Viabilidad de las células de formación de imágenes en los andamios no transparentes - Usando el ejemplo de una novela de punto de titanio del implante

Summary

Aquí presentamos una técnica de imagen basada fluoróforo para detectar la viabilidad celular en un andamio de titanio no transparente, así como para detectar destellos de las impurezas del andamio. Este protocolo soluciona el inconveniente de la formación de imágenes célula-célula o célula-metálicos interacciones en los andamios no transparentes.

Abstract

La degeneración del disco intervertebral y la hernia discal son una de las principales causas del dolor lumbar. El agotamiento de la matriz extracelular, que culmina en la extrusión del núcleo pulposo (NP), conduce a la destrucción del disco intervertebral. Los tratamientos quirúrgicos disponibles actualmente reducen el dolor, pero no restauran la funcionalidad mecánica de la columna vertebral. Con el fin de preservar las características mecánicas de la columna vertebral, el reemplazo total del disco o núcleo se convirtió en un amplio interés. Sin embargo, esta era de la artroplastia aún se encuentra en un estado inmaduro, ya que ninguno de los productos existentes ha sido evaluado clínicamente.

Este estudio pretende probar la biocompatibilidad de un nuevo implante de núcleo hecho de hilos de titanio tejidos. A pesar de todas las ventajas mecánicas, el material tiene sus límites para el análisis óptico convencional, ya que el implante resultante no es transparente. Aquí presentamos una estrategia que describe la visualización in vitro, el seguimiento y las pruebas de viabilidad de las células osteocondro-progenitoras en el andamio. Este protocolo se puede utilizar para visualizar la eficiencia del protocolo de limpieza, así como para investigar la biocompatibilidad de estos y otros andamios no transparentes. Además, este protocolo se puede utilizar para mostrar el patrón de adherencia de las células, así como la viabilidad celular y las tasas de proliferación en/dentro del andamio. Este ensayo de prueba de biocompatibilidad in vitro proporciona una herramienta propicia para analizar la interacción célula-material en andamios no transparentes y opacos.

Introduction

dolor de espalda crónico es una enfermedad multifactorial. El interés en una opción de tratamiento mínimamente invasivo de la enfermedad degenerativa del disco ha crecido desde la década de 1950. Hasta hoy, la fusión multi-segmentaria de la columna vertebral es el tratamiento más ampliamente utilizado. Puesto que, este método conduce a menudo a las limitaciones en la movilidad del segmento afectado ^1,2, la exploración de la era de la artroplastia se convirtió en un amplio interés. Avances significativos en reemplazo de disco y el núcleo reemplazo total se ha convertido en una buena alternativa para tratar el dolor de espalda crónico ^1. A pesar de la enorme progreso, ninguno de los métodos ha sido clínicamente evaluado. Los implantes de núcleo menos rígidas representan una alternativa prometedora a la sustitución total de disco, a condición de que el anillo fibroso está intacto ^3,4. Sin embargo, los implantes actualmente presentes en el mercado núcleo se asocian a menudo con complicaciones como cambios en el cuerpo vertebral, dislocación, la pérdida de altura vertical del disco y camisetaque es necesario falta de rigidez mecánica asociada ^5. Con el fin de superar los inconvenientes actuales, una novela implante de núcleo hecha de alambres de titanio de punto se ha desarrollado con éxito ^6. Debido a la estructura de punto único, este andamio recién desarrollado ha mostrado características biomecánicas distinguidos, por ejemplo, característica de amortiguación, tamaño de poro, capacidad de carga y de fiabilidad ^7. Con el objetivo de probar la biocompatibilidad de este nuevo implante de núcleo, representado severas limitaciones en las técnicas de análisis (óptico) atribuidos a la naturaleza no transparente del implante.

Con el fin de probar la biocompatibilidad, la interacción de células de metal desempeña un papel destacado ^8-10. Una interacción entre las células y el andamio es necesario para la estabilización y, por tanto, para la mejor integración del implante en el sistema anfitrión. Sin embargo, una profundidad creciente crecimiento interno podría alterar las propiedades mecánicas del andamio. Con el objetivo de Invesgar si la superficie del andamio proporciona una base para la fijación celular, la proliferación y la diferenciación o si el metal afecta a la viabilidad celular, es importante para solucionar el problema común bien conocida de imágenes de células sobre / en andamios no transparentes y opacas. Con el fin de superar esta limitación varios fluorescente se exploraron técnicas basadas. Empresas ofrecen una amplia gama de fluoróforos para visualizar las células vivas, los compartimentos celulares, o incluso estados celulares específicos ^11. Fluoróforos para este experimento fueron seleccionados con la ayuda de la herramienta visor espectral en línea con el fin de adaptarse mejor a nuestro microscopio fluorescente.

