La visualización y cuantificación de la Capa libre de células en las arteriolas del músculo cremáster Rata

Summary

Este estudio demuestra la preparación quirúrgica del músculo cremaster de rata para la visualización de la capa libre de células in vivo. En este estudio se discuten factores considerables que afectan la precisión de la medición del ancho de la capa libre de celdas.

Abstract

La capa libre de células se define como la capa de plasma parietal en el flujo de microvasos, que está desprovista de glóbulos rojos. La medición de la anchura de la capa libre de células in vivo y sus variaciones espacio-temporales puede proporcionar una comprensión completa de la hemodinámica en la microcirculación. En este estudio, utilizamos un sistema microscópico intravital junto con una cámara de video de alta velocidad para cuantificar los anchos de capa libre de células en arteriolas in vivo. El músculo cremaster de las ratas Sprague-Dawley se exteriorizó quirúrgicamente para visualizar el flujo sanguíneo. También se desarrolló un script de imagen personalizado para automatizar el procesamiento de imágenes y el análisis del ancho de la capa sin celdas. Este enfoque permite la cuantificación de las variaciones espacio-temporales de manera más consistente que las mediciones manuales anteriores. Sin embargo, la precisión de la medición depende en parte del uso de un filtro azul y de la selección de un algoritmo de umbral adecuado. En concreto, evaluamos el contraste y la calidad de las imágenes adquiridas con y sin el uso de un filtro azul. Además, comparamos cinco algoritmos diferentes de umbral basados en histogramas de imágenes (Otsu, mínimo, intermodo, selección iterativa y umbral entrópico difuso) e ilustramos las diferencias en su determinación del ancho de la capa libre de celdas.

Introduction

Los estudios in vivo en animales son fundamentales para la ciencia básica para comprender la fisiología y la patología humanas. En particular, los estudios microhemodinámicos in vivo pueden dilucidar el posible deterioro de las funciones microcirculatorias alteradas por condiciones reológicas anormales de la sangre. En varios estudios microhemodinámicos^previos1 se ha utilizado el modelo de músculo Cremaster de rata para visualizar el flujo sanguíneo microvascular. El músculo cremaster es una capa delgada de músculo estriado que rodea los testículos. Por lo tanto, el flujo sanguíneo en el músculo se puede visualizar con un microscopio de iluminación trans mediante exposición quirúrgica. Esto nos permite adquirir las imágenes de flujo sanguíneo in vivo sin el uso de agentes de fluorescencia o contraste. Además, toda la perfusión sanguínea de la red muscular se puede controlar reduciendo el flujo sanguíneo ascendente con la oclusión de la aorta abdominal². Debido a estas ventajas, el modelo de músculo cremaster ha sido ampliamente utilizado para investigar la formación de capas libres de células (CFL) en microvasos^1,3.

El ancho CFL es un parámetro hemodinámico prominente en la microcirculación, que ha sido de gran interés por sus importantes funciones en la regulación de las funciones microcirculatorias. La CFL se forma por la migración transversal hacia adentro inducida por cizallamiento de los glóbulos rojos (RBC) hacia el centro de flujo⁴. En consecuencia, esta migración conduce al agotamiento de los glóbulos rojos cerca de las paredes de los vasos, lo que finalmente resulta en una capa de plasma libre de células. En consecuencia, la CFL parietal se convierte naturalmente en una barrera de difusión para el suministro de oxígeno (_O2) desde el núcleo de los glóbulos rojos a los tejidos, y para la eliminación de óxido nítrico (NO) por los glóbulos rojos^5,6. Además, la producción de NO también puede ser modulada por las variaciones dinámicas de la anchura de la CFL^7,8. Por lo tanto, es necesario determinar completamente el papel de la CFL tanto en el transporte de gas como en la regulación de la homeostasis en la microcirculación para comprender mejor el flujo sanguíneo en la microcirculación. Estudios recientes se han centrado en tender puentes entre las funciones hemodinámicas y de transporte de gases de la CFL en la microcirculación^9-12. Además, un conjunto separado de estudios también ha investigado cómo la elevación patológica en la agregación de glóbulos rojos modula la formación de CFL y su efecto sobre la biodisponibilidad de O₂ y NO en los tejidos^13,14.

