Identificación de las pequeñas proteínas de unión a la molécula-celular en un entorno nativo de Células vivas marcado por fotoafinidad

Resumen

Describimos aquí un método para la identificación de proteínas de unión a moléculas pequeñas utilizando el marcaje de fotoafinidad. La ventaja de esta técnica es que la unión y el marcaje covalente de las proteínas diana se producen dentro del entorno celular vivo, lo que elimina el riesgo de alterar la estructura de la proteína nativa y las condiciones de unión durante la lisis celular.

Resumen

Identificar el/los objetivo(s) molecular(es) de moléculas pequeñas es un paso desafiante pero necesario hacia la comprensión de su mecanismo de acción. Si bien se han desarrollado y utilizado varios métodos de identificación de objetivos para dilucidar con éxito las proteínas de unión de una variedad de moléculas pequeñas, estas técnicas tienen inconvenientes que las hacen inadecuadas para detectar ciertos tipos de interacciones entre moléculas pequeñas y objetivos. En particular, las interacciones no covalentes que dependen de las condiciones celulares nativas, como las de las proteínas de membrana cuyas estructuras pueden verse perturbadas por la lisis celular, a menudo no son susceptibles a los métodos de identificación de objetivos basados en la afinidad. Aquí, demostramos un método en el que una sonda que contiene un grupo fotolábil se utiliza para reticular covalentemente a la proteína de unión a molécula pequeña dentro del entorno de la célula viva, lo que permite la detección y el aislamiento de la proteína objetivo sin la necesidad de mantener la interacción después de la lisis celular. Esta técnica es una herramienta valiosa para el estudio de moléculas pequeñas biológicamente interesantes con mecanismos desconocidos, tanto en el contexto de la biología básica como en el descubrimiento de fármacos.

Introducción

pequeñas moléculas bioactivas, fundamentalmente, funcionan mediante la interacción con y alterar la función de una o más moléculas "objetivo", más comúnmente proteínas, en la célula. En el descubrimiento de fármacos, cuando un compuesto activo se descubrió mediante el cribado fenotípico, la identificación de la diana molecular (s) de ese compuesto es crucial, no sólo para entender el mecanismo de acción y efectos secundarios potenciales del compuesto, sino también para potencialmente descubrir nueva biología que subyace al modelo de enfermedad y allanando el camino para el desarrollo de nuevas clases mecanicistas de la terapéutica ^1. A pesar de la identificación de objetivos no se requiere de un medicamento para ser utilizado terapéuticamente, en los últimos años ha habido un creciente reconocimiento de que los nuevos candidatos a fármacos tienen más probabilidades de tener éxito en ensayos clínicos, y por lo tanto obtener mejores rendimientos de la inversión, si una diana validada es conocida ^2. Por lo tanto, ha habido un creciente interés en métodos para la identificación de pequeñaproteínas diana molécula.

Un experimento de identificación de objetivos clásica normalmente se basa en la purificación por afinidad, en donde la pequeña molécula de interés es inmovilizado en una resina y se incubó con lisados ​​de células enteras, después de lo cual las proteínas no unidos son lavados y las proteínas restantes se eluyeron y se identificaron ^3. Aunque esta técnica se ha utilizado para identificar los objetivos de muchas moléculas pequeñas ^4, no es adecuado como método de ID de destino universal para varias razones. En primer lugar, la proteína diana debe retener su conformación nativa en la lisis celular con el fin de conservar su capacidad de unirse a la molécula pequeña. Esto puede ser particularmente problemático para las proteínas de membrana, que a menudo se someten a cambios conformacionales después de haber sido retirado de su ambiente nativo, o simplemente agregan y precipitan de la solución. En segundo lugar, la molécula pequeña tiene que ser modificado químicamente de una manera tal que puede ser inmovilizado en la resina mientras se mantienesu capacidad de unirse la proteína diana. por lo tanto, bolsillos de unión profundos pueden llegar a ser inaccesibles a una molécula pequeña, una vez que está fijado a la resina. En tercer lugar, la afinidad de unión debe ser suficientemente alta de que la interacción se mantiene durante las etapas de lavado, haciendo la identificación de interacciones de afinidad inferiores desafiantes. En cuarto lugar, las condiciones ambientales tales como el pH, concentración de iones, o la presencia de otras moléculas endógenas pueden variar espacialmente dentro de la célula y, a veces son requisitos previos para las interacciones fármaco-diana. Por lo tanto, la búsqueda de las condiciones adecuadas para permitir y mantener fuera de la célula de unión puede requerir una cantidad significativa de ensayo y error.

