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Artículo de método

La Preparación de oblicua de la médula espinal ventral de segmentos para Root Estimulación

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DOI:

10.3791/54525

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13 de octubre de 2016

 , 
1Centre National de la Recherche Scientifique (UMR 8119), Centre de Neurophysique, Physiologie et Pathologie, Université Paris Descartes

En este artículo

Resumen

Mostramos cómo preparar rodajas oblicuas de la médula espinal en ratones jóvenes. Esta preparación permite la estimulación de las raíces ventrales.

Resumen

Registros electrofisiológicos de láminas de médula espinal han demostrado ser una técnica valiosa para investigar una amplia gama de preguntas, de celular a las propiedades de red. Mostramos cómo preparar rodajas oblicuas viables de la médula espinal de ratones jóvenes (P2 - P11). En esta preparación, las motoneuronas conservan sus axones que sale de las raíces ventrales de la médula espinal. La estimulación de estos axones provoca back-propagan los potenciales de acción que invaden el somas de las neuronas motoras y emocionantes colaterales el motoneuronas en la médula espinal. Grabación de potenciales de acción antidrómicos es una forma inmediata, definitiva y elegante para caracterizar la identidad de las neuronas motoras, que supera a otros métodos de identificación. Además, la estimulación de las neuronas motoras colaterales es una manera simple y fiable para excitar los objetivos colaterales de las neuronas motoras en la médula espinal, tales como otros motoneuronas o Renshaw células. En este protocolo, se presentan grabaciones antidrómicos de la motoneurona somas, así como excitación de la célula de Renshaw, resultante de la estimulación de la raíz ventral.

Introducción

Históricamente, las grabaciones motoneuronas utilizando Sharp-electrodo se llevaron a cabo in vivo en animales grandes tales como gatos o ratas 1 o en una médula espinal enteros aislados en ratones 2. La aparición de la técnica de grabación de patch-clamp durante la década de 1980, llamado por el acceso directo a la motoneurona somas como el sellado necesario para conseguir bajo control visual. Por lo tanto, la preparación de la rebanada de la médula espinal se ha logrado fácilmente desde principios de 1990 3. Sin embargo, rebanada preparación temprana a menudo no permitía la estimulación de las raíces ventrales. A lo mejor de nuestro conocimiento, sólo dos estudios han informado de la estimulación exitosa de las raíces ventrales en rodajas transversales, y ninguno se obtuvo a partir de ratones 4,5.

En este artículo se presenta una técnica para lograr las rebanadas de la médula espinal viables de ratones recién nacidos (P2 - P11) en el que la piscina de motoneuronas conserva sus raíces ventrales saliendo axones. Respiraderoestimulación de la raíz ral desencadena potencial de acción antidrómica de nuevo en los somas de las neuronas motoras de la piscina que sale de la misma raíz ventral. También excita los objetivos colaterales de neuronas motoras, otras motoneuronas 6-10 y las células de Renshaw 11-13. Dado que sólo motoneuronas envían sus axones hacia abajo las raíces ventrales, se utiliza el registro de los potenciales de acción antidrómicos como una forma sencilla y definitiva a physiologicaly identificar motoneuronas 10.

Además de utilizar criterios electrofisiológicos y morfológicos potencialmente no incluido o engañosas para confirmar la identidad de las neuronas motoras, estudios recientes sobre las neuronas motoras de la médula espinal también se basó en tinciones tedioso y requiere mucho tiempo post hoc 16. Tal identificación se realiza generalmente sólo en una muestra de las células grabadas. Otras estrategias de identificación se basan en las líneas de ratón en el que las motoneuronas expresan la fluorescencia endógena 17-19. Sin embargo, el uso de marcadores codificados genéticamente puede ser difícil a una edad temprana, cuando la expresión del marcador sigue siendo variable o si el estudio ya se requiere el uso de una línea de ratones transgénicos. Alternativamente, la acción antidrómica potenciales grabaciones se pueden realizar de forma rutinaria en todos los ratones desde el inicio de la grabación de la célula. Los experimentadores que trabajan en los preparativos de la médula espinal intacta en el gato, la rata y el ratón, se han utilizado de forma fiable estas técnicas de identificación desde la década de 1950 1,2,20,21. En condiciones óptimas, hemos sido capaces de provocar potenciales de acción antidrómicos de virtualmente todas las neuronas motoras registradas.

