Aquí presentamos un protocolo que facilita la caracterización funcional de rendimiento medio a alto de construcciones de genes y promotores en tejido de tallo secundario de árbol dentro de marcos de tiempo comparativamente cortos. Es eficiente, fácil de usar y ampliamente aplicable a una variedad de especies de árboles.
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Artículo de método
El uso de Inducida somática Análisis del Sector (ISSA) para el estudio de genes y promotores implicados en la formación de la madera y el desarrollo del tallo Secundaria
En este artículo
Resumen
Resumen
el crecimiento del tallo secundario en los árboles y la formación de madera asociados son significativos tanto desde las perspectivas biológica y comercial. Sin embargo, se sabe relativamente poco sobre el control molecular que regula su desarrollo. Esto es en parte debido a la física, los recursos y las limitaciones de tiempo a menudo asociados con el estudio de los procesos de crecimiento secundario. Un número de técnicas in vitro se han utilizado implica ya sea parte de la planta o sistema de toda la planta, tanto en leñosas y especies de plantas no leñosas. Sin embargo, las preguntas sobre su aplicabilidad para el estudio de los procesos de crecimiento de los tallos secundarios, la obstinación de ciertas especies y la intensidad del trabajo son a menudo prohibitivos para el medio a aplicaciones de alto rendimiento. Además, cuando se mira en la formación y el desarrollo del tallo secundario de la madera los rasgos específicos bajo investigación sólo podría llegar a ser medible tarde en el ciclo de vida de un árbol después de varios años de crecimiento. Al abordar estos retos alternativa in vivo protocols se han desarrollado, llamado inducido somática análisis del sector, lo que implica la creación de sectores de tejidos somáticos transgénicos directamente en el tallo secundario de la planta. El objetivo de este protocolo es proporcionar un medio eficaz, fácil y relativamente rápido para crear tejido vegetal secundario transgénicos para genes y caracterización funcional promotor que puede ser utilizado en una gama de especies de árboles. Los resultados presentados aquí indican que los sectores secundario del vástago transgénicas se pueden crear en todos los tejidos vivos y tipos de células en tallos secundarios de una variedad de especies de árboles y que la madera rasgos morfológicos, así como los patrones de expresión promotor en tallos secundarios se pueden evaluar fácilmente la facilitación de medio a alto caracterización funcional rendimiento.
Introducción
Troncos de los árboles comprenden una cantidad significativa de la biomasa y los planetas son de gran importancia biológica, cultural y comercial. Tallos secundarios crear hábitat proporcionando recursos y refugio para muchas otras formas de vida. Ofrecen muchos otros servicios de los ecosistemas que habitan y actúan como un recurso renovable para la producción de madera, pulpa y papel y otros productos madereros y no madereros. el desarrollo del tallo secundaria y la formación más específicamente la madera se rige por el sistema complejo molecular que regulan el desarrollo de determinados tipos de células, la composición bioquímica de sus paredes celulares y la forma en que se organizan para formar tejidos y órganos. La disección de las bases moleculares del desarrollo del tallo secundaria y formación de la madera es confundida por muchos factores, incluyendo la variabilidad de la madera y madre de propiedades dentro y entre los tallos, largos tiempos de generación, sistemas de apareamiento capaz de fecundación, alta heterocigosidad, de alta carga genética, inactividad estacional, a largo maduroperíodos de establecimiento de rasgos y el tamaño físico requerido por los árboles maduros. Como resultado de ello, la comprensión del desarrollo del tallo secundario en relación con el conocimiento detallado de la mayoría de los otros aspectos del control molecular del desarrollo de la planta, se encuentra todavía en su infancia.