marcaje de fotoafinidad evita estos problemas al permitir la unión de una molécula pequeña y su diana en el contexto nativo de una célula covalente. En lugar de inmovilización de la molécula pequeña en gran resina voluminosa, la molécula se modifica químicamente en lugar de instalar dos pequeños g funcionalrupos: un resto fotoactivable que permite la reticulación covalente a la proteína diana cuando se irradia con una longitud de onda particular de la luz, y un grupo indicador que permite que la proteína diana a detectar y se aisló posteriormente. Las células vivas se tratan con la sonda de fotoafinidad, la sonda se une de forma covalente y reticula a la proteína diana, y el complejo sonda-proteína es entonces aislado intacto. La especificidad de unión a la diana de la sonda se demuestra mediante la realización de un experimento de competición en paralelo, donde se utiliza un exceso del compuesto original para competir de distancia de unión de la sonda a la proteína diana.

El diseño y síntesis de sondas de fotoafinidad varía mucho de una pequeña molécula a otra, y no serán cubiertos en este protocolo; Sin embargo, varios excelentes discusiones sobre el tema han sido publicadas ^5-9. La consideración principal es que la sonda mantiene la bioactividad del compuesto de origen, por lo tanto presumably la unión a la misma diana (s). relación estructura-actividad (SAR) Los estudios deben llevarse a cabo para determinar qué partes de la molécula pueden ser modificadas sin pérdida de bioactividad. Una variedad de diferentes grupos químicos se han utilizado como agentes de entrecruzamiento fotoactivables, incluyendo diazirina, benzofenona, y azida de arilo, que tienen cada uno ventajas y desventajas ^10. Asimismo, hay varias etiquetas reportero que se han utilizado para aislar proteínas de unión a la sonda. Grupos informadores pueden ser funcionales por su cuenta, tales como la biotina se utiliza comúnmente o etiquetas fluorescentes, o pueden ser precursores que requieren más de funcionalización posterior a la etapa fotorreticulación, que tienen la ventaja de ser más pequeño y por lo tanto menos susceptible de comprometer la bioactividad ^11.

En este protocolo, se ha utilizado una sonda de fotoafinidad que contienen un grupo diazirina fotorreticulación, y un alquino terminal para la unión de un grupo informador a través de un Cu (I) -catalyzcicloadición ed azida-alquino Sharpless-Huisgen (o clic) reacción de ^12-15. Los estudios de SAR, la sonda de diseño y síntesis, y los resultados de estos estudios han sido publicados en otra parte ^16-18.

Protocolo

NOTA: Este protocolo se adaptó de MacKinnon y Taunton ¹⁰ para su uso en células vivas.

1. Preparación de las células cultivadas

1. Preparar placas de cultivo de células estériles de 6 cm para el número de muestras deseadas (véase más adelante).
   NOTA: Una placa de células se utiliza por condición de tratamiento, pero si se requiere más proteína 2 o 3 platos se pueden preparar por condición y se combinaron después de la irradiación UV.
   1. Preparar al menos 3 placas de células; Control negativo con DMSO solamente (D), el tratamiento de la sonda solamente (P), y la sonda + competidor (C).
   2. Opcionalmente, preparar una 4 ^TH plato como un control sin UV, a ser tratados con la sonda, pero no sometido a la luz UV.
      NOTA: Si múltiples moléculas de la competencia son a ensayar, tales como diferentes análogos de la pequeña molécula de interés, preparar placas competidor adicionales según sea necesario.
2. Añadir células HEK293T con placas de cultivo en 4 ml de medio de cultivo. Utilizar 3,5 millones de cells por placa.
   NOTA: El número de células debe determinarse para cada tipo de célula de manera que las células son casi 100% de confluencia en el comienzo del experimento, a fin de lograr el máximo rendimiento de proteínas. Para HUVEC, utilizar 0,3 millones de células por placa. Una buena aproximación es un décimo de las células en un plato de 15 cm confluente. células HEK293T deben ser cultivadas en Dulbecco Modificado Eagles medio suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina.
3. Volver a las células a la incubadora de cultivo (37 ° C, 5% de CO ₂₎ durante la noche.