Además, la estimulación de la raíz ventral se puede utilizar para excitar de forma fiable otros motoneuronas 22,23 o sus objetivos. las células de Renshaw 10,24,25. Presentamos aquí las aplicaciones de la estimulación de la raíz ventral en forma de acción antidrómica posibles grabaciones de somas de las neuronas motoras, así como la excitación de las células de Renshaw.

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Protocolo

Los experimentos se realizaron de acuerdo con las directivas europeas (86/609 / CEE y 2010 a 63-UE) y la legislación francesa, y fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de París Descartes.

1. Preparación de la rebanada de la médula espinal

  1. Preparar las siguientes soluciones diarias o un día de antelación. Si se mantiene durante toda la noche, la burbuja con un 95% de O2 y 5% de CO2 y mantener refrigerado en frascos bien cerrados.
    1. Prepare baja Na + fluido cefalorraquídeo artificial (ACSF): KCl 3 mM, 1 mM NaH 2 PO 4, sacarosa 230 mM, 26 mM NaHCO3, 0,8 mM CaCl 2, 8 mM MgCl2, 25 mM de glucosa, ácido ascórbico 0,4 mM, 1 mM Na-quinurenato, 2 mM Na-piruvato. Burbuja con un 95% de O2 y 5% de CO 2 (pH 7,4). Desde Na-quinurenato es a menudo difícil de disolver, asegúrese de comprar la que aparece en la tabla de materiales.
    2. Preparar Solu K-gluconatoción: 130 mM K-gluconato, mM KCl 15, EGTA 0,05 mM, HEPES 20 mM, glucosa 25 mM, 1 mM Na-quinurenato, 2 mM Na-piruvato, se ajustó a pH 7,4 con KOH.
    3. Preparar ACSF: NaCl 130 mM, KCl 2,5 mM, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM NaH 2 PO 4, 26 mM NaHCO 3, glucosa 25 mM, ácido ascórbico 0,4 mM, 2 mM Na-piruvato. Burbuja con un 95% de O2 y 5% de CO 2 (pH 7,4).
    4. Antes del comienzo de la disección, se disuelven 2% de agar en 80 ml de la solución de K-gluconato, y mantener caliente a 60 ° C.
  2. perfusión intracardiaca
    1. Realizar esta preparación en ratones hembras y machos, con edades de P2 a P11.
    2. Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de 0,1 ml de 25 mM de sodio pentobarbital (50 mg / kg).
    3. El uso de agujas o cinta, se debe inmovilizar el ratón sobre su espalda en una gran placa de Petri llena de silicio. Use un microscop diseccióne para el resto de la disección.
    4. Sujetando la punta del esternón, levantar el pecho y cortar el diafragma utilizando unas tijeras finas. A continuación, abrir el pecho en ambos lados por el corte a través de las costillas para exponer el corazón.
    5. Cortar la aurícula derecha antes de la punción del ventrículo izquierdo con una aguja 27G.
    6. Perfundir con helado de baja ACSF Na +. Después de 30 seg, bajo Na + ACSF debe considerarse que fluye de la aurícula. bajas cantidades de sodio evitar que las células de adición y reducir la muerte celular durante la disección.
    7. Mantener la celebración de la aguja en el corazón bajo el microscopio de disección hasta que el hígado se vuelve amarillo cuando se drena la sangre.
  3. Disección de la médula espinal
    1. Decapitar al animal y lo puso en su estómago.
    2. Eliminar rápidamente la piel de la espalda (Figura 1A1). Hacer dos cortes a través de los hombros y bajando la caja torácica (Figura 1A2). A continuación, corte el cable como low como sea posible en la sección de caudal con el fin de aislar la columna vertebral con el inicio de las nervaduras de la parte inferior del animal. Da la vuelta al animal de nuevo y retirar las vísceras todavía unido a las costillas.
    3. Transferir la columna vertebral, a otra, más pequeña placa de Petri llena de silicio y el uso de 4 pines de insectos para sostenerlo hacia arriba dorsal (Figura 1A).
    4. Continuamente perfundir el animal con ACSF carbógeno-burbujeó (a aproximadamente 4 ° C) mientras se realiza una laminectomía del lado dorsal, y la exposición de la médula espinal desde el extremo rostral (Figura 1B). Para ello, inserte la punta de tijeras finas entre el hueso y la médula espinal y cortar el hueso poco a poco desde el extremo rostral, asegurándose de mantenerse alejado de la sustancia blanca. Alternan en cada lado durante el uso de pinzas para mantener lejos de la banda del hueso ya cortada (Figura 1B1).