Una serie de técnicas in vitro se han utilizado para estudiar y comprender el desarrollo del tallo secundario, en particular, la madera y la formación de la pared celular secundaria. Estos protocolos implican el uso de sistemas de parte de la planta de toda la planta o, cuando se crean cualquiera de las plantas transgénicas o células secundarias específicas o tejidos se transforman para el estudio de aspectos específicos de la madera y / o el desarrollo del tallo secundario 1. Las plantas transgénicas se pueden recuperar transformación posterior genético de una amplia variedad de tejidos de plantas y tipos de células, sin embargo, el progreso es lento, particularmente cuando se analizan rasgos de fibra de madera debido a la larga la regeneración y el vástago tiempos de maduración (en el orden de años), alta técnica y Deman laboralds, el bajo rendimiento de los genes candidatos, así como las dificultades en la propagación de algunas especies de plantas leñosas. Técnicas similares se han desarrollado en el modelo de sistema no leñosas tales como Arabidopsis que superar con éxito algunas de estas limitaciones, pero no todos los tipos de células madre secundaria un presente en estos tallos y rasgos relacionados con la estacionalidad o la longevidad no pueden ser estudiados en dichas especies 2. Alternativamente, los sistemas de parte de la planta, tales como cultivos de callos radiata Pinu s 3 reducen los marcos de tiempo asociados. Sin embargo, estos métodos están limitados al estudio de un tipo de célula individual y sufren limitaciones similares como se ha indicado para los experimentos in vitro. Del mismo modo, las culturas madre apical 4 implican explantes enteros madre han demostrado ser prometedores pero hasta el momento no se han aplicado para el estudio de los genes o promotores específicos de interés. Más recientemente, un protocolo alternativo que implica cultivos de raíces peludas se ha desarrollado para eucaliptos y ha sido con éxitoaplicó 5, sin embargo, este método todavía requiere de cultivo in vitro, implica raíces secundarias en lugar de tallos y hasta la fecha se limita a una sola especie arbórea.
Inducida análisis sector somática (ISSA), como se describe aquí, se ha desarrollado para superar algunos de estos problemas proporcionando un medio a alto rendimiento herramienta de cribado funcional para genes y promotores con sospecha de papeles en la formación de madera y el desarrollo del tejido del tallo secundario. ISSA es un sistema de transformación y el cribado in vivo que fue desarrollado para reducir el tiempo necesario para producir las células y tejidos transgénicos en un vástago secundario intacta, mientras que la superación de la mano de obra, las limitaciones técnicas y de rendimiento de forma rutinaria usados en métodos in vitro. Los protocolos descritos aquí permiten la creación simultánea de cientos de sectores y células de tejido transformadas independientemente en tallos secundarios dentro de un corto período de tiempo, en las especies de árboles y tejido de interés sin gEnetic variación y / o ambiental dentro de plazos relativamente cortos y mano de obra barata. Técnicas de la AISS en vivo se describió por primera vez para la secundaria del vástago 6 y el brote 7 tejidos y desde entonces han ido perfeccionando en el tejido del tronco secundario a través de estudios de los genes y / o promotores implicados en la diferenciación cambial e incluyen: tubulina (TUB) 8, arabinogalactano fasciclina como ( FLA) 9, celulosa sintasa (CESA) 10, célula de dominio NAC pared asociada secundaria (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 y realmente interesante nuevo gen de proteína (ANILLO) H2 13. Estos estudios fueron realizados en secundaria tallos de las plantas de álamo y eucalipto y proporcionó información sobre la morfología celular, la química de la pared celular y la expresión génica.
Los protocolos descritos aquí están destinadas a reunir a la experiencia de unand conocimientos adquiridos a través del desarrollo y aplicación de la AISS de una serie de estudios publicados y no publicados en la última década. Se centran en la transformación in vivo de los tejidos del tronco secundario 6 y se concentran en estudios con el clon 'piramidal' Populus alba, Eucalyptus globulus, así como 11 de Eucalyptus camaldulensis clones globulus x. Este documento toma investigadores a través del protocolo desde el cultivo de plantas y bacterias, transformación de los tejidos del tallo, crecimiento y cosecha de los tejidos, la identificación de las células y los tejidos transgénicos, preparación para las evaluaciones fenotípicas y métodos para la recogida y análisis de datos. Mientras que las técnicas con éxito se han aplicado para medir la composición de monosacáridos de la pared celular también 9,11, debido a limitaciones de espacio, este documento se centra en técnicas utilizadas para la célula de medida y la morfología del tejido y la comprensión de los patrones de expresión de genes en st secundariaems solamente. De acuerdo con ello, el protocolo como se describe es adecuado para aquellos que buscan obtener más conocimientos sobre la función y / o expresión de genes relacionados con tallos secundarios usando un bajo costo, técnicamente fácil, y medio a método de alto rendimiento.