2. Tratamiento de las células y los foto-reticulación

1. El día siguiente, antes de la alícuota los siguientes fármacos en 1,5 ml tubos de microcentrífuga:
   1. Para el primer tratamiento, añadir 4 l de DMSO a 2 tubos y 4 l de competidor 10 mM (es decir, el compuesto de origen no modificado) a 1 tubo.
   2. Para el segundo tratamiento, añadir 16 l de DMSO a 1 tubo y 16 l de 50 y# 181; sonda de fotoafinidad M a 2 tubos.
      NOTA: La concentración óptima puede ser diferente para diferentes sondas (véase el debate), pero entre 200-500 nm es un buen punto de partida (aquí usamos 200 nM). La concentración de competidor debe ser superior a la de la sonda al menos 20 veces (aquí usamos 10 mM). La concentración final de DMSO debe ser igual en todas las placas y no debe exceder de 0,5% (volumen de 20 l).
2. Llevar las placas de las células dentro de la campana de cultivo de células y añadir los medicamentos pre-alícuotas del paso 2.1.1 de la siguiente manera: Aspirar 1 ml de medio de cultivo, volviendo a suspender el fármaco antes de la alícuota en los medios, y la adición de él con cuidado de nuevo a la caída de la placa sabio. Añadir el DMSO a la placa de DMSO (D) y la placa de la sonda (P), y añadir el competidor a la placa de la competencia (C). Volver las placas a la incubadora de cultivo de 30 min.
3. Con luces de la campana de cultivo atenuado, añadir la sonda antes de la alícuota del paso 2.1.2 a la sonda (P) y de competencia placas (C) y añadir laDMSO a la placa de DMSO (D), como anteriormente. Volver las placas a la incubadora de cultivo durante 1 hora.
4. Durante la incubación, preparar los siguientes elementos; Una bandeja de hielo que puede caber todas las planchas; tampón de lisis enfriado con hielo (PBS [pH 8,5] + 1x cóctel inhibidor de la proteasa [completa libre de EDTA, se diluyó la solución de 50x acciones hecha en agua]; 200 l / placa); tubos de microcentrífuga etiquetados D, P, o C para cada una de las diferentes condiciones de tratamiento, en el hielo.
5. 15 minutos antes del final de la incubación de 1 hora, establecieron la lámpara UV (365 nm) en el cuarto frío y la convierten en calentar la bombilla.
6. Después de 1 h de incubación con la sonda, colocar los platos en hielo. Lavar las células suavemente con 5 ml de PBS enfriado con hielo (pH 7,4) para eliminar el exceso de sonda. Vuelva a cubrir las células con 4 ml de PBS frío hielo.
7. Coloque la placa de células se centraron 3 cm bajo la lámpara UV en la parte superior de una bolsa de hielo para minimizar el calentamiento de la lámpara. Irradiar de 3 min. Retire el plato de la bandeja de hielo y repetir para todas las muestras.
8. UNespués de la irradiación, aspirar el PBS de las células y añadir 200 l de la PBS enfriado con hielo (pH 8,5) con inhibidores de la proteasa a cada placa. Desprender las células de la placa utilizando una espátula de goma y la transferencia de los tubos de microcentrífuga de pre-etiquetados en el hielo.
9. Añadir SDS a una concentración final de 0,4% (10 l de 10% SDS en 250 l de muestra).
   PRECAUCIÓN: SDS polvo es peligroso. Evitar la inhalación de polvo de SDS usando una máscara sobre la nariz y la boca.
10. Lisar las células por sonicación de la suspensión durante 10 impulsos (salida 1, ciclo de trabajo 30%) e incubar en hielo durante 1 min antes de una segunda ronda de 10 pulsos.
11. Si es necesario, retire 2 l de suspensión y se les presentarán bajo un microscopio óptico para asegurar la lisis celular completa.
12. Hervir las muestras en una placa caliente ajustada a 95 ° C durante 5 minutos para completar la lisis celular y desnaturalizar todas las proteínas.
13. Medir la concentración de proteína en cada muestra usando un ensayo de proteína con capacidad para un detergente espectrofotométrico, como THe ensayo Dc proteína ^19, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con un espectrofotómetro ajustado a medir la absorbancia a 750 nm.
14. Normalizar la concentración de proteína de 2,5 mg / ml (o si las concentraciones son inferiores a 2,5 mg / ml, a normalizar a la muestra con la concentración de proteína más bajo) mediante la adición de PBS pH 8,5 + 0,4% de SDS, según sea necesario (por ejemplo, si las muestras son 5 mg / ml en 250 l, añadir 250 l de PBS pH 8,5 + 0,4% de SDS para obtener una concentración final de 2,5 mg / ml).