    5. El uso de las tijeras de primavera disponibles más pequeños y pinzas, levante la dura y cortaen ambos lados mientras sostiene la parte suelta de la duramadre con el fin de evitar daños en la médula espinal con las tijeras. Corte a lo largo del eje rostro-caudal.
      NOTA: La duramadre es una membrana continua semi transparente; a esta edad la piamadre es demasiado frágil y se deshaga durante la disección y corte en rodajas (Figura 1B2).
    6. Una vez que la duramadre es suprimido el uso de una copa roma o punta de plástico para empujar suavemente el cable en el lado izquierdo de la ranura formada por la columna vertebral mitad cortar, y cortar las raíces ventral y dorsal en el lado derecho, comenzando desde el lado rostral , más lejos de donde entran en el cable (unos pocos mm, al menos, la figura 1B2).
    7. Repetir la operación en el lado izquierdo, siempre pasando de rostral a caudal. Si zurdo, comience desde el lado izquierdo y luego moverse hacia el lado derecho.
  4. Incorporación en agar
    1. Deslizar el cable fuera de la columna vertebral. Use un alfiler de insectos más pequeños de precisarel cordón con la superficie dorsal y quitar delicadamente cualquier pieza de membrana todavía unido a ella (Figura 1C1).
    2. Una vez limpia, recortar ambos extremos (Figura 1C2). Inserte un alfiler de insectos doblada en la parte anterior de la cuerda para manipular el cable y tenga en cuenta su orientación (flecha en la figura 1C2). A continuación, la transferencia de la médula espinal a una solución de K-gluconato enfriado con hielo.
      NOTA: Esta solución imita la composición intracelular de la CSF y evitará que las células mueran de choque osmótico una vez que las motoneuronas se cortarán 26.
    3. Una vez que la médula espinal se encuentra dentro de la solución intracelular, tomar el vaso de precipitados con el agar salir del baño seco y enfriarlo en una mezcla de hielo y agua.
    4. Mantener la agitación mientras que la medición de la temperatura. Cuando la temperatura alcanza los 38 ° C sumergir la médula espinal, sujetándolo por el pasador de insectos y colocarlo lado rostral hacia abajo. Asegúrese de que la médula espinal es como straight posible, lejos de las paredes, parte caudal ligeramente hacia arriba (Figura 1D1).
    5. Deje el vaso de precipitados en la mezcla de hielo y agua para permitir que el agar se solidifique lo más rápidamente posible. Asegúrese de que se mantiene en su lugar y que el cable es lo más recto posible (Figura 1D1).
  5. El rebanar
    1. Después de la solidificación, cortar el bloque de agar que contiene la médula espinal de una manera tal que la base del bloque es en un ángulo de 35 ° con la parte lumbar de la médula (flecha en la Figura 1D2). La superficie dorsal debe estar mirando hacia fuera de la base (Figura 1D2).
      NOTA: Este es un paso crítico en el procedimiento, para mantener la continuidad de las piscinas de las motoneuronas a las raíces ventrales de la que salen.
    2. Pegar el bloque en la cámara de la vibratome utilizando pegamento de cianoacrilato. Sumergirla en una solución de K-gluconato y añadir solución de K-gluconato congelada para mantener slushedel baño de enfriado (por debajo de 2 ° C).
    3. Cortar 350 - 400 micras rodajas gruesas de la región lumbar (identificable por la curvatura y el diámetro más grande). En su orientación correcta (véase 1.4.1.), Utilice la cuchilla para cortar desde el dorsal a la superficie ventral y hacer rodajas de forma continua más rostral. Típicamente, hay 4-5 rebanadas adecuados con raíces ventrales que se extienden de 2 mm o más. Utilice los siguientes parámetros: 10 ° de ángulo de referencia, la frecuencia de vibración de 70 Hz y 10 mm / min de velocidad de corte.
  6. Incubación
    1. Transferir las rebanadas de ACSF a 34 ° C. Después de aproximadamente 30 min, enfriar las rodajas a RT y comenzar la sesión de grabación.