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Protocolo
1. Preparación de material vegetal
- Antes de la experimentación, recaudar nuevas plántulas de las especies de árboles preferidos de la semilla o el corte y hacer crecer el árbol / s hasta que el diámetro del tallo en la zona destinada a la experimentación es de aproximadamente 1 cm de diámetro.
Nota: El tiempo necesario puede variar debido a las tasas de crecimiento de las plantas, por lo tanto permiten que entre tres y nueve meses de este paso.
2. Creación del vector binario
- Llevar a cabo el trabajo de esta sección a la sección 7 en un laboratorio o invernadero donde Agrobacterium tumefaciens se pueden manejar y que el equipo de protección personal adecuado prescrito por el laboratorio se usa.
- Preparar un vector binario que contiene ya sea un gen de interés o knockdown casete de sobreexpresión y un reportero casete del gen β-glucuronidasa (GUS) o un promotor de interés fusionada a un gen GUS en función del tipo de estudio.
Nota: Hay una serie de BAC vector binariokbones que pueden ser de origen en el mercado o a través de redes de investigación, así como numerosas técnicas disponibles para insertar genes y promotores de interés en vectores binarios. En el contexto de este protocolo es hasta el experimentador para tomar la decisión sobre cómo crear un vector binario. - Transformar vector binario en una cepa desarmada de A. tumefaciens mediante electroporación o de choque térmico 14 y almacenar apropiadamente hasta que se necesite para la experimentación.
- Repita el paso 2.2 para cualquier positivo y / o controles negativos.
Nota: Los controles negativos deben incluir un vector binario que contiene no gen de interés de un gen de interés y un estudio de GUS sin promotor por un promotor de estudio interés. control positivo para un promotor del estudio de interés debe incluir un promotor 35S del virus mosaico de la coliflor (CaMV35s) fusionado a un reportero GUS.
3. Preparación de A. tumefaciens para la inoculación
- Al menos una semana antes de la experimentation, tomar una pequeña cantidad (aproximadamente 1 l) de A. tumefaciens preparado durante el paso 2.2 y 2.3 y diluirse en medio LB agar independiente con 14 placas que contienen los antibióticos apropiados para la selección bacteriana. Crecer a 28 ° C en una incubadora para formar pequeñas colonias y luego se almacena a 4 ° C hasta que se necesite.
- 48 horas antes de la experimentación, la transferencia de una colonia de A. tumefaciens de cada placa en separadas 50 ml tornillo superior tubos que contenían 5 ml de pre-calentado (28 ° C) medio LB 14 que contiene los antibióticos apropiados para la selección bacteriana y agitar a 200 rpm en un incubador agitador durante aproximadamente 48 horas a 28 ° C hasta mezcla es muy nublado.
- Entre 4-6 horas antes de la inoculación de tallos de plantas (sección 4) añadir 1 ml de LB / A. mezcla de Agrobacterium en un fresco 50 ml tornillo tubo superior que contiene 19 ml (dilución 1:20) de reciente caliente (28 ° C) medio LB con los antibióticos adecuados paraselección bacteriana. Si la densidad óptica (DO) a 600 nm (OD 600, medido por espectroscopia) está por encima de 0,1, se diluye adicionalmente con cálido LB hasta que esto se logra.
- Coloque diluida LB / A. tumefaciens mezcla de nuevo en el incubador agitador y agitar en las mismas condiciones (200 rpm, 28 ° C) hasta que OD 600 es de entre 0,4 hasta 0,6 y quitar.
- Centrifugadora LB / A. tumefaciens mezcla durante 15 minutos a 1.000 x g y 4 ° C.
- Se decanta el líquido y volver a suspender de inmediato A. tumefaciens sedimento en 1 ml de medio MS enfriada 15, transferir a 2 ml microtubo y almacenar en hielo hasta que se requiera para la inoculación (sección 4). Esta solución se conoce como inoculación de medios.
