Identificación de las pequeñas proteínas de unión a la molécula-celular en un entorno nativo de Células vivas marcado por fotoafinidad

Summary

Describimos aquí un método para la identificación de proteínas de unión a moléculas pequeñas utilizando el marcaje de fotoafinidad. La ventaja de esta técnica es que la unión y el marcaje covalente de las proteínas diana se producen dentro del entorno celular vivo, lo que elimina el riesgo de alterar la estructura de la proteína nativa y las condiciones de unión durante la lisis celular.

Abstract

Identificar el/los objetivo(s) molecular(es) de moléculas pequeñas es un paso desafiante pero necesario hacia la comprensión de su mecanismo de acción. Si bien se han desarrollado y utilizado varios métodos de identificación de objetivos para dilucidar con éxito las proteínas de unión de una variedad de moléculas pequeñas, estas técnicas tienen inconvenientes que las hacen inadecuadas para detectar ciertos tipos de interacciones entre moléculas pequeñas y objetivos. En particular, las interacciones no covalentes que dependen de las condiciones celulares nativas, como las de las proteínas de membrana cuyas estructuras pueden verse perturbadas por la lisis celular, a menudo no son susceptibles a los métodos de identificación de objetivos basados en la afinidad. Aquí, demostramos un método en el que una sonda que contiene un grupo fotolábil se utiliza para reticular covalentemente a la proteína de unión a molécula pequeña dentro del entorno de la célula viva, lo que permite la detección y el aislamiento de la proteína objetivo sin la necesidad de mantener la interacción después de la lisis celular. Esta técnica es una herramienta valiosa para el estudio de moléculas pequeñas biológicamente interesantes con mecanismos desconocidos, tanto en el contexto de la biología básica como en el descubrimiento de fármacos.

Introduction

pequeñas moléculas bioactivas, fundamentalmente, funcionan mediante la interacción con y alterar la función de una o más moléculas "objetivo", más comúnmente proteínas, en la célula. En el descubrimiento de fármacos, cuando un compuesto activo se descubrió mediante el cribado fenotípico, la identificación de la diana molecular (s) de ese compuesto es crucial, no sólo para entender el mecanismo de acción y efectos secundarios potenciales del compuesto, sino también para potencialmente descubrir nueva biología que subyace al modelo de enfermedad y allanando el camino para el desarrollo de nuevas clases mecanicistas de la terapéutica ^1. A pesar de la identifi....

Protocol

NOTA: Este protocolo se adaptó de MacKinnon y Taunton ¹⁰ para su uso en células vivas.

1. Preparación de las células cultivadas

1. Preparar placas de cultivo de células estériles de 6 cm para el número de muestras deseadas (véase más adelante).
   NOTA: Una placa de células se utiliza por condición de tratamiento, pero si se requiere más proteína 2 o 3 platos se pueden preparar por condición y se combinaron después de la irradiación UV.
   1. Preparar al menos 3 placas de células; Control negativo con DMSO solamente (D), el tratamiento de la sonda solamente (P), y la sonda + competidor (C).
   2. Opcionalment....

Results

Los resultados mostrados aquí se obtuvieron con una sonda de foto-afinidad del fármaco antifúngico itraconazol, el uso de que se ha publicado previamente ^16. Estos resultados demuestran el uso de la técnica de marcaje de fotoafinidad en vivo de células para identificar con éxito una importante proteína de unión itraconazol-como el 35 kDa proteína de membrana dependiente de la tensión del anión Canal 1 (VDAC1).

El pr.......

Discussion

Diferentes enfoques para la identificación de los objetivos de moléculas pequeñas se pueden agrupar en dos categorías: de arriba hacia abajo, cuando se utilice el fenotipo celular del fármaco para reducir sus posibles objetivos sobre la base de sus funciones conocidas, o de abajo hacia arriba, donde el objetivo se identifica directamente por medios químicos o genéticos ^3. De arriba hacia abajo o estudios fenotípicos pueden identificar ciertos procesos celulares afectados por el fármaco (por ejemplo, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)	Life Technologies	20490	Hacer fresco día de uso. Prepare 100 mM de caldo en agua con NaOH de 4 eq.
Tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metilo] amina (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Prepare un stock de 1,7 mM en una proporción de 4:1 de t-butanol a DMSO, almacene a -20   °C.
Sulfato de cobre (CuSO4• 5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Prepare 50 mM de caldo en agua, almacene a temperatura ambiente.
Biotina-azida	Click Chemistry Tools	AZ104-100	Prepare 10 mM de stock en DMSO, almacene en -20  °C.
Alexa Fluor 647-azida	Life Technologies	A10277	Prepare 1 mM de stock en DMSO, almacene a -20  °C.
Lámpara UV de 365 nm	Spectroline	FC100	deben usarse mientras están en funcionamiento.
Comprimidos inhibidores de la proteasa, sin EDTA	Roche Life Science	11873580001	Prepare la solución 50x en agua y almacene a -20  °C.
Sonicator	Branson	Sonifier 250	Conjunto de salida 1, servicio 30%.
Escáner de gel fluorescente	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Utilice láser rojo para detectar Alexa-fluor 647.
Kit de ensayo de proteínas Dc compatible con detergentes	Bio-Rad	5000112
perlas de agarosa estreptavidina de alta capacidad	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Glucosa media, baja	ThermoFisher Scientific	11885092
Suero fetal bovino, calificado	ThermoFisher Scientific	26140079
solución de penicilina/estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Tampón de muestra (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676