La estrategia desarrollada para el análisis del comportamiento células adherentes sobre / en el andamio de titanio de punto no transparente implica lo siguiente: etiquetado 1) fluorescente (proteína verde fluorescente / GFP) de las células osteochondro-progenitoras para permitir el seguimiento de las células de la andamio, 2) la medición de la viabilidad (Mitoactividad mitocon-) de las células, y 3) la visualización de célula-célula y las interacciones célula-material dentro del andamio. El procedimiento tiene la ventaja de que puede ser transferido fácilmente a otras células adherentes y otros andamio no transparente u opaco. Además, la viabilidad y el patrón de crecimiento hacia el interior pueden ser monitoreados durante varios días, por lo que se puede utilizar con cantidades limitadas de material de soporte o de las células.

El presente estudio demuestra la utilización con éxito de nuestro protocolo actual para medir la viabilidad celular y visualizar el patrón de crecimiento de las células progenitoras osteochondro-sobre / en el andamio de titanio punto no transparente. Además, los protocolos desarrollados se podrían utilizar para determinar las impurezas de andamios y para comprobar los protocolos de limpieza.

Protocol

Se utilizaron Inmortalizado células precursoras mesenquimales del estroma humano (células SCP-1) para los experimentos: NOTA. Las células SCP-1 fueron proporcionados por el profesor Matthias Schieker ^12.

1. Ampliación del SCP-1 en las células

1. Antes de trabajar con las células SCP-1, limpiar correctamente la zona de trabajo (designado bioseguridad armario I) con guantes de 70% de etanol (v / v) de desgaste.
2. En la cabina de bioseguridad limpiado preparar un volumen apropiado de medio de cultivo celular mediante la mezcla de los componentes necesarios, como se indica en la Tabla 1. Con el fin de mantener la esterilidad del medio basal, añadir suplementos al pasar a través de filtros estériles con un tamaño de poro de 0,22 micras.
   1. Para evitar la contaminación, preparar el medio, al menos, 24 horas antes de su uso. Con el fin de comprobar su esterilidad, incubar 1 ml de medio en una placa de cultivo celular sin células en la incubadora de cultivo celular estándar: 37 ° C, 5% de CO _2, 20% O ₂ y 90% de humedad. Después24 horas, compruebe medio al microscopio utilizando una ampliación mínima de 200X.
3. Mantener SCP-1 en las células en una incubadora de cultivo celular estándar con la condición de apoyo: 37 ° C, 5% _CO2, 20% _{de O2} y 90% de humedad.
4. Para el mantenimiento y la expansión, crecer las células SCP-1 hasta que alcanzan el 80-90% de confluencia. Durante este período de tiempo la cultura, cambiar el medio cada 2-3 días. Al llegar a 80 a 90% de confluencia, dividir celdas SCP-1 (en general una proporción de 1: 2) a la siguiente paso para la expansión o la placa para los experimentos (como se indica).
5. Para la división de las células SCP-1, calentar el medio de cultivo a 37 ° C y descongelar tripsina / EDTA usando un baño de agua a 37 ° C.
6. Completamente aspirar el medio de cultivo de las células confluentes 80 a 90% y desechar en un contenedor de residuos.
7. Lavar las células al menos dos veces con DPBS (fosfato de Dulbecco solución salina tamponada sin magnesio y calcio, pH 7,2).
   1. Pipetear un volumen apropiado deDPBS sobre las células (5 ml de DPBS para un matraz de cultivo T75 y 12 ml para un matraz de cultivo T175).
   2. Aspirar DPBS cuidadosamente y desechar en un contenedor de residuos.
8. Pipetear un volumen apropiado de 0,25% de tripsina / EDTA a las células (1 ml de DPBS para un matraz de cultivo T75 y 2 ml de un matraz de cultivo T175) y se incuba durante 5 a 10 min a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular estándar con 5 % _CO2, 20% _{de O2} y 90% de humedad.
9. Desalojar las células golpeando ligeramente el vaso y asegurar que todas las células se separan del plástico de cultivo (tripsinización) mediante la observación de las células flotantes en el microscopio.
10. Inactivar la reacción de tripsina mediante la adición de 10 ml de medio de cultivo. Mezclar la tripsina y las células con el medio cuidadosamente mediante pipeteo repetido.
11. Transferir la suspensión celular en un tubo de reacción y se centrifuga a 600 xg durante 10 min a temperatura ambiente.
12. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml de cultivomedio.
13. Contar las células mediante el método de exclusión de azul de tripano como se describe en el protocolo 2.
14. Sembrar las células en función del diseño experimental.