4. La inoculación del tallo de la planta con A. tumefaciens
- Iniciar la experimentación a finales de primavera o principios de verano el uso de plantas creadas en el apartado 1 que tienen un cambium activo y de rápido crecimiento. Un buen diagnóstico para unacambium de crecimiento activo y rápido es que el floema se puede despegar fácilmente del xilema.
- Encuentra una sección recta clara del tallo cerca de la base de la planta y quitar las hojas y ramas.
- El uso de un escalpelo afilado (preferiblemente N ° 11) u hoja de afeitar, crear un 1 cm "ventana cambial '2 en una sección libre del vástago mediante la introducción de dos incisiones paralelas vertical a través del floema de 20 mm de longitud y un 5 mm entre sí y luego una corte horizontal que conecta los dos cortes verticales en su extremo basal.
- Peel la tira floema creado por la incisión hacia arriba la exposición del tejido xilema desarrollo y añadir suficiente inoculación de medios de la etapa 3.6 para mojar la superficie del xilema desarrollo expuesta utilizando una pipeta (típicamente 5 a 10 l). Inmediatamente vuelva a insertar la tira floema.
- Obligar a la tira de floema al vástago firmemente con Parafilm.
- Repetir los pasos 4.2 a 4.5 para ventanas adicionales del cambium para el gen (s) o promotor (s) de interés creando unany ventanas nueva cámbiales menos 1 cm por encima o por debajo de otras ventanas del cambium y en un 90 ° al eje.
- Complete los pasos 4.2 a 4.5 para los vectores de control positivo y negativo (paso 2.4), lo que garantiza que cada vector se añade a la misma raíz de cada planta usada en el experimento.
- Controlar el crecimiento del tallo de diámetro periódicamente y la cosecha para el ensayo de GUS (sección 5) cuando el crecimiento radial de al menos 5 mm se ha observado en los tallos.
Nota: La cantidad de crecimiento radial necesaria depende de la cantidad de tejido necesario para el análisis aguas abajo.
5. La cosecha para GUS histológico Ensayo
- Impuestos Especiales de la "ventana cambial 'del tallo eliminación de cualquier tejido que no forma parte de un nuevo crecimiento dentro de la ventana del cambium.
- Para los estudios relativos a madurar xilema y morfología de las células / tejidos del floema, pelar el floema del xilema.
- Para los estudios de los que se requiere la zona cambial permanecer patrones de expresión intactos o promotor se van a evaluared, cortar la ventana cambial transversalmente usando una cuchilla de afeitar u otra cuchilla afilada en forma de discos de entre 0,5 y 1 mm de espesor.
- Coloque los tejidos de la ventana del cambium procesados en 14 ml redondas tubos de fondo y enjuague dos veces en tampón fosfato 0,1 M a pH 7 14. Asegúrese de que el tejido está completamente sumergido, permanece en solución durante al menos cinco minutos y el exceso de solución se elimina al final de el segundo enjuague.
- Añadir 5 ml de reactivo de GUS (0,5 mM X-gluc (ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónico), EDTA 10 mM, 0,5% X-100 v / v, potasio Triton 0,5 mM ferricianuro (III), ferrocianuro de potasio 0,05 mM (II), hasta el volumen final con 0.1 mM de tampón de fosfato de pH 7; ver. Hawkins et al 16) a cada tubo. Si el tejido no está completamente sumergida, añadir el reactivo de GUS adicional.
- Incubar los tubos durante 10 min a 55 ° C en la oscuridad.
- Incubar los tubos para un adicional 12 a 16 h en un incubador agitador a 37 ° C en la oscuridadusando agitación suave (entre 30 y 60 rpm) para permitir la mezcla.
- Tras la retirada de la incubadora agitador verificar al azar el pH del reactivo de GUS en un pequeño subconjunto de tubos con papel de tornasol con un rango de pH 0-7.
- Si cualquiera de los tubos tienen un pH inferior a 6 a continuación, etiquetarlos. Continuar para comprobar el resto de los tubos que confirmar pH y la etiqueta si el pH es 6 o menos.