figure-protocol-1
La figura 1. La disección
A1:. La eliminación de la piel de la espalda para exponer la columna dorsal A2:El corte de los hombros y las costillas para liberar el dorsal columna B1:. La columna vertebral fijada en la placa de Petri de silicio-llenado (lado dorsal, de lado caudal izquierda) B2:. Lo mismo con la médula espinal expuesta y diseccionado C1:. Aislado de la médula espinal . (lado izquierdo rostral) C2: la médula espinal listo para ser incorporado (lado ventral hacia arriba, lado izquierdo rostral). Tenga en cuenta el pasador de insectos más pequeños en la parte rostral D1:.. De la médula espinal en el vaso de precipitados de agar (lado rostral Dow, lado ventral hacia la parte inferior) D2: bloque de agar Cortar con la médula espinal incrustado. Tenga en cuenta el ángulo de 35 ° las formas de la médula espinal con la base del bloque y la ampliación lumbar (Flecha). Las barras de escala 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Colocar la rebanada en la Cámara

NOTA: Ventral raíces son de tamaño variable.

  1. Prepare una caja de varias pipetas con diámetros de punta que van desde 40 hasta 170 micras con antelación. Para preparar las pipetas de aspiración, preparar muchas pipetas con una larga puesta a punto. Usando un cuchillo de diamante, hacer un corte en diferentes posiciones. Entonces bajo un microscopio de disección, se rompen por golpear la punta con unas pinzas.
  2. Retire la cámara del microscopio grabación y colocarlo bajo un microscopio de disección.
  3. Seleccionar un segmento que contiene una raíz ventral de longitud suficiente (2 mm o más) para ser montado en un electrodo de estimulación de succión. Seleccione la orientación adecuada de la rebanada con las raíces ventrales hacia arriba (figura 2A) y cortar delicadamente el agar alrededor de las raíces ventrales, dejando el resto del agar alrededor de la rebanada (Figura 2B).
    NOTA: Debido a que el agar es más firme que la rodaja, esto permitirá que los hilos de anclaje de la rebanada para descansar en el agar en lugar de en la rebanada y por lo tanto la unanchor no dañará el tejido. Asegúrese de que los hilos de anclaje de la rebanada están por encima de la piscina de las neuronas motoras (se muestra en rojo en la figura 2C).
  4. Montar la cámara de nuevo en el microscopio y perfundir continuamente la cámara de registro con ACSF a una velocidad de 1-2 ml / min, a temperatura ambiente. Usando una pipeta de vidrio lleno de ACSF y conectada a una jeringa, chupar uno de la raíz ventral (flecha en la Figura 2C). Con el fin de lograr una buena estimulación de la raíz ventral, la punta de la pipeta tiene que ser apretado alrededor de la raíz ventral. Un polo debe estar en el electrodo de estimulación y el otro en el baño (o conectado a la referencia de electrodo de conexión de sujeción).
  5. Lograr la grabación de patch-clamp del tipo de célula deseado y registrar el efecto de la estimulación de la raíz ventral como se describe previsouly 10.
    1. Aquí, utilizar un amplificador para la adquisición de datos. Filtrar registros de células completas a las 3 kHz. Digitalizar a 10 kHz. Compensar la resistencia puente en curremodo nt-clamp.