2. Recuento de SCP-1 en las células

1. Realizar un recuento de células viables (método de exclusión de azul de tripano) de las células resuspendidas utilizando un hemocitómetro.
2. Antes del recuento de células, limpiar el hemocitómetro usando agua del grifo. Secar los componentes del hemocitómetro utilizando un paño sin pelusa. Ensamble que humedeciendo el vidrio de cubierta y presionándola inversamente en los dos corredores de vidrio en cada lado de la zona de recuento. Asegúrese de que los anillos de Newton se ven en los corredores de vidrio (Figura 1).
3. Tomar 10 l de las células resuspendidas y se mezcla con 10 l de solución de azul de tripano al 0,1% para obtener un factor de dilución de 2.
4. Carga de 10 l de la muestra total en la cámara de hemocitómetro pre-limpiado y montado.
5. Contar el número de vivo (células transparentes de color blanco /) y muerta(núcleos azules) células de los cuadrados de 4x4 (véase la Figura 1B).
6. Calcular el número total de células después de la fórmula dada:
   

3. La transfección de GFP SCP-1 en las células

NOTA: Con el fin de observar SCP-1 de crecimiento celular encendido y en el armazón de titanio punto durante un cierto período de cultivo que marcamos las células con la proteína fluorescente verde (GFP). La sobreexpresión de GFP se consigue por la infección con partículas de adenovirus que codifican para GFP. De replicación incompetente (-E1 / -E3) partículas de adenovirus que codifican para la proteína verde fluorescente (GFP) se utilizaron para infectar células SCP-1. Las partículas de virus se obtuvieron del Prof. Steven Dooley ¹³ mediante la recopilación de sobrenadante de cultivo de adenovirus recombinante (Ad5-GFP) las células HEK293T transfectadas (de laboratorio de Bioseguridad II). Tres repetidos de congelación (-80 ° C) y descongelación (37 ° C en el baño de agua) ciclos garantiza que no HEK293T células permanecen viables para producir nuevas partículas virales. El uso de este lote de semillas, adenovirus pueden infectar eficazmente las células SCP-1 sin producir nuevas partículas virales. De este modo, las células infectadas se pueden manejar en un laboratorio de bioseguridad I.

1. Resuspender las células diana (células SCP-1) con una densidad de siembra de 50.000 células / ml en medio de cultivo. Pipeta 2 ml por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos.
2. Incubar a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular estándar; 5% de CO _2, 20% O ₂ y 90% de humedad, hasta que las células SCP-1 alcanzar una confluencia del 70-80%.
   NOTA: confluencia depende de la densidad de siembra de las células. Para las condiciones anteriormente indicadas, las células SCP-1 alcanzan una confluencia del 70-80% en 1,5-2 días.
3. A una confluencia del 70-80%, sin aspirar el medio de cultivo se añaden 100 l de la reserva de semillas adenovirus por 1 ml de medio de cultivo.
   1. Determinar la gama de concentración individualmente en función de la cantidad de partículas de virus en cada virus seed preparación de la pasta. En caso de que la eficacia de la infección es demasiado baja, purificar y concentrar las partículas de virus usando varios kits disponibles en el mercado.
4. Incubar durante una hora en la incubadora de cultivo celular estándar a 37 ° C (5% _CO2, 20% _{de O2} y 90% de humedad).
5. Se elimina el medio de cultivo que contiene la semilla madre de virus y recogerlo para su eliminación. Añadir medio de cultivo fresco 2 ml por pocillo de una de 6 pocillos de cultivo de la placa para reponer.
   1. Asegúrese de que antes de su eliminación, partícula de virus que contiene el medio se trata en autoclave.
6. Evaluar la expresión de GFP intracelular (eficiencia de infección) 24 horas después de la infección usando un microscopio de fluorescencia con un conjunto de cubo / filtro de LED GFP.
   1. Observar la morfología de las células (Figura 2). Las células se separe del plástico de cultivo pueden dar resultados falsos positivos.