Las funciones de la CFL se vuelven más significativas en la microcirculación, donde el tamaño relativo de la anchura de la CFL con respecto al diámetro del vaso es prominente. Esto requiere un enfoque eficaz para cuantificar el flujo sanguíneo in vivo de las CFL. En particular, la adquisición y el análisis de imágenes son los dos componentes clave que determinan la precisión de la medición del ancho CFL. La visualización exitosa del flujo sanguíneo tisular debe ir precedida de una preparación quirúrgica adecuada del modelo animal. Además, se necesita una técnica de análisis de imagen adecuada para superar las limitaciones de las mediciones manuales convencionales que en su mayoría son inducidas por errores humanos^15,16. Con los avances en la instrumentación óptica y la potencia de cálculo para el procesamiento digital de imágenes, ahora es posible lograr una medición más precisa y consistente del ancho CFL^17-19. No obstante, la precisión de estas mediciones, al estar basadas en imágenes, depende en última instancia de la calidad de las imágenes.

Por lo tanto, este estudio explora los factores que influyen en la medición del ancho de CFL in vivo. Nos centramos particularmente en la demostración de la preparación quirúrgica y el análisis de imágenes digitales para las mediciones de la anchura de las CFL en las arteriolas del músculo cremaster de rata.

Protocol

Este estudio está de acuerdo con la Universidad Nacional de Singapur Institucional Cuidado de Animales y el empleo (protocolo aprobado ninguna. R15-0225).