figure-protocol-2
Figura 2. ventral Root Preparación
R: Lumbar rebanada de la médula espinal incrustado en agar con la raíz ventral hacia arriba. B: Lumbar rebanada de la médula espinal con las raíces ventrales liberados del agar C:. Rebanada de la médula espinal lumbar con un electrodo de estimulación firmemente colocado alrededor de las raíces ventrales (flecha) . Tenga en cuenta la ubicación de las células de Renshaw que expresan fluorescencia roja en el 28 chrna2-Cre ratón cruzado con el reportero del ratón R26 Tom 17. Las barras de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

La confirmación de la identidad Motoneuron base de los potenciales de acción antidrómica

La orientación de la célula

Motoneuronas se encuentran en el cuerno ventral (visible en rojo en la figura 2C). Comience desde el haz de axones que forman la raíz ventral y subir hasta que el haz se dispersa completamente y uno com...

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Discusión

rebanar oblicua de la médula espinal es importante ya que permite la estimulación unilateral de piscinas de neuronas motoras y las células de Renshaw en un solo segmento vertebral de una manera fiable, completa y específica. Además, se permite una identificación rápida, elegante y no ambigua de las motoneuronas grabados. A continuación, vamos a destacar las ventajas de esta técnica en comparación con otros métodos de preparación rebanada, y luego vamos a insistir en las trampas más comunes a evitar al realizar este proc...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Marin Manuel y Olivia Goldman-Szwajkajzer por su ayuda en la toma de las fotografías. Los autores también agradecen a Arjun Masukar y Tobias Bock para la corrección del manuscrito. Ayudas económicas fueron proporcionados por la Agence Nationale pour la Recherche (Hyper-MND, ANR-2010-BLAN-1429/01), el NIH NINDS (R01NS077863), la Fundación Latran Thierry (OHEX Proyecto), la Asociación Francesa de miopatía ( la subvención número 16026) y Target ALS se agradece. Felix Leroy era el destinatario de un "Contrato de Doctorado" de la Escuela Normal Superior, Cachan.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Na-quinurenatoABCAMab120256se disuelve mejor que otras marcas
KClSigmaP3911
NaH2PO4SigmaP5655
sacarosa SigmaS9378
NaHCO3 SigmaS6014
CaCl2 G BiosciencesR040
MgCl2 Calidad Biológica351-033-721
glucosa SigmaG5767
ácido ascórbico SigmaA5960
Na-piruvato SigmaP2250
K-gluconato  SigmaP1847
EGTA SigmaE3889
HEPES SigmaH4034
NaClSigmaS9888
AgarSigmaA9799
QX-314AlomoneQ150
Mg-ATPSigmaA9187
CsOHSigma232041
Na-GTPSigma51120
ácido glucónicoSigmaG1951
Solución de hidróxido de cesioSigma232041
KOHSigmaP5958
Tijeras de resorte Vannas - 2,5 mm FST15000-08solo se usa para cortar la duramadre, podría dañarse si se cortan los huesos
EstimuladorA-M SystemsEstimulador de Pulso Aislado Modelo 2100
VibratomeCampdenMicrotomo Vibratorio 7000 - Modelo 7000SMZ-2

Referencias

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