Artículo de método

Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido Rebanadas del ratón órgano vomeronasal

DOI:

10.3791/54517

⸱

10 de septiembre de 2016

 ,  , 
1Department of Chemosensation, Institute for Biology II, RWTH Aachen University, 2Mill Hill Laboratory, The Francis Crick Institute

En este artículo

Resumen

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Aquí, describimos un enfoque fisiológico que permite la identificación y el análisis en profundidad de una población definida de neuronas sensoriales en cortes agudos de tejido coronal del órgano vomeronasal de ratón utilizando registros de patch-clamp de células completas.

Resumen

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En la mayoría de los mamíferos, el órgano vomeronasal (VNO) es una estructura quimiosensorial que detecta señales sociales tanto hetero como conespecíficas. Las neuronas sensoriales vomeronasales (VSN) expresan un tipo específico de receptor acoplado a proteína G (GPCR) de al menos tres familias diferentes de genes quimiorreceptores, lo que permite la detección sensible y específica de señales quimiosensoriales. Estas familias comprenden las familias de genes V1r y V2r, así como la familia de genes de quimiorreceptores putativos relacionados con el receptor de péptido de formilo (FPR) (Fpr-rs). Con el fin de comprender la fisiología de las interacciones receptor-ligando vomeronasal y la señalización posterior, es esencial identificar las propiedades biofísicas inherentes a cada clase específica de VSN.

El enfoque fisiológico descrito aquí permite la identificación y el análisis en profundidad de una población definida de neuronas sensoriales utilizando una línea de ratón transgénico (Fpr-rs3-i-Venus). El uso de este protocolo, sin embargo, no se limita a esta línea específica y, por lo tanto, puede extenderse fácilmente a otras líneas modificadas genéticamente o animales de tipo salvaje.

Introducción

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La mayoría de los animales dependen en gran medida de sus sentidos químicos para interactuar con su entorno. El sentido del olfato juega un papel esencial para la búsqueda y evaluación de los alimentos, evitar a los depredadores y la localización de los socios de acoplamiento adecuados. En la mayoría de los mamíferos, el sistema olfativo consiste en al menos cuatro subsistemas anatómicamente y funcionalmente distintos periféricos: el epitelio olfativo principal 1,2, el ganglio Grueneberg 3,4, el órgano septal de Masera 5,6 y el órgano vomeronasal. El VNO comprende la estructura sensorial periférica del sistema olfativo accesorio (AOS), que desempeña un papel importante en la detección de señales químicas que transmiten información acerca de la identidad, el género, el rango social y el estado sexual 7-10. El VNO está situado en la base del tabique nasal derecha por encima del paladar. En los ratones, es un tubo ciego bilateral fin encerrados en una cápsula cartilaginosa 11-13. El órgano se compone tanto de un epithe sensorial medial forma de media lunaLium que alberga los VSNS y de una parte no sensorial en el lado lateral. Entre ambos epitelios se encuentra un lumen lleno de moco que está conectado a la cavidad nasal a través de la estrecha conducto vomeronasal 14. Un vaso sanguíneo lateral grande en el tejido no sensorial proporciona un mecanismo de bombeo vascular para facilitar la entrada de moléculas relativamente grandes, en su mayoría no volátiles tales como péptidos o proteínas pequeñas en el lumen VNO a través de presión negativa 15,16. Los componentes estructurales del VNO están presentes en el nacimiento y el órgano alcanza el tamaño adulto poco antes de la pubertad 17. Sin embargo, si la AOS roedores ya es funcional en los menores sigue siendo objeto de debate 18-20.

VSNS se distinguen tanto por su ubicación epitelial y el tipo de receptor que expresan. VSNS muestran una morfología bipolar con un axón sin mielina y una sola dendrita apical que sobresale hacia el lumen y termina en una perilla dendríticas microvellosidades. VSN hachaons fasciculada para formar el nervio vomeronasal que sale de la cápsula cartilaginosa en el extremo dorso-caudal, asciende a lo largo del tabique, pasa la lámina cribosa y proyectos para el bulbo olfatorio accesorio (AOB) 21,22. El epitelio sensorial vomeronasal se compone de dos capas: la capa apical se encuentra más cerca del lado luminal y puertos tanto V1R- y todos menos un tipo de FPR-RS-expresando neuronas. Estas neuronas coexpresan los G αi2 G-proteína α-subunidad y proyecto a la parte anterior de la AOB 23-25. Las neuronas sensoriales situados en la capa basal más V2Rs expresas o FPR-RS1 junto G αo y envían sus axones a la región posterior de la AOB 26-28.