Nota: Las muestras con un pH inferior a 6 pueden no ser adecuados para el análisis. Estas muestras tienen que ser excluidos del análisis adicional.
- Si cualquiera de los tubos tienen un pH inferior a 6 a continuación, etiquetarlos. Continuar para comprobar el resto de los tubos que confirmar pH y la etiqueta si el pH es 6 o menos.
- Decantar reactivo GUS y reemplazar con suficiente etanol al 70% para cubrir el tejido.
- Almacenar a 4 ° C hasta que se necesite.
6. Identificación de Transgenic Tissue
- Con unas pinzas, sacar todo el tejido cambial la ventana de un tubo y colocar en pequeña bandeja o placa de Petri para permitir la visualización microscópica.
- El uso de un microscopio de disección entre 1X y 4X de aumento, identificar y contar el número de células o tejidosque tienen una coloración azul brillante. Las células teñidas de azul o tejidos se conocen como un sector desde este punto en adelante. Cuenta de ellos en las siguientes maneras.
- Para muestras en las que el floema se ha eliminado (paso 5.1.1), cuente el número de sectores en el tejido cambial encuentra en la superficie del xilema en desarrollo (sector cambial, Figura 1a).
- Para las muestras que han sido cortadas en discos (etapa 5.1.2), contar los sectores número encontrado en los diferentes tipos de células o tejidos (Figura 1b, 1c, 1d). Sectores se pueden encontrar en los siguientes tipos de tejido: la peridermis (sector Peridermo, la figura 1e), el floema (sector del floema, Figura 1f), el tejido cambial (sector cambial, Figura 1g, 1h, 1i), el parénquima de la herida (herida parénquima Sector, Figura 1j) y en las tílides (sector Tylose, Figura 1k).
- Durante una microscópicaEVALUACIÓN asegurar que ambos lados de un disco han sido consultados y que los sectores que se producen a través de dos discos están emparejados de modo que los números no son exagerados.
- Coloque sectores sólo el tejido que contiene de nuevo en el tubo que contiene 70% de etanol y almacenar hasta que se necesiten.
- Repita el paso 6.1 a 6.3 de las ventanas del cambium adicionales, incluyendo el control positivo y / o negativo.
- Calcular el promedio de eficiencia de transformación para cada tipo de sector para cada gen o promotor de interés y los controles por separado dividiendo el número total de sectores por el número total de 1 cm 2 ventanas del cambium para derivar una Cantidad promedio de transformación de Eventos por cm 2 de Cambium inoculado (ATScm -2).
- Continúe con el paso 7.2 y 8 para el análisis de los patrones de expresión del promotor y del paso 7.1, 7.2 o 7.3 para técnicas para evaluar la morfología del tejido celular y en el tejido cambial.
7. Análisis deMorfología de células y tejidos en el tejido cambial
Nota: la siguiente son una selección de técnicas que se han utilizado con éxito para el análisis de ISSA deriva muestras.
- Análisis de área de xilema célula, área de la luz, el espesor de la pared celular y el área de la pared celular usando microscopía electrónica de barrido (SEM).
Nota: Este protocolo requiere una preparación mínima de la muestra y permite un relativamente alto rendimiento de análisis del sector en relación con los rasgos morfológicos descritos.- A partir de este paso adelante, por favor asegúrese de bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes se utilizan cada vez está siendo manejado y tratado tejido leñoso.
- Identificar un sector cambial para el análisis y hacer una incisión de aproximadamente 0,5 mm a cada lado de ella utilizando una única cuchilla de afeitar borde para crear un disco (Figura 2a).
- Se quita el exceso de tejido xilema dejando aproximadamente 1 mm de tejido xilema en el lado tangencial del sector (Figura 2b).
- CuidadosoLy cortada transversalmente a través del centro del sector utilizando una hoja de afeitar de doble filo fresco (Figura 2c).