1. Preparación quirúrgica del modelo animal

1. los lúmenes de los vasos
   1. Anestesiar a ratas macho Sprague-Dawley (6 - 7 semanas de edad) con un peso (203 ± 20) g con ketamina (37,5 mg / ml) y xilazina (5 mg / ml) cóctel a través de inyección intraperitoneal (ip) (2 ml / kg) . No vuelva a tapar la aguja o quitarlo de la jeringa después de la inyección.
   2. Una vez que el animal ha sido anestesiado (confirmado por los pies pellizcos), colocarlo sobre una almohadilla térmica para mantener su temperatura corporal a 37 ° C. afeitarse suavemente el pelo en la escápula, el cuello uterino anterior, parte baja del abdomen, pierna trasera medial y el saco escrotal. frenar suavemente las piernas utilizando cintas adhesivas de papel.
   3. Realizar todos los procedimientos quirúrgicos con tijeras de microdisección y pinzas en ángulo mientras observa a travésun microscopio estereoscópico. Coloque todos los instrumentos quirúrgicos cortantes en una bandeja resistente a la punción para evitar lesiones durante la cirugía.
   4. Fregar todos los sitios quirúrgicos 3 veces alternando con yodo y alcohol al 70% antes de realizar la incisión. Enjuague todos los catéteres con 30 solución de heparina-solución salina IU / ml.
   5. Hacer un 1-1,5 cm incisión en la piel en la línea media en las escápulas usando un par de tijeras quirúrgicas sobre la vena yugular derecha. Separar la fascia mediante disección roma para exponer la vena yugular y canular con un tubo de polietileno (PE-50) lleno de solución salina de heparina usando suturas de seda 5-0. Infundir anestesia suplementaria cuando sea necesario (1/3 a 1/2 de la dosis inicial, intravenosa (iv)) durante el curso de la cirugía y el experimento.
   6. Realizar traqueotomía para mantener la permeabilidad de la vía aérea. Hacer un 1 - 1,5 cm de la incisión en la zona cervical anterior. Canular la tráquea utilizando un tubo de polietileno (PE-205) con suturas de seda 2-0 para asegurar el catéter en su lugar.
   7. Vigilar la presión arteriala través de la canulación de la arteria femoral. Hacer un 1 - 1,5 cm incisión en la superficie medial izquierdo de la pata trasera. Separar la arteria femoral mediante disección roma. Canular la arteria femoral con un tubo de polietileno (PE-10) lleno de solución salina de heparina usando suturas de seda 5-0.
2. Cremaster músculo Preparación y flujo de visualización
   1. Inserte una sutura de seda 5-0 a través del vértice del saco escrotal para extenderla. Hacer una incisión a lo largo de la superficie ventral del saco escrotal. Regularmente aplicar solución caliente isotónica (37 ° C; pH 7,4) al músculo expuesto.
   2. Retire rodea los tejidos conectivos cuidadosamente ya fondo con un aplicador con punta de algodón.
   3. Inserte una sutura de seda 5-0 a través del ápice del músculo cremáster. Cortar la sutura en dos piezas de igual longitud y un nudo en cada lado. Cortar el músculo entre los dos nudos y se extienden sobre una plataforma de plexiglás transparente personalizado tirando suavemente de la sutura. Fijarel extremo de la sutura a la plataforma con la tachuela azul.
      NOTA: la eliminación general de los tejidos conectivos que rodea es fundamental para determinar un contraste de imagen óptima.
   4. 1.2.3 repita el paso hasta que se hagan de 5 a 6 fijaciones. Retirar con cuidado el músculo cremáster del epidídimo utilizando cauterio alta temperatura. Superfuse solución isotónica caliente al músculo expuesto para prevenir la deshidratación del tejido.
      1. Rodea el músculo cremáster con piezas plegadas de gasa. Cubrir el músculo expuesto con una película de polivinilo. Las piezas de gasa con la película forman una cubeta poco profunda para contener solución isotónica caliente para el objetivo del microscopio de inmersión en agua (Figura 1A).
   5. Transferir el animal en el escenario animal de un microscopio intravital (Figura 1C). Conectar la canulación arterial a un sistema de adquisición de datos fisiológicos de control de la presión continua (Figura 1E).
   6. Mantener la temperat muscularure a 35 ° C con un elemento de calentamiento fijado debajo de la plataforma de los animales (Figura 1B). Colocar una sonda de temperatura al lado del músculo para proporcionar retroalimentación negativa para el controlador de potencia del elemento de calentamiento (Figura 1D).
   7. Dejar al animal en el escenario durante 15 min se equilibre con el medio ambiente.
   8. Visualizar el flujo sanguíneo en un microscopio intravital con un objetivo de inmersión en agua de 40X y un condensador de trabajo larga.
   9. Elija una arteriola no ramificado (<60 micras), basado en un enfoque de la imagen clara y el contraste entre el núcleo de glóbulos rojos, paredes CFL y de los vasos, con el fin de enfocar el microscopio en el plano diametral del vaso sanguíneo. Girar la cámara montada en el microscopio para alinear verticalmente la pared del vaso.
   10. Registrar el flujo de sangre usando una cámara de vídeo de alta velocidad a una velocidad de 3.000 / seg durante 1 seg. Guardar el vídeo grabado en formato AVI sin comprimir en escala de grises de 8 bits para preservar la calidad de la imagen.
       NOTA: Se recomienda una velocidad mínima de fotogramas de grabación de 3.000 cuadros / seg para garantizar que la medición CFL se puede realizar al menos una vez por RBC en condiciones de flujo arteriolar fisiológicas.
   11. Utilice un filtro azul con pico de transmisión a una longitud de onda de 394 nm y de paso de banda espectral a 310 - 510 nm para mejorar el contraste entre los glóbulos rojos y plasma.
       NOTA: Asegúrese de que el espectro de la luz que pasa a través del filtro azul de la fuente de luz microscópico (100 W lámpara halógena) es de baja intensidad de la luz para evitar cualquier daño tisular potencial.
   12. Al final del experimento, la eutanasia a los animales con una sobredosis de pentobarbital sódico.