Vomeronasal neuronas son activadas por probable más bien pequeñas semioquímicos 29-33 (V1Rs) o compuestos proteicos 34-38 (V2Rs) que son secretadas en diversos fluidos corporales, tales como orina, saliva y fluido desgarran 37,39-41 . En experimentos in situ han demostrado que VSNS también se activan mediante péptidos formilados y diversos compuestos antimicrobianos / inflamación ligada 25,42. Por otra parte, expresaron de forma heteróloga FPR-rs proteínas comparten con agonistas espectros FPRs expresadas en el sistema inmunológico, lo que indica un papel potencial como detectores para la enfermedad de la misma especie o fuentes de alimentos en mal estado 25 (véase la referencia 43).

Es fundamental para la comprensión de las relaciones de receptor-ligando y cascadas de señalización corriente abajo en poblaciones específicas de VSN es una evaluación detallada de sus características biofísicas básicas en un entorno nativo. En el pasado, el análisis de la señalización celular se ha beneficiado enormemente de animales modificados genéticamente que marcan una población definida de las neuronas por la coexpresión de una proteína marcadora fluorescente 30,44-49. En este protocolo, una línea de ratón transgénico que expresa FPR-RS3 junto con un marcador fluorescente (FPR-RS3-i-Venus) se utiliza.Este enfoque es un ejemplo de cómo emplear una cepa de ratones genéticamente modificado para realizar el análisis electrofisiológico de una población de células ópticamente identificable mediante sola neurona patch-clamp grabaciones en cortes de tejido coronal VNO agudas. Una presión de aire comprimido sistema de perfusión de varios cañones para los estímulos sensoriales y agentes farmacológicos permite la estimulación neuronal rápida, reversible y focal o la inhibición durante las grabaciones. grabaciones de células enteras en el tramo preparativos permiten un análisis detallado de las propiedades intrínsecas, conductancias activados por voltaje, así como patrones de descarga del potencial de acción en el entorno nativo de la célula.

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Protocolo

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Todos los procedimientos con animales estaban en conformidad con la legislación local y de la Unión Europea sobre la protección de los animales utilizados con fines experimentales (Directiva 86/609 / CEE) y con las recomendaciones formuladas por la Federación de Asociaciones Europeas de Laboratorio de Ciencia Animal (FELASA). Ambos ratones C57BL / 6 y ratones Fpr-RS3-i-Venus fueron alojados en grupos de ambos sexos a temperatura ambiente en un 12 horas de luz / oscuridad ciclo con comida y agua ad libitum. Para los experimentos se utilizaron los adultos jóvenes (6-20 semanas) de ambos sexos. No se observaron diferencias obvias dependiente de género.

1. Preparación de la solución

  1. Preparar extracelular solución S 1: 4- (2-hidroxi-etil) piperazina-1-etanosulfónico (HEPES) tamponada solución extracelular que contiene (en mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 HEPES; pH = 7,3 (ajustado con NaOH); osmolaridad = 300 mOsm (ajustado con glucosa).
  2. preparar extracellular solución S 2: oxigenada Carbogen (95% O 2, 5% de CO 2) solución extracelular que contiene (en mM) 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 5 KCl, 1 CaCl 2, 1 MgSO 4, 5 BES; pH = 7,3; osmolaridad = 300 mOsm (ajustado con glucosa).
  3. Preparar la solución de agarosa al 4% temperatura de gelificación baja (S 3) para la incrustación de tejidos: 4% de agarosa de baja temperatura de gelificación. Disolver 2 g de agarosa de baja gelificación en 50 ml de S 1 en una botella de vidrio de laboratorio 100 ml junto con un agitador magnético. Para fundir la agarosa, poner la botella en un baño de agua (con la tapa no herméticamente cerrado) a 70 ° C durante aproximadamente 20 min o hasta que la solución se vuelve transparente mientras se agita. Enfriar y mantener agarosa fundida en un segundo baño de agua a 42 ° C hasta su uso posterior.
  4. Preparar intracelular solución S 4: solución de la pipeta contenía (en mM) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0,3 CaCl 2 (libre de Ca 2 + = 110 nM), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7,1 (ajustado con KOH); osmolaridad = 290 mOsm.
  5. Modificar / ajustar la composición de S 1, S 2 y S 4 de acuerdo con el diseño experimental individual (por ejemplo, bloqueadores farmacológicos para aislar ciertos tipos de corrientes activados por voltaje).