- Hacer dos incisiones poco profundas radiales adicionales en el plano de cada lado de sector transversal para demarcar el tejido transgénico (Figura 2d). Como GUS tinción no penetrará profundamente en el tejido a lo largo de seguir los archivos radiales de células a cada lado del tejido manchado que se encuentra en la superficie del cambium.
- Coloque la cara sector cambial preparado hasta el escenario de un talón de pasador de montaje usando SEM SEM cinta conductora (Figura 2e) y mantener en el desecador hasta que sea necesario para la visualización SEM.
- Repita los pasos 7.1.2 a 7.1.6 para todos los sectores adicionales, incluyendo los del control negativo.
- El uso de un SEM en un modo de bajo vacío (energía de 5 kV, el clavo 3,0 nm), visualizar y tomar fotos de las células / tejidos dentro del sector, así como las células / tejidos directamente adyacente al sector (Figura 2f). La cantidad de magnificacióndepende de las características de interés. Para las fibras del xilema, 2,000x es adecuado (Figura 2g).
- Una vez que un sector de la cambial se ha visualizado y fotografías tomadas con un aumento de su caso, medir xilema de células / tejidos rasgos morfológicos de interés utilizando el software de medición de imagen.
- Para el análisis estadístico, realizar múltiples parejas análisis utilizando pruebas t pareadas para comparar la diferencia entre morfológica medida en el sector de transgénicos y los no transgénicos control de las células / tejidos adyacentes (medida a menos de 0,5 mm del borde de sector) para cada sector para determinar una p -valor.
- Repita el paso 7.1.10 para el control negativo.
- En los casos en que el control positivo muestra un bajo valor de p (α <0,05), calcular la diferencia entre la transgénico y adyacente células no transgénicas / tejido para un rasgo morfológico. Utilice este "valor de la diferencia 'en una prueba t no pareada para comparar el efecto del gen de interés con la negative control para determinar un valor de p.
- El análisis histoquímico de los patrones de células del cambium / o morfología de los tejidos de expresión promotor en las células madre / tejidos, utilizando microscopía de luz.
Nota: Si bien el consumo de más tiempo, este método permite más opciones de análisis que incluyen aspectos de la dinámica del cambium, por ejemplo, anchura cambial, así como los patrones de expresión promotor. Además, si no puede acceder a un SEM, este protocolo se puede utilizar como una alternativa para el paso 7.1.- Sector de los impuestos especiales de interés utilizando hoja de afeitar y parte del tejido circundante como pequeños bloques (no mayor de 1 mm 3) y colocarla directamente en 1-3 ml de etanol al 100% en un vial de muestra con tapón de rosca durante al menos 2 días a 4 ° C en un agitador. Preparar el pequeño bloque de una manera que permitirá la superficie de interés que se accede por un microtomo.
- Repita el procedimiento con otros sectores, incluidos los de control negativo.
- Eliminar el líquido y reemplazar con 25% de etanol: 75% mezcla blanca LR durante 2 días, manteniendo las condiciones.
- Repita el paso 7.2.3 con etanol al 50%: 50% blanco LR, etanol al 25%: 75% LR blanca y finalmente dos veces con blanco LR 100%.
- Coloque pequeño bloque de Incorporación de molde con la superficie de interés alineado con el extremo corto y cubrir cuidadosamente con blanco fresco LR y polimerizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Cortar 5 micras secciones de la superficie de interés en un micrótomo rotatorio y montar en un portaobjetos de vidrio. Utilice safranina O (0,01%) tinción para visualizar la pared celular y / o otras características.
- Añadir medio de montaje, coloque una hoja de cubierta y permita que se asiente durante la noche.
- Ver bajo un microscopio de luz entre la imagen de captura de 100X y 600X aumentos y.
- Captar los caracteres morfológicos de las imágenes utilizando el software de medición imagen.
- Para el análisis estadístico de los rasgos morfológicos cuantitativos, una continuación de la etapa 7.1.10.
- Para el análisis cualitativo de los rasgos morfológicos,comparar y describir los patrones observados para el gen o el promotor de interés y el negativo y / o control positivo.
- Análisis de microfibrillas de ángulo (MFA) en las fibras triturados mediante microscopía de luz.