4. Limpieza de tejidos de punto de titanio andamios

1. PAGencaje hasta 5 andamios en un tubo de reacción de 50 ml.
2. Lavar el andamio (6-7 mm de espesor) tres veces con 30 ml de agua destilada-desionizada durante 20 min a temperatura ambiente, usando las condiciones de rotor (8 xg).
3. Sustituir el agua destilada desionizada con 30 ml 1% (w / v) de Triton-X-100 (disuelto en agua destilada-desionizada) y lavar los andamios de una vez por 20 min a temperatura ambiente, usando las condiciones de rotor (8 xg) .
4. Descartar la solución de Triton-X-100, seguido de lavado con 30 ml de agua destilada-desionizada dos veces (5 min cada uno a temperatura ambiente) el mantenimiento de las condiciones de rotor (8 xg).
5. Reemplazar el agua destilada-desionizada. Enjuague el secuencialmente andamios con calidad de reactivo 99% de acetona, 99% de isopropanol y 99% de etanol (30 ml cada uno) para 2 x 5 min cada uno en un baño de ultrasonidos (~ 50 Hz, 50 W, 220 a 240 V).
6. Lavar de nuevo tres veces con 30 ml de agua destilada-desionizada durante 5 min, manteniendo constante el tratamiento de baño ultrasónico.
7. Coloque el ScaffoLDS en un paño libre de pelusa con el fin de aire durante la noche seco a temperatura ambiente.
8. Autoclave el andamio durante 15 min a 121 ° C con 15 psi.
9. Para confirmar el protocolo de limpieza por fluorescencia indirecta como se describe en el protocolo 5.

5. Estructuras de imágenes por fluorescencia indirecta del andamio

NOTA: El presente protocolo describe la obtención de imágenes de las estructuras de andamios por fluorescencia indirecta utilizando el sulfordamina B fluoróforo que da una fluorescencia de color rojo brillante en una longitud de onda ex / em de 565/586 nm. Sin embargo, el fluoróforo se puede cambiar a un mejor ajuste para la configuración de microscopio dados o posible auto-fluorescencia del andamio.

1. Preparar la solución de tinción sulfordamina B (0,04%) en ácido acético al 1% y se almacena a temperatura ambiente con protección de la luz.
2. Tome una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se sumerja el andamio limpiado en 500 l de la solución de tinción sulfordamina B colocándolo inside los bien utilizando fórceps.
3. Capturar las imágenes negativas del andamio mediante microscopio de fluorescencia.
   1. Tomar fotos con un cubo / filtro de LED RFP conjunto con una longitud de onda de excitación de 531/40 nm y una longitud de onda de emisión de 593/40 nm. Alternativamente elegir la excitación y la emisión de longitud de onda adecuada con la ayuda del espectador espectral de fluorescencia ^20. Sulfordamina B tiene su pico de excitación a 578 nm y su pico de emisión a 593 nm.
   2. Con el fin de visualizar la estructura del andamio, tomar fotografías con aumentos inferiores, por ejemplo, 4X o 10X (Figura 3). El uso de estas imágenes, determinar las características, por ejemplo, el tamaño de poro y la forma con la ayuda de la ImageJ.
   3. Con el fin de detectar impurezas de andamios, tomar fotografías a ampliaciones superiores, por ejemplo, 20X o 40X, teniendo en cuenta que esto limitará la profundidad de análisis. Asegúrese de que la suciedad partículas / sustancias que no se ven (ver resultados representativos; la figuraure 3).