2. Preparación del área de trabajo

  1. Llenar la oxigenación de la cámara de corte almacenar con S 2 al menos 30 min antes de la disección, el lugar en el hielo para el ajuste de la temperatura y el pH y la solución de compuesto oxigenado continuamente.
  2. Llenar el depósito de superfusión rebanada a la configuración de la grabación con S 2 y oxigenar continuamente.
  3. Antes de la disección, llenar vibratome cámara con S 2 y organizar hielo picado alrededor de la cámara. Como alternativa, transferir la solución oxigenada repuesto de hielo frío de la oxigenación de cámara en la cámara de vibratome y mantener la oxigenación de forma continua.
  4. Organizar las herramientas quirúrgicas y consumibles.
  5. Coloque paquete de gel de hielo bajo la disecciónmicroscopio, cubrir con una toalla de papel para evitar que el tejido VNO se congele al fondo del plato.
  6. hoja de afeitar limpia por aclarado brevemente en 70% de etanol y agua destilada y montar a vibratome. Reemplazar para cada sesión de rebanar.

3. VNO disección e incrustación

  1. El sacrificio de animales mediante una breve exposición a CO 2 y decapitar utilizando tijeras quirúrgicas agudas. Nota: Como el tiempo de sacrificar el animal de poner la cápsula VNO en hielo es crítica, minimizar el tiempo a menos de 2 min. Para mantener la viabilidad del tejido, incrustar tanto completamente disecado VNOs en agarosa en menos de 30 min.
  2. Retire la mandíbula inferior con grandes tijeras quirúrgicas. Entrar a través de la cavidad bucal y cortar los huesos y los músculos de la mandíbula cada lado por separado.
  3. Coloque la parte restante de la cabeza hacia abajo en la gran placa de Petri.
  4. Aparte la piel de la mandíbula superior y alrededor de la punta de la nariz con fórceps medio para obtener un mejor acceso a laincisivos.
  5. Use las tijeras para cortar hueso la mayor parte de los incisivos en un ángulo de 45 ° ~ en la dirección rostral (Figura 1A). Esto facilitará la eliminación de la cápsula VNO de la cavidad nasal.
    Nota: No corte a la raíz del diente para evitar daños en la punta de la cápsula VNO.
  6. Coge el paladar superior rígida en su parte rostral con fórceps medio y con cuidado la cáscara de nuevo en una sola pieza en un ángulo plano (Figura 1B).
    Nota: En repetidas ocasiones enjuague con helado de S 2.
  7. Con unas tijeras micro resorte para cortar la fusión ósea entre la punta del hueso vómer y la mandíbula. Inserte las puntas de las tijeras con la parte curva de la punta apuntando hacia fuera lejos del VNO y cuidadosamente cortar el hueso en pequeños pasos tanto de izquierda y lateral derecha de la cápsula VNO.
  8. Para quitar la cápsula VNO, utilizar tijeras micro resorte para cortar a través del hueso vómer en la parte caudal y levante con cuidado el hueso vómer fuera de la ncavidad ASAL utilizando pinzas medianas. Inmediatamente transferir el VNO a una pequeña placa de Petri con un microscopio estéreo en un paquete de gel de hielo donde se llevarán a cabo los pasos restantes de la disección.
  9. Enjuague el VNO en una pequeña cantidad de helado de S 2 para evitar que el tejido de la desecación.