3. La fijación de la etiqueta fluorescente por Click Química para la visualización de las proteínas marcadas

1. Retire 40 l de lisado celular y la transferencia a un nuevo tubo de microcentrífuga. Mantener los lisados ​​restantes para la reacción con biotina-azida (etapa 4).
2. Añadir los siguientes reactivos en orden: 0,2 l fluor-azida (1 mM solución madre en DMSO), 0,58 l TCEP (madre 100 mM en agua con 4 equivalentes de NaOH añadido, preparado fresco), y 3,38 l TBTA (1.Foto 7 mM en una proporción de 4: 1 de t-butanol al DMSO). Vórtice para mezclar.
3. Añadir 1,14 l CuSO ₄ 5H ₂ O (50 mM en agua) para iniciar la reacción. Vortex brevemente e incubar a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad.
4. Añadir 50 l de tampón de muestra 2x SDS para extinguir la reacción. En este punto, ejecute las muestras directamente en un gel de SDS-PAGE ²⁰ para obtener los mejores resultados, o almacenar a -20 ° C durante la noche si es necesario.
5. Si la congelación de muestras, calentar durante 5 minutos a 95 ° C antes de cargar sobre el gel.
   NOTA: Como el peso molecular de la proteína diana es típicamente no se conoce en esta etapa, es aconsejable ejecutar 2 geles con diferentes concentraciones de acrilamida (es decir, 8% y 15%), o un gel de gradiente de rango de peso molecular amplia (es decir, 4-15%), para asegurar una cobertura completa del peso molecular.
6. Cuando el frente de colorante ha alcanzado el final del gel, continuar ejecutando el gel durante 5 minutos para asegurar todo el exceso de unreacted fluor-azida ha salido completamente el gel.
7. Quitar el gel a un recipiente con _ddH2O y se incuba durante 10 minutos con agitación suave, para quitar todo el exceso de fluor-azida.
8. Colocar el gel sobre una placa de vidrio y escanear el gel usando un escáner de gel Typhoon fluorescente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

4. La unión de biotina etiqueta de química modular para Affinity purificación de proteínas marcadas

1. De los lisados ​​restantes de la etapa 3.1, utilizar la cantidad máxima después de la normalización de proteína de tal manera que todas las muestras son el mismo volumen (por ejemplo, si después de la normalización a 2,5 mg / ml de los volúmenes de muestra resultantes son 500, 550, y 600 l, utilice 500 l de cada uno).
2. Pre-borrar los lisados ​​mediante la adición de 50 l perlas de estreptavidina agarosa de alta capacidad, 2x prelavada con PBS (pH 7,4). Incubar 1 hora a 4 ° C con rotación.
3. Sedimentar las perlas por centrifugación a 1000 xg durante 3 min. Retire tél sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga en hielo y desechar las cuentas.
4. Retire el 1-2% de la muestra DMSO a un nuevo tubo etiquetado como "entrada". Añadir un volumen equivalente de tampón de muestra 2x SDS y se almacena a -20 ° C.
5. Por cada 500 l de lisado, añadir los siguientes reactivos: 1,38 l biotina-azida (madre 10 mM en DMSO), 5,5 l TCEP y 32.5 TBTA l. Vórtice para mezclar.
6. Añadir 11 l de CuSO ₄ 5H ₂ O por cada 500 l de lisado y agitar brevemente. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
7. Añadir 4 volúmenes de muestra de acetona fría a -20 ° C. Vortex las muestras y se incuban durante la noche a -80 ° C para precipitar completamente las proteínas y quitar sin reaccionar biotina-azida.
8. Centrifugar las muestras a 17.000 xg durante 15 min a 4 ° C para sedimentar las proteínas precipitadas.
9. Aspirar el sobrenadante por completo, y resolubilizar las proteínas por sonicación en 150 l de PBS (pH 7,4) + 1% de SDS.
10. Añadir 600 l de PBS (pH 7,4) para diluir la concentración de SDS al 0,2%.
11. Añadir las muestras de 30 l de pre-lavados perlas de agarosa con estreptavidina de alta capacidad y se incuba 1 hora a 4 ° C con rotación.
12. Sedimentar las perlas por centrifugación a 1000 xg durante 3 min. Aspirar el sobrenadante que contiene las proteínas no unidas y descarte.
13. Añadir 1 ml de tampón de lavado (NaCl 400 mM, Tris 50 mM, 0,2% de SDS, pH 7,4) a las perlas y se incuba 5 min a temperatura ambiente con rotación.
14. Repita los pasos 4.12 y 4.13 3 veces.
15. Aspirar el tampón de lavado completo de las perlas, y añadir 30 l de tampón de muestra 2x SDS.
16. Incubar durante 5 minutos en un bloque de calor 95 ° C para liberar las proteínas de las perlas.
17. Centrifugar las perlas durante 1 min a 13.000 xg a la temperatura ambiente.
    NOTA: En este punto, las muestras se pueden almacenar a -20 ° C hasta que esté listo para funcionar SDS-PAGE. Si la congelación de muestras, calentar durante 5 minutos a 95 ° C antes de su uso.
18. Cuidadosamentepipeta de la muestra de amortiguación que contiene proteínas fuera de las perlas, y cargar en SDS-PAGE al ²⁰ (ver consideraciones importantes a continuación). Las perlas se pueden guardar para más adelante si es necesario re-ebullición.
    NOTA: Para la detección de proteínas por tinción de plata, se obtienen mejores resultados utilizando un gel de 1 mm de espesor. Si una banda es que ser cortada del gel teñido con plata para el análisis de espectrometría de masas (MS), preparar todos los reactivos frescos de soluciones estériles y dejar un vacío bien en entre las muestras en el gel. Por cada banda de cortar desde el carril de la sonda, una rebanada paralelo debería adoptarse desde el carril de DMSO de modo que las proteínas del fondo se pueden restar. Para la validación de la identificación de proteínas por Western blot, es fundamental para cargar también la muestra de entrada desde el paso 4.4 al ejecutar el gel de SDS-PAGE.
19. Sigue un protocolo estándar, ya sea para la tinción de plata o Western blot ^{21 22} para detectar la proteína (s) objetivo.

