Drosophila y sistemas hematopoyético de mamíferos comparten muchas características comunes, por lo que la Drosophila un modelo genético atractivo para estudiar la hematopoyesis. Aquí se demuestra la disección y el montaje de los principales órganos hematopoyéticos larvas para inmunohistoquímica. También describimos métodos para ensayar diversos compartimentos hematopoyéticas larvas incluyendo circulantes hemocitos y células de cristal sésiles.
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Artículo de método
Métodos para examinar los nódulos linfáticos y en los hemocitos
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Resumen
Resumen
Existen muchos paralelismos entre los sistemas hematopoyético de mamíferos Drosophila y, a pesar de que carecen de la Drosophila linaje linfoide que caracterizan a la inmunidad adaptativa de los mamíferos. Drosophila y la hematopoyesis de mamíferos ocurren en fases distintas espacial y temporalmente para producir varios linajes de células sanguíneas. Ambos sistemas de mantenimiento de reservorios de células progenitoras de sangre con la que se ensanchan o se reemplazan los linajes maduros. El sistema hematopoyético permite Drosophila y mamíferos para responder y adaptarse a los desafíos inmunes. Es importante destacar que los reguladores transcripcionales y vías de señalización que controlan la generación, el mantenimiento, y la función del sistema hematopoyético se conservan de las moscas a los mamíferos. Estas similitudes permiten Drosophila que se utilizará para el desarrollo hematopoyético genéticamente modelo y la enfermedad.
Aquí ensayos detalle para examinar el sistema hematopoyético de las larvas de Drosophila. Enen particular, se describe métodos para medir el número de células de la sangre y la concentración, visualizar un linaje maduro específica in vivo, y llevar a cabo la inmunohistoquímica en células de la sangre en circulación y en el órgano hematopoyético. Estos ensayos pueden revelar cambios en la expresión génica y los procesos celulares, incluyendo la señalización, la supervivencia, la proliferación y la diferenciación y pueden ser utilizados para investigar una variedad de cuestiones relativas a la hematopoyesis. En combinación con las herramientas genéticas disponibles en Drosophila, estos ensayos se pueden utilizar para evaluar el sistema hematopoyético en alteraciones genéticas definidas. Aunque no específicamente descrito aquí, estos ensayos también se pueden usar para examinar el efecto de las alteraciones ambientales, tales como la infección o de la dieta, en el sistema hematopoyético.
Introducción
Los complejos mecanismos que regulan los factores de transcripción y vías de señalización que coordinan el desarrollo del sistema hematopoyético y que funcionan mal en las enfermedades hematológicas siguen siendo poco conocidos. Estos factores de transcripción y vías de señalización, así como su regulación, están altamente conservadas entre Drosophila y mamíferos hematopoyesis 1-5. De este modo el sistema hematopoyético Drosophila representa un modelo genético excelente para definir los mecanismos moleculares que controlan la hematopoyesis y enfermedades hematológicas subyacentes.
De manera similar a los mamíf....
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Protocolo
1. Concentración de circulación Hemocyte
- Para obtener larvas de más o menos la misma etapa de desarrollo para este ensayo, restringir la recolección de huevos al permitir que las hembras ponen huevos que durante un período de tiempo fijo de 2 - 6 horas.
- Recoger las larvas en la disección de los pozos plato lleno de fosfato 1x solución salina tamponada (PBS, Tabla 1).
- Para cada larva, colocar 10 l 1x PBS en un tubo de microcentrífuga en hielo y 10 l 1x PBS sobre una almohadilla de disección limpia. Coloque la almohadilla de disección estereoscópico en una base iluminada.
- Secar una larva del individuo colocándol....
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Resultados
La concentración circulante Hemocyte
Números hemocitos aumentan en todo el desarrollo larval 35. Para ilustrar que este método detecta diferencias en el número de hemocitos y concentración, independientemente de la causa biológica, medimos las concentraciones de hemocitos de larvas retardada y no retardada. La pérdida de la hormona protoracicotrópica (PTTH) mediante la ablación genética de las neuronas productoras de P.......
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Discusión
Tras la alteración genética o ambiental, los cuatro métodos descritos aquí pueden ser utilizados individualmente o en combinación para analizar procesos distintos durante la hematopoyesis, tales como señalización, la supervivencia, la proliferación y la diferenciación de Drosophila hematopoyesis es un proceso dinámico.; el número de hemocitos por animal aumenta 35 y la expresión de genes y la estructura de la glándula de linfa cambia 32 durante el desarrollo. Antes de realizar estos ensayo.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia o financieras.
Agradecimientos
Agradecemos a Matthew O'Connell, Maryam Jahanshahi y Andreas Jenny por su ayuda. Agradecemos a István Andó por los anticuerpos específicos contra plasmatocitos, a Utpal Banerjee por las moscas domo-meso-EBFP2, a Julian Martinez-Agosto por las moscas antp>GFP y a Michael O'Connor por las moscas ptth y ptth>grim. Estos métodos se desarrollaron con el apoyo de la Fundación Kimmel, la Sociedad de Leucemia y Linfoma, el R01CA140451 de los NIH/NCI, el 1257939 NSF, el DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059 y el T32CA078207 de los NIH/NCI.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| PBS comprimidos | MP Biomedicals | 2810305 | |
| plato de disección | Tubo de | 7220-85 | |
| Denville | C2170 | ||
| , fabricada con el kit Sylgard 184 | Krayden (distribuido a través de Fisher) | NC9644388 (Número de catálogo de Fisher) | Fabricado en placa de Petri mezclando los componentes del kit de elastómero Sylgard de acuerdo con las instrucciones del fabricante. |
| microscopio estereoscópico | Morrell Instruments (distribuidor Nikon) | MNA42000, MMA36300 | Modelos Nikon SMZ1000 y SMZ645 |
| toallita de tejido | VWR | 82003-820 | |
| pinza | Electrónica Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 | pipeta Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Contador de células automatizado | Invitrogen | C10227 | |
| Portaobjetos para cámara de recuento de células Countess | Hemocitómetro Invitrogen | C10283 | |
| Hausser Scientific | 3200 | ||
| tinción azul de tripano | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehído | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| albúmina sérica bovina | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| suero de cabra normal | Sigma | G9023-10ML | |
| suero de burro normal | Sigma | D9663-10ML | |
| etanol de 200 pruebas | VWR | V1001 | |
| Galato de N-propilo | MP Biomedicals | 102747 | |
| glicerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) | Fisher | 62248 | |
| Placa de 6 pocillos | Corning | 351146 | |
| placa de 12 pocillos | Corning | 351143 | |
| cubreobjetos de vidrio, cuadrado de 22 mm | Fisher | 12-544-10 | |
| cubreobjetos para microscopio, 18 mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| portaobjetos de microscopio de vidrio | Fisher | 22-034-980 | |
| termociclador | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient |
| S tubos de PCR | EE. UU. Scientific | 1402-2700 | |
| placa de 24 pocillos | Corning | 351147 | |
| pipeta de transferencia desechable | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescencia microscopio | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
Referencias
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M. Drosophila haematopoiesis. Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).
- Crozatier, M.....
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