Ensayo 6. En Vitro Biocompatibilidad

1. Pre-calentar el medio de cultivo a 37 ° C en un baño de agua.
2. Tome una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos y el uso de fórceps, colocar los andamios limpiados y esterilizados en cada pocillo de ensayo asépticamente. Trabajar bajo la cabina de bioseguridad previamente limpiadas Me!
3. Remojar / incubar los andamios con un medio de cultivo durante aproximadamente 15 min (500 l por pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos), con el fin de eliminar el aire desde el interior del andamio.
4. Mientras tanto, resuspender 500.000 células SCP1 Ad-GFP-infectados en 1 ml de medio de cultivo.
5. Después de 15 minutos de remojo andamio, aspirar el medio completamente fuera del andamio.
6. Para sembrar las células en el andamio, prescindir de 100 l de suspensión celular con cuidado en el andamio (que se coloca en la placa de 24 pocillos) de superficie. Mantener un volumen mínimo de suspensión de células, mientras que la siembra de las células, de modo de garantizar fluye ningún medio out del andamio.
7. Se incuban las células durante 30 min a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular estándar (5% de CO _2, 20% O ₂ y 90% de humedad).
8. Añadir 500 l más medio de cultivo y se incuba durante 24 horas en la incubadora de cultivo celular estándar (37 ° C, 5% _CO2, 20% _{de O2} y 90% de humedad).
9. Evaluar el patrón de la adhesión celular y la propagación de células en la superficie del andamio usando un microscopio de fluorescencia.
   1. Tomar fotos con un cubo / filtro de LED GFP conjunto con una longitud de onda de excitación de 470/22 nm y una longitud de onda de emisión de 510/42 nm. Alternativamente elegir la excitación adecuada y longitud de onda de emisión con la ayuda del espectador espectral de fluorescencia. GFP tiene su excitación máxima a 488 nm y su emisión pico a 507 nm.
   2. Con el fin de visualizar adherencia de las células de captura de imágenes patrón a aumentos inferiores, por ejemplo, 4X o 10X (Figura 4). Con el fin de observar la propagación de células una revista de altoSe necesita nification (al menos 100X) - la limitación de la profundidad de enfoque.
10. Para evaluar aún más la propagación de células en la superficie del andamio, fijar las células con formalina al 4% y proceder con la tinción convencional de fluorescencia de las estructuras celulares, por ejemplo, los filamentos de actina (faloidina). Sin embargo, adaptar los tiempos de incubación y el marcaje fluorescente de los anticuerpos con el fin de adaptarse a las características de andamio individuales, por ejemplo, tiempos de difusión o auto-fluorescencia ^14.
11. El día siguiente, cambiar el medio de cultivo para eliminar las células no adherentes.
12. Calcular el porcentaje de células adherentes en el andamio por resazurina medición de conversión como se describe en el protocolo 7.

Figura 5: Cronología de ensayo in vitro (A) Montaje experimental para el recubrimiento de las células.. (B Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Conversión de medición resazurina

NOTA: ensayo de conversión de resazurina se usa para medir la actividad mitocondrial y la proliferación celular por lo tanto indirectamente. Reducción de la resazurina a resorufina genera una señal fluorescente, que se basa en la actividad mitocondrial asociada con el número de células viables (Figura 7A).

