Mostramos cómo preparar rodajas oblicuas de la médula espinal en ratones jóvenes. Esta preparación permite la estimulación de las raíces ventrales.
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Artículo de método
La Preparación de oblicua de la médula espinal ventral de segmentos para Root Estimulación
En este artículo
Resumen
Resumen
Registros electrofisiológicos de láminas de médula espinal han demostrado ser una técnica valiosa para investigar una amplia gama de preguntas, de celular a las propiedades de red. Mostramos cómo preparar rodajas oblicuas viables de la médula espinal de ratones jóvenes (P2 - P11). En esta preparación, las motoneuronas conservan sus axones que sale de las raíces ventrales de la médula espinal. La estimulación de estos axones provoca back-propagan los potenciales de acción que invaden el somas de las neuronas motoras y emocionantes colaterales el motoneuronas en la médula espinal. Grabación de potenciales de acción antidrómicos es una forma inmediata, definitiva y elegante para caracterizar la identidad de las neuronas motoras, que supera a otros métodos de identificación. Además, la estimulación de las neuronas motoras colaterales es una manera simple y fiable para excitar los objetivos colaterales de las neuronas motoras en la médula espinal, tales como otros motoneuronas o Renshaw células. En este protocolo, se presentan grabaciones antidrómicos de la motoneurona somas, así como excitación de la célula de Renshaw, resultante de la estimulación de la raíz ventral.
Introducción
Históricamente, las grabaciones motoneuronas utilizando Sharp-electrodo se llevaron a cabo in vivo en animales grandes tales como gatos o ratas 1 o en una médula espinal enteros aislados en ratones 2. La aparición de la técnica de grabación de patch-clamp durante la década de 1980, llamado por el acceso directo a la motoneurona somas como el sellado necesario para conseguir bajo control visual. Por lo tanto, la preparación de la rebanada de la médula espinal se ha logrado fácilmente desde principios de 1990 3. Sin embargo, rebanada preparación temprana a menudo no permitía la estimulación de las raíces ventrales. A lo mejor d....
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Protocolo
Los experimentos se realizaron de acuerdo con las directivas europeas (86/609 / CEE y 2010 a 63-UE) y la legislación francesa, y fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de París Descartes.
1. Preparación de la rebanada de la médula espinal
- Preparar las siguientes soluciones diarias o un día de antelación. Si se mantiene durante toda la noche, la burbuja con un 95% de O2 y 5% de CO2 y mantener refrigerado en frascos bien cerrados.
- Prepare baja Na + fluido cefalorraquídeo artificial (ACSF): KCl 3 mM, 1 mM NaH 2 PO 4, sacarosa 230 mM....
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Resultados
La confirmación de la identidad Motoneuron base de los potenciales de acción antidrómica
La orientación de la célula
Motoneuronas se encuentran en el cuerno ventral (visible en rojo en la figura 2C). Comience desde el haz de axones que forman la raíz ventral y subir hasta que el haz se dispersa completamente y uno com.......
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Discusión
rebanar oblicua de la médula espinal es importante ya que permite la estimulación unilateral de piscinas de neuronas motoras y las células de Renshaw en un solo segmento vertebral de una manera fiable, completa y específica. Además, se permite una identificación rápida, elegante y no ambigua de las motoneuronas grabados. A continuación, vamos a destacar las ventajas de esta técnica en comparación con otros métodos de preparación rebanada, y luego vamos a insistir en las trampas más comunes a evitar al realizar este proc.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Marin Manuel y Olivia Goldman-Szwajkajzer por su ayuda en la toma de las fotografías. Los autores también agradecen a Arjun Masukar y Tobias Bock para la corrección del manuscrito. Ayudas económicas fueron proporcionados por la Agence Nationale pour la Recherche (Hyper-MND, ANR-2010-BLAN-1429/01), el NIH NINDS (R01NS077863), la Fundación Latran Thierry (OHEX Proyecto), la Asociación Francesa de miopatía ( la subvención número 16026) y Target ALS se agradece. Felix Leroy era el destinatario de un "Contrato de Doctorado" de la Escuela Normal Superior, Cachan.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Na-quinurenato | ABCAM | ab120256 | se disuelve mejor que otras marcas |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sacarosa | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Calidad Biológica | 351-033-721 | |
| glucosa | Sigma | G5767 | |
| ácido ascórbico | Sigma | A5960 | |
| Na-piruvato | Sigma | P2250 | |
| K-gluconato | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| ácido glucónico | Sigma | G1951 | |
| Solución de hidróxido de cesio | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Tijeras de resorte Vannas - 2,5 mm | FST | 15000-08 | solo se usa para cortar la duramadre, podría dañarse si se cortan los huesos |
| Estimulador | A-M Systems | Estimulador de Pulso Aislado Modelo 2100 | |
| Vibratome | Campden | Microtomo Vibratorio 7000 - Modelo 7000SMZ-2 |
Referencias
- Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation. J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).
- Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J.
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Reimpresiones y permisos