  10. Se separan las cápsulas cartilaginosos que contienen los tejidos blandos VNO agarrando la parte posterior del hueso vómer con fórceps medianos. Coloque la cápsula para una vista dorsal de modo que una división entre ambas VNOs se hace visible (Figura 1D i).
  11. Use la punta de unas pinzas finas para separar tanto el cartílago cápsulas VNO de la espina central, manteniendo el hueso vómer inmovilizado en la parte trasera.
    Nota: El uso de fórceps sólo en el borde de la cápsula de cartílago y tener mucho cuidado de no perforar a través del cartílago como el epitelio sensorial delicada se daña fácilmente.
  12. Una vez que los dos están separados VNOs, empezar a eliminar el cartílago encapsular los abetost VNO.
  13. Agarrar el borde superior de la cápsula con una pinza fina y dividir distancia de la pared del cartílago conectado previamente al hueso vómer (cara medial).
  14. Para eliminar restante cartílago gire el VNO con su lado lateral curvada a la parte inferior del plato y de forma segura precisar el cartílago en un lado el uso de fórceps. Cuidadosamente mueva el segundo pinzas finas de la parte de atrás en un ángulo muy plano entre el cartílago y el VNO para aflojar la conexión entre el tejido y el cartílago.
  15. lentamente la cáscara del OVN del cartílago sosteniéndolo en su extremo caudal, para no dañar el epitelio sensorial.
  16. Una vez que el VNO se apalanca de la cápsula, asegúrese de eliminar todas las pequeñas piezas de cartílago que quedan como los trozos de cartílago se separe el tejido circundante de agarosa durante el proceso de corte.
  17. Colocar una pequeña gota de helado de S 2 en la primera VNO diseccionados para prevenir el daño tisular. Un vaso sanguíneo grande en el lado lateral Will se hace visible que indica que el órgano está intacta y no se groseramente dañado durante la disección (Figura 2A ii). En caso de que el vaso sanguíneo se daño, todavía valdrá la pena continuar con cortar el OVN, siempre y cuando la morfología general no se vio afectada claramente.
  18. Inmediatamente diseccionar el segundo VNO.
  19. Para incrustar el OVN, llenar los dos pequeñas placas de Petri hasta el borde de S derretida 3 (almacenado en baño de agua a 42 ° C; véase 1.3).
  20. Mantenga el VNO en el extremo caudal más amplio con unas pinzas finas para evitar daños en el epitelio sensorial.
  21. Sumergir el VNO en la agarosa y moverlo horizontalmente hacia atrás y adelante varias veces para eliminar la película de la solución extracelular, así como las burbujas de aire de su superficie.
  22. Coloque el VNO en posición vertical con la punta caudal hacia el fondo del plato. En lugar de pellizcar el OVN con las pinzas directamente, ajustar la orientación moviendo la punta fórceps en estrecha proximity al VNO.
    Nota: Orientación durante la incrustación es crucial ya que determina plano de corte y la accesibilidad a las neuronas sensoriales durante el experimento.
  23. Colocar platos en bolsa de hielo en gel de agarosa y espere hasta que se haya solidificado.
    Nota: No cambie la orientación VNO una vez que la agarosa ha comenzado la solidificación ya que esto separar el tejido circundante de la agarosa.