2. Análisis de Imagen

1. Procesamiento previo para la medida de ancho CFL
   1. Abra MATLAB y ejecute el archivo 'CFL_pre.m'. (Este y otros archivos de MATLAB se puede encontrar en elip "> Suplementario Archivo MATLAB.)
   2. Haga clic en "Abrir archivo" para seleccionar el archivo de vídeo para analizar.
   3. Ajuste el deslizador hacia la "rotación" para alinear verticalmente las paredes de los vasos.
      NOTA: Los usuarios pueden visualizar las líneas de la cuadrícula de asistencia para la alineación buque seleccionando el botón de opción 'Guía On', y ajustar el nivel de zoom de la imagen deslizando el control deslizante "Zoom".
   4. Haga clic en el botón "Confirmar Editar 'para confirmar la alineación del vaso.
   5. Haga clic en el botón 'Set ROI de cultivo "para definir la región de interés (ROI). La imagen alineada se mostrará en una ventana emergente. Ajustar el objetivo rectangular en la imagen y haga doble clic para confirmar el retorno de la inversión. Omitir este paso si no se requiere el recorte de la imagen.
      NOTA: solo incluye un solo barco en el retorno de la inversión para analizar el ancho de CFL del recipiente. Haga clic en el botón "Reiniciar Imagen" para restaurar la imagen a su forma original, si es necesario.
   6. Haga clic en el9; 'botón para extraer todos los fotogramas de vídeo editado en imágenes de mapa de bits consecutivos (en escala de grises de 8 bits' Extraer imágenes en formato BMP '). Las imágenes extraídas se pueden encontrar en la carpeta con el mismo nombre que el archivo de vídeo seleccionado.
2. La medición de la anchura de CFL
   1. Abra MATLAB y ejecute el archivo 'CFL_measure.m'.
   2. Haga clic en "Seleccionar carpeta" para seleccionar la carpeta que contiene las imágenes extraídas.
   3. Haga clic en la carpeta que contiene las imágenes y haga clic en "Seleccionar carpeta". El primer cuadro de imagen en la carpeta se carga y se muestra en el panel de "Escala de grises imagen ', junto con su gris histograma de intensidad en el panel' del histograma '.
   4. Seleccione el cuadro de imagen que desee en el cuadro de lista para realizar el análisis, de lo contrario se seleccionará el primer cuadro de la imagen.
   5. Haga clic en "Encontrar paredes de los vasos 'para identificar la pared del vaso interno en la imagen, que se determina en el lugar donde laperfil de intensidad de luz tránsitos pico de oscuro a claro más de dos píxeles.
   6. Check 'filtro de mediana' para aplicar un filtro de mediana a la imagen para reducir el ruido "sal y pimienta".
   7. Consultar "Contraste automático" para ajustar las intensidades de imagen digital para mejorar el contraste de la imagen.
   8. Seleccione un algoritmo de umbral en el cuadro de lista que determina automáticamente un valor de umbral (τ) que divide los niveles de gris en dos clases - los píxeles blancos con niveles de gris por encima τ (CFL), y los píxeles negros con niveles de gris por debajo de τ (RBC básicos).
      NOTA: Como un método alternativo, el uso de umbralización manual si ninguno de algoritmo de umbral automatizado proporciona una umbralización imagen correspondiente. Haga clic en el botón de opción "Manual" y ajustar el control deslizante para definir el valor de umbral manual.
   9. Para medir la variación espacial de los anchos de CFL, introduzca la resolución de píxeles en el cuadro 'píxeles de resolución' (la resolucióncon esta configuración experimental fue 0,42 m / píxel).
   10. Haga clic en el botón "Calcular" para obtener la variación espacial de los anchos de CFL. Haga clic en ".csv Exportar 'para exportar los datos de anchura CFL en un formato tabulado.
   11. Para medir la variación temporal de los anchos de CFL en una línea de análisis específico a lo largo del recipiente, haga clic en el botón de opción 'Variación temporal' e introduzca la información de velocidad de fotogramas (la frecuencia de imagen utilizada en este sistema experimental fue de 3.000 cuadros / seg).
   12. Introduzca el primer fotograma y el último fotograma de las imágenes para el análisis de las cajas 'de comienzo de trama "y" último cuadro', respectivamente.
   13. Seleccione la posición de la línea de análisis a lo largo del buque deslizando la barra deslizante 'Análisis de línea ». Confirmar la posición de la línea de análisis, que se ilustra en tanto la 'Escala de grises imagen' y 'la imagen binaria'.
   14. Haga clic en "Calcular" para obtener la variación temporal de los anchos de CFL. Click 'Exportar CSV "para exportar los datos de anchura CFL en un formato tabulado.