Resultados

Los resultados mostrados aquí se obtuvieron con una sonda de foto-afinidad del fármaco antifúngico itraconazol, el uso de que se ha publicado previamente ^16. Estos resultados demuestran el uso de la técnica de marcaje de fotoafinidad en vivo de células para identificar con éxito una importante proteína de unión itraconazol-como el 35 kDa proteína de membrana dependiente de la tensión del anión Canal 1 (VDAC1).

El pr...

Discusión

Diferentes enfoques para la identificación de los objetivos de moléculas pequeñas se pueden agrupar en dos categorías: de arriba hacia abajo, cuando se utilice el fenotipo celular del fármaco para reducir sus posibles objetivos sobre la base de sus funciones conocidas, o de abajo hacia arriba, donde el objetivo se identifica directamente por medios químicos o genéticos ^3. De arriba hacia abajo o estudios fenotípicos pueden identificar ciertos procesos celulares afectados por el fármaco (por ejemplo, ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)	Life Technologies	20490	Hacer fresco día de uso. Prepare 100 mM de caldo en agua con NaOH de 4 eq.
Tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metilo] amina (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Prepare un stock de 1,7 mM en una proporción de 4:1 de t-butanol a DMSO, almacene a -20   °C.
Sulfato de cobre (CuSO4• 5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Prepare 50 mM de caldo en agua, almacene a temperatura ambiente.
Biotina-azida	Click Chemistry Tools	AZ104-100	Prepare 10 mM de stock en DMSO, almacene en -20  °C.
Alexa Fluor 647-azida	Life Technologies	A10277	Prepare 1 mM de stock en DMSO, almacene a -20  °C.
Lámpara UV de 365 nm	Spectroline	FC100	deben usarse mientras están en funcionamiento.
Comprimidos inhibidores de la proteasa, sin EDTA	Roche Life Science	11873580001	Prepare la solución 50x en agua y almacene a -20  °C.
Sonicator	Branson	Sonifier 250	Conjunto de salida 1, servicio 30%.
Escáner de gel fluorescente	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Utilice láser rojo para detectar Alexa-fluor 647.
Kit de ensayo de proteínas Dc compatible con detergentes	Bio-Rad	5000112
perlas de agarosa estreptavidina de alta capacidad	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Glucosa media, baja	ThermoFisher Scientific	11885092
Suero fetal bovino, calificado	ThermoFisher Scientific	26140079
solución de penicilina/estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Tampón de muestra (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676