huésped pulmonar. Grandes avances se han hecho en particular en nuestra comprensión de las quimiocinas y moléculas de adhesión que rigen el reclutamiento de neutrófilos al espacio aéreo infectada ^10,11. En modelos in vivo de neumonía, a diferencia de los enfo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klebsiella pneumoniae, serotipo 2	ATCC	43816
Caldo de soja tríptico	Becton Dickenson	211825
Excel Catéteres intravenosos Safelet, 18 G x 1 1/4"	Claflin Equipo Médico	MEDC-031122
Hema 3 Solución 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 Solución 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 Fijador	Fisher	23-122-929
27½ jeringas de tuberculina de calibre	Fisher	14-826-87
Colectores de plasma de heparina de litio	Fisher	2675187
esparcidores desechables en forma de L	Lab Scientific	DSC
1x PBS, pH 7.4	preparado internamente	n/a	Agua destilada (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5,75 g), KH2PO4 (1 g)
Tampón de lisis ACK	preparado internamente	n/a	NH4Cl (4,145 g), KHCO3 (0,5 g), EDTA (18,6 mg), llevar hasta 500 ml con agua destilada y pH a 7,4