4. coronal del tejido VNO rebanar

  1. Use pequeña espátula para quitar el bloque de agarosa del plato pequeño en la tapa de una gran placa de Petri, darle la vuelta al revés de agarosa dejando la punta caudal del VNO hacia arriba.
  2. Cortar el bloque en forma de pirámide con un bisturí quirúrgico (3-4 mm en la punta, de 8-10 mm en la parte inferior). Tenga cuidado de no dañar el tejido embebido.
  3. Utilice pegamento para fijar el bloque en forma de pirámide al centro de la placa de muestras vibratome y esperar ~ 1 minuto para que el pegamento se seque por completo.
  4. La transferencia de la placa de la muestra a la corte en rodajas cHamber y preparar la segunda VNO, en consecuencia. Mantenga la placa con la segunda muestra a 4 ° C hasta su uso.
  5. Use un microtomo de cuchilla vibrante con los siguientes valores: espesor: 150-200 micras; velocidad: 3,5 au = 0,15 mm / seg; Frecuencia: 7.5 au = 75 Hz. Transferir las rebanadas a la cámara de oxigenación hasta su uso después de inspeccionar brevemente la morfología rebanada bajo el microscopio de disección. Las rebanadas se pueden mantener durante varias horas.

5. sola célula Registros electrofisiológicos

  1. Para las grabaciones, utilice un microscopio de fase fija en posición vertical equipado con objetivos de inmersión en agua, Dodt o infrarrojos diferencial de interferencia de contraste (IR-DIC), y epi-fluorescencia, así como una cámara CCD enfriada. Para la adquisición de datos, utilizar un amplificador de patch-clamp, etapa de la cabeza, AD tarjeta de interfaz / DA y un PC (incluyendo software de grabación).
  2. Preparar un balance de 10-20 pipetas de parche (4-7) mO. pipetas de extracción de capilares de vidrio borosilicato (1,50 mm de diámetro exterior / 0,86 mm de diámetro interior) USINga extractor de micropipeta y extinción de esmalte con un microforge.
    Nota: Fuego pulir las puntas de pipeta es crucial cuando los parches más pequeños VSNS. Esto ayudará a prevenir la ruptura de la membrana celular cuando se aplica presión negativa con el fin de obtener un sello de alta resistencia. Después de pulir la abertura de la pipeta debe ser aproximadamente 1 m.
  3. Mantenga pipetas en un frasco de almacenamiento pipeta para evitar daños y la acumulación de polvo hasta su uso.
  4. Preparar sistema de perfusión rellenando depósitos de solución y el tubo de acuerdo con el diseño experimental.
    Nota: Eliminar las burbujas de aire de la tubería por completo, ya que interferirán fuertemente con los registros electrofisiológicos.
  5. Ajustar la presión para lograr ~ 3 flujo ml / min.
    Nota: Las altas presiones causarán el movimiento de la lámina de tejido, así como la terminación de los registros electrofisiológicos.
  6. Transferir VNO rebanada de cámara de imágenes y fijar la posición de fragmento utilizando anclaje de acero inoxidable cableado con 0,1 mm de espesor synthetic fibras (Figura 2 B - C).
    Nota: No cubra la lámina de tejido con uno de los hilos de fibra sintética, sino más bien la agarosa que rodea la rebanada.
  7. Cámara de imágenes Transferencia de configuración de la grabación y la rebanada de forma continua superfuse con S oxigenada 2 a temperatura ambiente a través de una aplicación del baño.
  8. Ajuste el capilar de succión a la superficie de la solución para crear una succión lenta para el intercambio constante de solución del baño. Ajuste el 8-en-1 de varios cañones para "lápiz de perfusión" por encima y cerca de la parte no sensorial de la rebanada VNO que contiene el vaso sanguíneo (Figura 2C, 3A) 50. Será beneficioso para organizar lápiz de perfusión y la pipeta de grabación sea frente a la rebanada de direcciones opuestas.
  9. Conectar el electrodo de referencia y solución del baño usando un puente de agar en forma de L (lleno de KCl 150 mM).
  10. Llene la pipeta de parche con la solución de la pipeta S 4.
  11. Montar la pipeta sobre el electrodo de parche de cloruro de plata-revestido conectado a la etapa de la cabeza, sin raspar el revestimiento y adherirse firmemente.
  12. Aplicar una ligera presión positiva (aproximadamente 1 ml en una jeringa de plástico 10 ml) a la pipeta de parche antes de entrar en el baño.
  13. Bajar la pipeta en el baño usando micro manipuladores lo suficiente como para ser capaz de sumergir el objetivo sin golpearlo (Figura 2D).
  14. Vigilar la resistencia de la pipeta (R pip, entre 4-7 mO) usando el software de electrofisiología conectado a la etapa de la cabeza.
    Nota: Si R pip es <4 mO la punta de vidrio se rompe. Si R pip es> 10 mO, la punta es más probable obstruido y la pipeta debe ser reemplazado.
  15. Visualizar el VNO rebanada con una cámara CCD usando contraste de interferencia diferencial optimizado para el infrarrojo (CID) e identificar FPR-RS3-i-Venus células que expresan (o similarmente neuronas marcadas) utilizando iluminación de fluorescenciay un cubo de filtro apropiado.
  16. Enfoque y fluorescentes diana o células no fluorescentes dependiendo del diseño experimental.
  17. Para acercarse al cuerpo celular, utilizar ruedas de mano para la máxima sensibilidad. Debido a la presión positiva, una pequeña mella en la membrana soma celular se hace visible una vez que la punta de la pipeta está en estrecha proximidad.
  18. Liberar la presión positiva y aplicar una ligera presión negativa para aspirar en la membrana celular a fin de obtener un sello de alta resistencia (1-20 GΩ). Aplicar succión corta y suave para romper la membrana celular y establecer la configuración de célula completa.
  19. Vigilar la resistencia acceso constante durante el experimento.
    Nota: Sólo incluya las neuronas que exhiben resistencia acceso pequeño y estable (≤3% de entrada R, el cambio <20% en el transcurso del experimento) en el análisis.

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Resultados

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Para conocer las propiedades biofísicas y fisiológicas de las poblaciones de células definidas, realizamos cortes de tejido coronal agudas del ratón VNO (Figura 1 - 2). Después de la disección, rebanadas se pueden mantener en solución extracelular oxigenada enfriada con hielo (S 2) para varios hr. En la configuración de la grabación, un intercambio constante con solución oxigenada (Figura 2D) asegura la viabilidad del tejido d...