- Impuestos Especiales transgénico xilema tejido directamente de un sector, así como de los tejidos no transgénicos adyacente a ella (a menos de 0,5 mm, la figura 2h) y el lugar en distintos tubos de 1,5 ml. Repita el procedimiento con otros sectores, incluidos los de control negativo.
- Complete los pasos 7.3.3 a 7.3.5 en una campana de humos.
- Añadir 250 l de peróxido de hidrógeno y 250 l de ácido acético glacial a cada tubo.
- Coloque el tubo en el bloque térmico a 90 ° C durante 2 horas en la campana de humos.
- Extraer tejido de tubos y enjuagar cuidadosamente con agua destilada al menos dos veces.
- El uso de un medio de montaje soluble en agua, montar el tejido sobre un portaobjetos de vidrio y desmenuzar con pinzas cortantes antes de fijar una hoja de cubierta.
- Verbajo un microscopio de luz y de captura de imágenes de fibras individuales con una ampliación mayor de 400X.
- Para determinar el ángulo de microfibrillas de fibras, medir el ángulo entre las aberturas de pozo y / o estriaciones de la pared celular y el eje largo de la fibra (figura 2i) utilizando software de medición imagen.
- Para el análisis estadístico, una continuación de la etapa 7.1.10.
8. Análisis de patrones de expresión del promotor
- Análisis del promotor de patrones de expresión en los tejidos del tronco secundario.
- Tally la frecuencia de cada tipo de sector para el promotor de interés, así como los controles positivos y negativos como se ha indicado en el paso 6.2.2.
- Comparar la frecuencia de los diferentes tipos sector para el promotor de interés con el control positivo mediante pruebas de Chi-cuadrado para establecer los valores de p. Un análisis más detallado de la especificidad de la célula / tejido puede llevarse a cabo mediante el punto 7.2 como se requiere.
- Si más de un promotorde interés está siendo investigado luego repetir esta comparación entre la toma de análisis de todos los promotores de interés y el control positivo.
- Si se observan sectores o tinción con azul en el control negativo a continuación, añadir esto al análisis o abandonar dependiendo de la extensión o si se sospecha tinción endógena (ver Discusión).
- Análisis de los patrones de expresión de promotor Durante cambial Desarrollo Derivada y diferenciación.
- El uso de un microscopio de disección, visualizar todos los sectores del cambium (Figura 1g, 1h, 1i) identificados en la etapa 6.2 y determinar la presencia / ausencia de tinción con azul en tres tipos tejidos derivados del cambium; el floema (P), el desarrollo de xilema (X1) o tejido xilema desarrollado (X2) (véase la figura 3a).
- Como en el paso 8.1.2, comparar la frecuencia de presencia / ausencia de tinción de GUS en las regiones P, X1 y X2 de promotor de interest con el control positivo mediante pruebas de Chi-cuadrado para establecer los valores de p. Un análisis más detallado de la especificidad de la célula / tejido puede llevarse a cabo mediante el punto 7.2 como se requiere.
- Consulte los pasos 8.1.2.1 y 8.1.2.2 de consideraciones adicionales.
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Resultados
El uso de este protocolo todos los tipos de células y tejidos del tallo secundarias en vivo han demostrado ser susceptibles a A. tumefaciens transformaciones y se han definido en tipos de sector basándose en el tipo de célula inicialmente transformada y que el patrón de crecimiento posterior desarrollo. Tipo de sector incluyen peridermis, floema, cambium, el parénquima de la herida y tilosa (Figura 1b, 1c, 1d) y se pueden encont...