1. Completamente aspirar el medio de cultivo de las células SCP-1 y desecharlo en un recipiente de residuos.
2. Se lavan las células SCP-1 una vez con DPBS para eliminar células desprendidas. Añadir 500 DPBS mu l por pocillo de la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos que contenía células SCP-1 en el andamio.
3. Cubrir las células con un am requeridoporte de la solución de resazurina de trabajo estéril (0,25% resazurina en medio de cultivo) y se incuba a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular estándar (5% de CO _2, 20% O ₂ y 90% de humedad) durante 30 min.
   1. Tome nota de que; tiempo de incubación depende del tipo de célula y la densidad celular. Puede variar entre 10 min y 6 hr. tiempo de incubación optimizado para las células SCP-1 es de 30 min.
4. Como control de fondo, incluir al menos un bien con la solución de trabajo de resazurina pero sin células, que se incuba a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular estándar (5% de CO _2, 20% O ₂ y 90% de humedad) para el mismo cantidad de tiempo.
5. Transferir 100 l condicionados sobrenadante de cada pocillo de la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos en una placa de 96 micropocillos.
6. Lavar las células restantes tres veces con 1 ml de DPBS para 5 min a temperatura ambiente con el fin de eliminar la solución de trabajo resazurina residual. Después del tercer lavado añadir medio de cultivo to los implantes con células SCP-1 (500 l por pocillo de la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos) y se continúa la incubación a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular estándar (5% de CO _2, 20% O ₂ y 90% de humedad) en las medidas de curso temporal.
   1. Asegúrese de configurar réplicas en este paso (2-4) con el fin de reducir al mínimo los errores de pipeteo.
7. Mientras tanto, colocar la placa de 96 micropocillos en el lector de microplaca y medir la fluorescencia de la resorufina formado.
   1. Con el fin de reducir la señal de fondo, medir la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 545 nm y una longitud de onda de emisión de 585 nm.
   2. Alternativamente elegir la excitación adecuada y longitud de onda de emisión con la ayuda del espectador espectral de fluorescencia. Resorufina tiene su pico de excitación a 572 nm y su pico de emisión a 585 nm. La intensidad de la señal dada es un promedio de 25 lecturas individuales (25 flashes por pocillo).
8. Medir el fluorescence de resorufina formado en medio condicionado, utilizando una óptica inferior.
   1. Tome nota de que, la ganancia depende de la cantidad promedio de resazurina convierte y puede variar entre 10 y 4.000. Ajustar la ganancia en el lector de microplacas individual utilizada pipeteando una curva estándar de resorufina, de manera que la señal fluorescente está por debajo de 80% de la intensidad máxima de la señal detectable (en este caso 20000). La ganancia optimizada para las células SCP-1 es 800.
9. Restar la señal de fondo (resazurina solución de trabajo sin células) a partir de la señal de las muestras de ensayo.
10. Dependiendo de la configuración experimental / propósito, proceda con los pasos:
11. Calcular el porcentaje de viabilidad de las células en el andamio utilizando una curva estándar. Hacer una curva estándar individual por separado para cada línea celular utilizada.
12. Analizar el crecimiento / proliferación celular mediante la estimación del aumento relativo en la conversión de la resazurina durante todo el tiempo de cultivo. Para este cálculo, expuestasla conversión resazurina en el día 1 como referencia. Recién preparar la solución de trabajo de resazurina para este tipo de análisis. Además, los tiempos de incubación tienen que ser iguales entre las diferentes mediciones.
13. Repetir todo el protocolo de medida de conversión de resazurina al menos tres veces para obtener resultados consistentes.

8. La tinción vivo-muerto

1. Placa de las células Scp1 en el andamio con una densidad de siembra de 50.000 células / andamio y permitir que crezca en el andamio de mantenimiento de las condiciones de cultivo celular estándar (consulte el protocolo 1 y 2).
2. Después de 24-48 hr aspirar completamente el medio de cultivo de las células SCP-1 y desechar en un contenedor de residuos.
3. Se lavan las células SCP-1 una vez con DPBS para eliminar células desprendidas. Añadir 500 DPBS l por pocillo de la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente.
4. Manchas SCP-1 usando fluoróforos (las tres manchas al mismo tiempo):
   1. De ahora en adelantemantener a los andamios en la oscuridad con el fin de proteger el blanqueo fluoróforos de la luz del día!
   2. Establecer un tiempo de incubación de 30 min con el fin de permitir la distribución igual en todo el andamio. Si la transferencia a otros andamios, asegúrese de optimizar los tiempos de incubación para adaptarse a las características individuales de andamio (tamaño de poro, la profundidad de andamios, etc.).
   3. Con el fin de detectar células viables en el andamio, teñir las células con calceína AM a una concentración final de 2 mM (en medio de cultivo).
   4. Con el fin de detectar todas las células en el andamio, teñir las células con Hoechst 33342 a una concentración final de 0,002 g / l (en medio de cultivo).
   5. Con el fin de detectar las células muertas, incubar el andamio con homodímero de etidio a una concentración final de 4 mM (en medio de cultivo).
5. Después del tiempo de incubación, se lavan las células 3 veces con DPBS (1 ml por pocillo) para cada 5 min a temperatura ambiente.
6. Inmediatamente tomar la fotos mediante el uso de un microscopio de fluorescencia.
   1. Tomar fotografías de la calceína (células vivas) con un conjunto de cubo / filtro de LED GFP (excitación y emisión de longitud de onda de 470/22 nm y 510/42 nm, respectivamente). Alternativamente elegir una excitación adecuada y longitud de onda de emisión con la ayuda del espectador espectral de fluorescencia. Calceína tiene su excitación máxima a 488 nm y su emisión pico a 507 nm. Nota: Asegúrese de no utilizar las células transfectadas GFP para la tinción de fluorescencia con calceína u otras manchas fluorescentes verdes.
   2. Tome fotografías de los Hoechst 33342 con DAPI LED cubo / juego de filtros con una longitud de onda de excitación de 357/44 nm y una longitud de onda de emisión de 447/60 nm. Alternativamente elegir la excitación adecuada y longitud de onda de emisión con la ayuda del espectador espectral de fluorescencia. Hoechst 33342 tiene su excitación máxima a 347 nm y su pico de emisión a 483 nm.
   3. Tome fotografías del homodímero de etidio con un conjunto de LED RFP cubo / filtro (la excitación y la longitud de emisión of 531/40 nm y 593/40 nm, respectivamente). Alternativamente elegir la excitación adecuada y longitud de onda de emisión con la ayuda del espectador espectral de fluorescencia. Homodímero de etidio tiene su pico de excitación a 530 nm y su pico de emisión a 618 nm.