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Discusión

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El VNO es una estructura chemosensory que detecta semioquímicos. Hasta la fecha, la mayoría de los receptores vomeronasal queda por deorphanized tan sólo se han identificado algunos pares receptor-ligando. Entre ellos, V1rb2 fue descrito para ser activado específicamente por la feromona urinaria 2-heptanona macho 30, V2rp5 para ser activado por el macho ESP1 feromona específica 57, así como V2r1b y V2rf2 a ser activados por los péptidos MHC SYFPEITHI 48 y SEIDLILGY 58, respect...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Ivan Rodriguez y Benoit von der Weid por generar la línea de ratones FPR-rs3-i-venus, sus críticas constructivas y sus fructíferas discusiones. Este trabajo fue financiado por subvenciones de la Fundación Volkswagen (I/83533), la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) y por la Iniciativa de Excelencia de los gobiernos federal y estatal alemán. MS es profesor Lichtenberg de la Fundación Volkswagen.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Químicos
Agarosa (baja temperatura de gelificación)PeqLab35-2030
ATP (Mg-ATP)Sigma-AldrichA9187
Ácido Bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES)Sigma-AldrichB9879
Cloruro de calcioSigma-AldrichC1016
Ácido etilenglicol tetraacético (EGTA)Sigma-AldrichE3889
GlucosaSigma-AldrichG8270
GTP (Na-GTP)Sigma-Aldrich51120
(2-hidroxietil)-1-piperazineetanoácido sulfónico (HEPES)Sigma-AldrichH3375
Cloruro de magnesioSigma-AldrichM8266
Cloruro de potasioSigma-AldrichP9333
Hidróxido de potasioSigma-Aldrich03564
Cloruro de sodioSigma-AldrichS7653
Hidrogenocarbonato de sodioSigma-AldrichS5761
Hidróxido de sodioSigma-AldrichS8045
NameCompany>Número de catálogo>strong<>Comments
Herramientas quirúrgicas y consumibles
Placa de Petri grande,VWR, disección de la cápsula de VNO
Placa de Petri pequeña,VWRpara disección de VNO, placa para incrustar en agarosa
Tijera quirúrgica grande y afiladaFine Science Toolsdecapitación, extracción de la mandíbula inferior
Tijeras de hueso fuertesFine Science Toolsincisivos de corte
Pinzas medianas, pinzas Dumont #2Fine Science Toolspara quitar la piel y el paladar
Tijeras de resorte Micro, 8,5 cm, curvas, hojas de 7 mm Herramientas de Fine Science recortandoVNO 
Dos pares de pinzas finas, pinzas Dumont #5Fine Science Toolsdiseccionando VNO de una cápsula cartilaginosa
Pequeña espátula de acero inoxidableFine Science Toolsmanejo de bloques de agarosa y rodajas de tejido
Bisturícortando el bloque de agarosa en forma piramidal
NameCompanyNúmero de catálogoComments
Equipment
Cubo de filtro, excitación: BP 450-490, supresión: LP 515Leica MicrosystemsI3
Lámpara de fluorescenciaLeica MicrosystemsEL6000
Agitador magnético de placa calefactoraSnijders34532
Microforge NarishigeMF-830
 Luigs & NeumannSM-5
Extractor de micropipetas, vertical de dos pasosNarishigePC-10 
MicroscopioLeica MicrosystemsCSM DM 6000 SP5
Eliminador de ruido 50/60 Hz (HumBug)Quest Scientific
Objective Osciloscopio Leica MicrosystemsHCX APO L20x/1.00 W
OsmómetroTektronikTDS 1001B
 GonotecOsmomat 030
Sistema de perfusión 8 en 1AutoMate Scientific
Medidor de pH cinco fácilMettler Toledo
Tarro de almacenamiento de pipetasWorld Precision Instrumentse212
Cámara de registro Luigs & NeumannSlice mini cámara
Cuchillas de afeitarWilkinson Sword GmbHWilkinson Sword Classic
Cámara de almacenamiento de lonchas oxigenante; las cámaras comerciales alternativas son: p. ej., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) o la precámara (BSC-PC; Warner Instruments)a medida
Leica MicrosystemsS4E
Trigger interface HEKA ElektronikTIB-14 S
Vibratome Leica MicrosystemsVT 1000 S
 MemmertWNB 45
decapitación de de 90 mm tapa de de 35 mm quirúrgico Amplifier HEKA Elektronik EPC-10 Capilares de vidrio de borosilicato (1,50 mm OD/0,86 mm ID)Science Products Cámara CCD Leica Microsystems DFC360FX Dispositivo micromanipulador microscopio estereoscópico hecho Baño de agua

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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