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Discusión
El protocolo de ISSA es un método relativamente sencillo y eficaz para la creación de tejidos del tallo transgénicas en las especies de árboles en el espacio de unos pocos meses para el análisis de genes y promotores de interés que participan en la madera y el vástago de formación. , Más allá de mantener vivas las plantas, se requiere poco esfuerzo para crecer tejido del tallo transgénico después de la inoculación, que contrasta con los métodos in vitro donde se requiere un extenso cultivo para mantener el teji...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer el apoyo financiero para algunos aspectos del trabajo a través de las Becas de Vinculación LP0776563 (GB, AS) y LP0211919 (GB) y los socios de la industria Sappi y Mondi, así como el Premio Australiano de Posgrado (EM) del Consejo Australiano de Investigación y el Premio a los Jóvenes Innovadores y Científicos a través del Departamento de Agricultura de Australia (LT). También nos gustaría agradecer a Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan y Simon Southerton por las muchas discusiones e ideas que presentaron durante el desarrollo de este protocolo y a Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel y Noemie Defaix por su ayuda en el trabajo relacionado con el laboratorio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Plantas | NA | NA Por | favor, consulte a los proveedores locales de viveros para las plantas según sea necesario |
| Cepa de Agrobacterium | NA | NA Hay | muchas vías posibles para obtener cepas de Agrobactrium. Le sugerimos que haga un seguimiento dentro de su comunidad de investigación local, ya que puede haber restricciones para obtener la bacteria en su país y región. |
| Vector binario (gen y promotor) | NA | NA | Hemos desarrollado una gama de vectores para adaptarnos al protocolo ISSA utilizando un sistema de recombinasa de puerta de enlace. Esto incluye sobreexpresión, knockouts de ARNi y vectores de fusión de promotores basados en vectores pCAMBIA modificados y felices de proporcionar según sea necesario. Además, hay muchos vectores disponibles para la comunidad investigadora. |
| Medios LB | Sigma | L3022 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| Medios LB con agar | Sigma | L2897 | Un producto similar podría obtenerse de otra empresa |
| Antibióticos | Sigma | NA | El número de catálogo dependerá del antibiótico que necesite, ya que se utiliza una variedad de antibióticos para la selección bacteriana en vectores binarios. Este producto podría obtenerse de a Gama de empresas |
| 50 ml Tubos con tapa de rosca | Fisher Scientific | 14-432-22 | El mismo producto puede proceder de otra empresa |
| Microtubo de 2 ml | Watson Bio Lab | 132-620C | El mismo producto puede proceder de otra empresa |
| MS Media | Sigma | M9274 | El mismo producto puede proceder de otra empresa |
| Hoja de bisturí n.º 11 | Sigma | S2771 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | Este es el mejor producto para usar para vincular la ventana cambial después de la creación |
| Tubos de fondo redondo de 14 ml | Thermo Scientific | 150268 | El mismo producto puede proceder de otra empresa |
| EDTA | Sigma | E6758 | El mismo producto puede proceder de otra empresa |
| Triton | Sigma | X100 | El mismo producto puede proceder de otra empresa |
| X-Gluc | X-GLUC direct | Deberá ir al sitio web para realizar el pedido - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Ferricianuro de potasio (III) | Sigma | 244023 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| Ferrocianida de potasio (II) | Sigma | P9387 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| Papel tornasol | Sigma | WHA10360300 | El mismo producto podría provenir de otra empresa |
| Hoja de afeitar de un solo filo | ProSciTech | L055 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| Hoja de afeitar de doble filo | ProSciTech | L056 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| Frasco de muestra con tapón de rosca | ProSciTech | L6204 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| Etanol | sigma | E7023 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| LR blanco | ProSciTech | C025 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| Molde de incrustación | ProSciTech | RL090 | Recomendamos esta variedad, sin embargo, hay muchas opciones disponibles |
| Medios de montaje Water Soulable | ProSciTech | IA019 | Un ejemplo de un medio de montaje que podría utilizarse, sin embargo, existen otras opciones y podrían explorarse. |
| Peróxido de hidrógeno | Sigma | 216763 | Un producto similar podría obtenerse de otra empresa |
| Ácido acético glacial | Sigma | A9967 | Un producto similar podría obtenerse de otra empresa |
| Safranina O | ProSciTech | C138 | Un producto similar podría obtenerse de otra empresa |
| Microscopio electrónico de barrido ambiental | Quanta FEI | Este es el instrumento utilizado en parte de este estudio, pero cualquier otro SEM que tenga un modo de bajo vacío podría utilizarse. | |
| El software | de imágenes ImageJ se puede obtener de la siguiente URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
Referencias
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