Aquí, describimos un enfoque fisiológico que permite la identificación y el análisis en profundidad de una población definida de neuronas sensoriales en cortes agudos de tejido coronal del órgano vomeronasal de ratón utilizando registros de patch-clamp de células completas.
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Artículo de método
Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido Rebanadas del ratón órgano vomeronasal
En este artículo
Resumen
Resumen
En la mayoría de los mamíferos, el órgano vomeronasal (VNO) es una estructura quimiosensorial que detecta señales sociales tanto hetero como conespecíficas. Las neuronas sensoriales vomeronasales (VSN) expresan un tipo específico de receptor acoplado a proteína G (GPCR) de al menos tres familias diferentes de genes quimiorreceptores, lo que permite la detección sensible y específica de señales quimiosensoriales. Estas familias comprenden las familias de genes V1r y V2r, así como la familia de genes de quimiorreceptores putativos relacionados con el receptor de péptido de formilo (FPR) (Fpr-rs). Con el fin de comprender la fisiología de las interacciones receptor-ligando vomeronasal y la señalización posterior, es esencial identificar las propiedades biofísicas inherentes a cada clase específica de VSN.
El enfoque fisiológico descrito aquí permite la identificación y el análisis en profundidad de una población definida de neuronas sensoriales utilizando una línea de ratón transgénico (Fpr-rs3-i-Venus). El uso de este protocolo, sin embargo, no se limita a esta línea específica y, por lo tanto, puede extenderse fácilmente a otras líneas modificadas genéticamente o animales de tipo salvaje.
Introducción
La mayoría de los animales dependen en gran medida de sus sentidos químicos para interactuar con su entorno. El sentido del olfato juega un papel esencial para la búsqueda y evaluación de los alimentos, evitar a los depredadores y la localización de los socios de acoplamiento adecuados. En la mayoría de los mamíferos, el sistema olfativo consiste en al menos cuatro subsistemas anatómicamente y funcionalmente distintos periféricos: el epitelio olfativo principal 1,2, el ganglio Grueneberg 3,4, el órgano septal de Masera 5,6 y el órgano vomeronasal. El VNO comprende la estructura sensorial periférica del sistema olfativo accesorio (AOS)....
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales estaban en conformidad con la legislación local y de la Unión Europea sobre la protección de los animales utilizados con fines experimentales (Directiva 86/609 / CEE) y con las recomendaciones formuladas por la Federación de Asociaciones Europeas de Laboratorio de Ciencia Animal (FELASA). Ambos ratones C57BL / 6 y ratones Fpr-RS3-i-Venus fueron alojados en grupos de ambos sexos a temperatura ambiente en un 12 horas de luz / oscuridad ciclo con comida y agua ad libitum. Para los experimentos se utilizaron los adultos jóvenes (6-20 semanas) de ambos sexos. No se observaron diferencias obvias dependiente de género.
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Resultados
Para conocer las propiedades biofísicas y fisiológicas de las poblaciones de células definidas, realizamos cortes de tejido coronal agudas del ratón VNO (Figura 1 - 2). Después de la disección, rebanadas se pueden mantener en solución extracelular oxigenada enfriada con hielo (S 2) para varios hr. En la configuración de la grabación, un intercambio constante con solución oxigenada (Figura 2D) asegura la viabilidad del tejido d.......
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Discusión
El VNO es una estructura chemosensory que detecta semioquímicos. Hasta la fecha, la mayoría de los receptores vomeronasal queda por deorphanized tan sólo se han identificado algunos pares receptor-ligando. Entre ellos, V1rb2 fue descrito para ser activado específicamente por la feromona urinaria 2-heptanona macho 30, V2rp5 para ser activado por el macho ESP1 feromona específica 57, así como V2r1b y V2rf2 a ser activados por los péptidos MHC SYFPEITHI 48 y SEIDLILGY 58, respect.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Ivan Rodriguez y Benoit von der Weid por generar la línea de ratones FPR-rs3-i-venus, sus críticas constructivas y sus fructíferas discusiones. Este trabajo fue financiado por subvenciones de la Fundación Volkswagen (I/83533), la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) y por la Iniciativa de Excelencia de los gobiernos federal y estatal alemán. MS es profesor Lichtenberg de la Fundación Volkswagen.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Químicos | |||
| Agarosa (baja temperatura de gelificación) | PeqLab | 35-2030 | |
| ATP (Mg-ATP) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Ácido Bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES) | Sigma-Aldrich | B9879 | |
| Cloruro de calcio | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Glucosa | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| GTP (Na-GTP) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| (2-hidroxietil)-1-piperazineetanoácido sulfónico (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Cloruro de magnesio | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Cloruro de potasio | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Hidróxido de potasio | Sigma-Aldrich | 03564 | |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hidrogenocarbonato de sodio | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Hidróxido de sodio | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Name | Company | >Número de catálogo | >strong<>Comments |
| Herramientas quirúrgicas y consumibles | |||
| Placa de Petri grande, | VWR | , disección de la cápsula de VNO | |
| Placa de Petri pequeña, | VWR | para disección de VNO, placa para incrustar en agarosa | |
| Tijera quirúrgica grande y afilada | Fine Science Tools | decapitación, extracción de la mandíbula inferior | |
| Tijeras de hueso fuertes | Fine Science Tools | incisivos de corte | |
| Pinzas medianas, pinzas Dumont #2 | Fine Science Tools | para quitar la piel y el paladar | |
| Tijeras de resorte Micro, 8,5 cm, curvas, hojas de 7 mm | Herramientas de Fine Science recortando | VNO | |
| Dos pares de pinzas finas, pinzas Dumont #5 | Fine Science Tools | diseccionando VNO de una cápsula cartilaginosa | |
| Pequeña espátula de acero inoxidable | Fine Science Tools | manejo de bloques de agarosa y rodajas de tejido | |
| Bisturí | cortando el bloque de agarosa en forma piramidal | ||
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| Equipment | |||
| Cubo de filtro, excitación: BP 450-490, supresión: LP 515 | Leica Microsystems | I3 | |
| Lámpara de fluorescencia | Leica Microsystems | EL6000 | |
| Agitador magnético de placa calefactora | Snijders | 34532 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Luigs & Neumann | SM-5 | ||
| Extractor de micropipetas, vertical de dos pasos | Narishige | PC-10 | |
| Microscopio | Leica Microsystems | CSM DM 6000 SP5 | |
| Eliminador de ruido 50/60 Hz (HumBug) | Quest Scientific | ||
| Objective | Osciloscopio Leica Microsystems | HCX APO L20x/1.00 W | |
| Osmómetro | Tektronik | TDS 1001B | |
| Gonotec | Osmomat 030 | ||
| Sistema de perfusión 8 en 1 | AutoMate Scientific | ||
| Medidor de pH cinco fácil | Mettler Toledo | ||
| Tarro de almacenamiento de pipetas | World Precision Instruments | e212 | |
| Cámara de registro | Luigs & Neumann | Slice mini cámara | |
| Cuchillas de afeitar | Wilkinson Sword GmbH | Wilkinson Sword Classic | |
| Cámara de almacenamiento de lonchas oxigenante; las cámaras comerciales alternativas son: p. ej., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) o la precámara (BSC-PC; Warner Instruments) | a medida | ||
| Leica Microsystems | S4E | ||
| Trigger interface | HEKA Elektronik | TIB-14 S | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT 1000 S | |
| Memmert | WNB 45 |
Referencias
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Fuss, S. H., Omura, M., Mombaerts, P.
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Reimpresiones y permisos