Results

La visualización de la CFL in vivo depende en gran medida de las preparaciones quirúrgicas de la animal. pérdida excesiva de sangre o la duración de la cirugía prolongada se puede someter al animal a golpes y aberraciones del flujo sanguíneo. El mantenimiento de la temperatura del tejido usando una almohadilla de calefacción, así como una plataforma personalizada durante la cirugía y el experimento también es crucial para el mantenimiento de las condiciones fisiológicas de la rata. Mediante el uso de una lámpar...

Discussion

La medición de la anchura CFL es esencial para una mejor comprensión de la hemodinámica en la microcirculación. En particular, la medición de las anchuras CFL se ha realizado en mesentérica ^6, spinotrapezius ²⁴ y cerebrales ²⁵ microcirculations. La medición convencional de la in vivo anchuras CFL se restringió a estimaciones por la inspección manual de los fotogramas de vídeo grabadas. Las mediciones manuales requieren el cálculo del promedio de varios fotogramas de vídeo sucesi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio intravital	Olympus	BX51WI	Equipo
Cámara de alta velocidad	Photron	1024PCI	Equipo
Filtro azul	HOYA	B390	Equipo
Sensor de presión y sistema biopac	Sistema Biopac	TSD104A, MP100	Equipo
Controlador de temperatura	Shimaden	SR 1	Equipo
Plasma Lyte A	Baxter	NDC:0338-0221	Caliente en 37 ° C baño de agua antes de usar
solución salina 0.9%	Braun
Heparina (5,000 UI/ml)	Tubo de
PE-10	Becton Dickinson	427400.024	" OD x .011" ID
Tubo de polietileno PE-50	Becton Dickinson		427411.038" OD x .023" ID
Tubo de polietileno PE-205	Becton Dickinson		427446.082" OD x .062" ID
2-0 sutura de seda no absorbible	Deknatel	113-S
5-0 sutura de seda no absorbible	Deknatel	106-S
Almohadilla térmica de circulación de agua	Gaymar
Baño de agua	Fisher Scientific	Isotemp 205	Equipment Gasa
de algodón estéril	Fisher Scientific	22-415-468
Aplicadores con punta de algodón	Fisher Scientific	23-400-124
Pinzas Dumont	Kent Scientific	INS14188	Instrumento quirúrgico
Pinza de microdisección	Kent Scientific	INS15915	Instrumento quirúrgico
Pinza de iris 1 x 2 dientes	Kent Scientific	INS15917	Surgical instrumento
Pinza de canulación de vasos	Kent Scientific	INS500377	Instrumento quirúrgico
Micro tijera	Kent Scientific	INS14177	Instrumento quirúrgico
Tijera de iris	Kent Scientific	INS14225	Instrumento quirúrgico
Clip para vasos	Kent Scientific	INS14120	Instrumental quirúrgico
Gemini	Braintree Scientific	GEM 5917	Instrumento quirúrgico