Results

Los resultados preliminares mostraron que la novela implante de núcleo descrito no sólo tiene buenas características de amortiguación, pero también es biocompatible con células SCP-1. Durante el proceso de producción del implante, que entra en contacto con sustancias fuertemente corrosivos y tóxicos (lubricante, solución mordiente, electro-pulido). Con la ayuda de técnicas de tinción de inmunofluorescencia indirecta hemos sido capaces de visualizar impurezas restantes y en consecuencia o...

Discussion

La superficie de andamio juega un papel importante en su interacción con el tejido circundante in vivo determinando de ese modo los implantes durabilidad funcional. Por lo tanto, la biocompatibilidad del andamio se estudió mediante ensayos in vitro usando células (línea celular SCP1), cuando se siembran en los andamios.

técnicas de microscopía que funcionan bien con andamios fino y ópticamente transparentes, son poco adecuados para los andamios no transparentes para estudia...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6/24/48 placas de pocillos, matraz de cultivo T25/ T75	Greiner Bio-One GmbH	*
* Placas de 24 pocillos	Greiner Bio-One GmbH	CELLSTAR 662 160
* 48 placas de pocillos	Corning Incorporated USA	3548
* 6 placas de 6 pocillos	Falcon	353046
* T25	Greiner Bio-One GmbH	690 175
* T75	Greiner Bio-One GmbH	658 175
Ácido acético, purum > 99.0%	Carl Roth	3738.4
Acetona	Carl Roth	5025.1
Axioplan-2	Carl Zeiss, Alemania
Cabinas de seguridad biológica	Thermo Scientific	safe 2020
Calceína acetoximetil éster (calceína AM)	Sigma	17783
Aglutinante de incubadora de cultivos celulares	, Tuttlingen, Alemania	9040-0078
Unidad de filtro (0,22 y micro; m)	Millipore, IRL	SLGP033RS
Centrífugas 5810 R y 5417 R	Thermo Fisher Scientific, NY	Megafuge 40R
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Carl Roth	4720.2
Dulbecco' s PBS sin Ca & Mg	Sigma	H15-002
Etanol 99%	Producto líquido SAV. GmBH	475956
Homodímero de etidio	Sigma	46043
EVOS Sistema de imagen de fluorescencia	Life technologies	AMF4300
Suero fetal bovino (FCS)	Gibco	10270-106
Hemocitómetro	Hausser Scientific, PA, EE. UU
Hoechst 33342	Sigma	14533-100MG
Implante de núcleo de titanio tejido	Buck co & KG,Alemania
MEM Modificación Alfa con Glutamina sin nucleósido	Sigma	E15-832
Omega Lector de microplacas	BMG Labtech,Alemania	FLUOstar Omega
Penicilina/Estreptomicina	Sigma	P11-010
Sal sódica de Resazurina	Sigma	199303-1G
Sulforhodamina B sal sódica	Sigma	S1402-1G
Rotador de tubo de ensayo	Labinco B.V.,Países Bajos	Modelo LD-76
TRIS (hidroximetil) aminometano	Carl Roth	AE15.1
Tritón	Carl Roth	3051.2
Azul Trypan 0.5%	Carl Roth	CN76.1
Tripsina/EDTA	Sigma	L11-004