Este manuscrito describe un protocolo detallado para inducir la regeneración del músculo esquelético aguda en ratones adultos y posteriores manipulaciones de los músculos, tales como disección, congelación, corte, tinción de rutina, y miofibras análisis del área de la sección transversal.
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Artículo de método
La inducción de la regeneración muscular esquelético aguda por inyección Cardiotoxin
En este artículo
Resumen
Resumen
la regeneración del músculo esquelético es un proceso fisiológico que se produce en los músculos esqueléticos adultos en respuesta a una lesión o enfermedad. la regeneración del músculo esquelético inducida por la lesión aguda es un sistema poderoso modelo ampliamente utilizado para estudiar los eventos involucrados en la regeneración muscular, así como los mecanismos y diferentes jugadores. De hecho, un conocimiento detallado de este proceso es esencial para una mejor comprensión de las condiciones patológicas que conducen a la degeneración del músculo esquelético, y que ayuda en la identificación de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas. El presente trabajo describe un protocolo detallado y reproducible para inducir la regeneración del músculo esquelético aguda en ratones a través de una única inyección intramuscular de cardiotoxina (CTX). CTX pertenece a la familia de toxinas de veneno de serpiente y causa miólisis de miofibras, que finalmente desencadena los eventos de regeneración. La dinámica de la regeneración del músculo esquelético es evaluado por el análisis histológico de secciones de músculo. El protocolo tambiénilustra los procedimientos experimentales para la disección, la congelación, y cortar el músculo tibial anterior, así como la tinción con hematoxilina y eosina de rutina que se utiliza ampliamente para el análisis morfológico y morfométrico posterior.
Introducción
músculos esqueléticos adultos de mamíferos están formados por grupos de fascículos de las células musculares multinucleadas (miofibras) que se especializan para la contracción. Cada miofibrilar es un sincitio alargada, rodeada por el sarcolema (membrana plasmática) y miofibrillas que contienen, que se compone de proteínas contráctiles organizadas regular y repetidamente (actina y miosina filamentos). En la vida adulta y en condiciones de reposo, los músculos esqueléticos tienen una muy baja rotación de su mionúcleos 1; de hecho, los mionúcleos, que se encuentran en la periferia de la miofibras, bajo el sarcolema, son detenidas en la fase G0 del ciclo celul....
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Protocolo
Todos los experimentos se llevaron a cabo en estricta conformidad con las directrices institucionales para la investigación con animales y aprobados por el Departamento de Salud Pública, Sanidad Animal, Nutrición y Seguridad del Ministerio de Salud de Italia Alimentación, de acuerdo con la ley en la experimentación animal. procedimientos dislocación cervical pueden variar de una institución a otra basada en IACUC o sus requisitos equivalentes.
1. Inyección Cardiotoxin en el músculo tibial anterior
- Preparar una solución de 10 mM de cardiotoxina (CTX) de trabajo diluyendo la solución cardiotoxina de valores en tamponada con fosfato estéril salino (PB....
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Resultados
H & E tinción permite la evaluación de la morfología del proceso de regeneración en los puntos de tiempo específicos durante la regeneración del músculo esquelético. La figura 3 muestra el tiempo de análisis se realiza en los músculos TA heridas de los ratones de tipo salvaje. Los músculos se han aislado a los 3, 7, 15, y 30 días después de la inyección CTX, como se esquematiza en la Figura 3A. Imágenes representativas de secciones transversales teñi.......
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Discusión
A continuación, se describe un protocolo para inducir una lesión aguda en el músculo esquelético (es decir, la inyección intramuscular de CTX). Es ampliamente utilizado como una herramienta poderosa para estudiar la dinámica de la regeneración del músculo esquelético in vivo. Inyección CTX induce la degeneración de las fibras musculares, que es causada por la despolarización de la sarcolema y la contracción de las fibras 12, y desencadena la cascada de eventos que conduce a la regeneración m.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a la Casa de Animales y a las Instalaciones de Microscopía Integrada del IGB-CNR. Este trabajo se ha beneficiado de la financiación de la investigación del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea en el proyecto ENDOSTEM (Activación de células madre asociadas a la vasculatura y células madre musculares para la reparación y el mantenimiento del tejido muscular, acuerdo de subvención número 241440), el Ministerio de Educación-Universidad-Investigación italiano (MIUR-PRIN2 010-2011) a G.M. y S.B. y PON Cluster IRMI a G.M., y la fundación CARIPLO a G.M. y S.B.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cardiotoxina de Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Jeringa para insulina BD Micro-Fine+ Aguja 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL | BD | 324826 | |
| Goma de Tragacanto | MP BIOMEDICALS,LLC | ||
| 104792 2-Metilbutano (Isopentano) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solución para la inclusión Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Hoja de micrótomo de plumas S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Corredera de vidrio Superfrost Plus | Menzel-Glä ser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Pinzas con acabado de espejo | 2INSTRUMENTOS BIOLÓGICOS | 11251-23 | |
| Tijeras rectas afiladas/afiladas | 2INSTRUMENTOS BIOLÓGICOS | 15024-10 | |
| Tijeras Noyes | Rectas 2INSTRUMENTOS BIOLÓGICOS | 15012-12 | |
| Tijeras de iris finas rectas afiladas/afiladas 10,5 cm | 2INSTRUMENTOS BIOLÓGICOS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| cubreobjetos portaobjetos | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xileno | SIGMA ALDRICH 214736 | ||
| Etanol 100% | Sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxilina | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Criostato | LEICA | CM3050 S |
Referencias
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).
- Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4 (2), 243-259 (201....
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Reimpresiones y permisos
