Aquí presentamos un protocolo que facilita la caracterización funcional de rendimiento medio a alto de construcciones de genes y promotores en tejido de tallo secundario de árbol dentro de marcos de tiempo comparativamente cortos. Es eficiente, fácil de usar y ampliamente aplicable a una variedad de especies de árboles.
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Artículo de método
El uso de Inducida somática Análisis del Sector (ISSA) para el estudio de genes y promotores implicados en la formación de la madera y el desarrollo del tallo Secundaria
En este artículo
Resumen
Resumen
el crecimiento del tallo secundario en los árboles y la formación de madera asociados son significativos tanto desde las perspectivas biológica y comercial. Sin embargo, se sabe relativamente poco sobre el control molecular que regula su desarrollo. Esto es en parte debido a la física, los recursos y las limitaciones de tiempo a menudo asociados con el estudio de los procesos de crecimiento secundario. Un número de técnicas in vitro se han utilizado implica ya sea parte de la planta o sistema de toda la planta, tanto en leñosas y especies de plantas no leñosas. Sin embargo, las preguntas sobre su aplicabilidad para el estudio de los procesos de crecimiento de los tallos secundarios, la obstinación de ciertas especies y la intensidad del trabajo son a menudo prohibitivos para el medio a aplicaciones de alto rendimiento. Además, cuando se mira en la formación y el desarrollo del tallo secundario de la madera los rasgos específicos bajo investigación sólo podría llegar a ser medible tarde en el ciclo de vida de un árbol después de varios años de crecimiento. Al abordar estos retos alternativa in vivo protocols se han desarrollado, llamado inducido somática análisis del sector, lo que implica la creación de sectores de tejidos somáticos transgénicos directamente en el tallo secundario de la planta. El objetivo de este protocolo es proporcionar un medio eficaz, fácil y relativamente rápido para crear tejido vegetal secundario transgénicos para genes y caracterización funcional promotor que puede ser utilizado en una gama de especies de árboles. Los resultados presentados aquí indican que los sectores secundario del vástago transgénicas se pueden crear en todos los tejidos vivos y tipos de células en tallos secundarios de una variedad de especies de árboles y que la madera rasgos morfológicos, así como los patrones de expresión promotor en tallos secundarios se pueden evaluar fácilmente la facilitación de medio a alto caracterización funcional rendimiento.
Introducción
Troncos de los árboles comprenden una cantidad significativa de la biomasa y los planetas son de gran importancia biológica, cultural y comercial. Tallos secundarios crear hábitat proporcionando recursos y refugio para muchas otras formas de vida. Ofrecen muchos otros servicios de los ecosistemas que habitan y actúan como un recurso renovable para la producción de madera, pulpa y papel y otros productos madereros y no madereros. el desarrollo del tallo secundaria y la formación más específicamente la madera se rige por el sistema complejo molecular que regulan el desarrollo de determinados tipos de células, la composición bioquímica de sus paredes celulares y la form....
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Protocolo
1. Preparación de material vegetal
- Antes de la experimentación, recaudar nuevas plántulas de las especies de árboles preferidos de la semilla o el corte y hacer crecer el árbol / s hasta que el diámetro del tallo en la zona destinada a la experimentación es de aproximadamente 1 cm de diámetro.
Nota: El tiempo necesario puede variar debido a las tasas de crecimiento de las plantas, por lo tanto permiten que entre tres y nueve meses de este paso.
2. Creación del vector binario
- Llevar a cabo el trabajo de esta sección a la sección 7 en un laboratorio o invernadero donde Agrobacterium tumefaciens se....
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Resultados
El uso de este protocolo todos los tipos de células y tejidos del tallo secundarias en vivo han demostrado ser susceptibles a A. tumefaciens transformaciones y se han definido en tipos de sector basándose en el tipo de célula inicialmente transformada y que el patrón de crecimiento posterior desarrollo. Tipo de sector incluyen peridermis, floema, cambium, el parénquima de la herida y tilosa (Figura 1b, 1c, 1d) y se pueden encont.......
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Discusión
El protocolo de ISSA es un método relativamente sencillo y eficaz para la creación de tejidos del tallo transgénicas en las especies de árboles en el espacio de unos pocos meses para el análisis de genes y promotores de interés que participan en la madera y el vástago de formación. , Más allá de mantener vivas las plantas, se requiere poco esfuerzo para crecer tejido del tallo transgénico después de la inoculación, que contrasta con los métodos in vitro donde se requiere un extenso cultivo para mantener el teji.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer el apoyo financiero para algunos aspectos del trabajo a través de las Becas de Vinculación LP0776563 (GB, AS) y LP0211919 (GB) y los socios de la industria Sappi y Mondi, así como el Premio Australiano de Posgrado (EM) del Consejo Australiano de Investigación y el Premio a los Jóvenes Innovadores y Científicos a través del Departamento de Agricultura de Australia (LT). También nos gustaría agradecer a Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan y Simon Southerton por las muchas discusiones e ideas que presentaron durante el desarrollo de este protocolo y a Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel y....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Plantas | NA | NA Por | favor, consulte a los proveedores locales de viveros para las plantas según sea necesario |
| Cepa de Agrobacterium | NA | NA Hay | muchas vías posibles para obtener cepas de Agrobactrium. Le sugerimos que haga un seguimiento dentro de su comunidad de investigación local, ya que puede haber restricciones para obtener la bacteria en su país y región. |
| Vector binario (gen y promotor) | NA | NA | Hemos desarrollado una gama de vectores para adaptarnos al protocolo ISSA utilizando un sistema de recombinasa de puerta de enlace. Esto incluye sobreexpresión, knockouts de ARNi y vectores de fusión de promotores basados en vectores pCAMBIA modificados y felices de proporcionar según sea necesario. Además, hay muchos vectores disponibles para la comunidad investigadora. |
| Medios LB | Sigma | L3022 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| Medios LB con agar | Sigma | L2897 | Un producto similar podría obtenerse de otra empresa |
| Antibióticos | Sigma | NA | El número de catálogo dependerá del antibiótico que necesite, ya que se utiliza una variedad de antibióticos para la selección bacteriana en vectores binarios. Este producto podría obtenerse de a Gama de empresas |
| 50 ml Tubos con tapa de rosca | Fisher Scientific | 14-432-22 | El mismo producto puede proceder de otra empresa |
| Microtubo de 2 ml | Watson Bio Lab | 132-620C | El mismo producto puede proceder de otra empresa |
| MS Media | Sigma | M9274 | El mismo producto puede proceder de otra empresa |
| Hoja de bisturí n.º 11 | Sigma | S2771 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | Este es el mejor producto para usar para vincular la ventana cambial después de la creación |
| Tubos de fondo redondo de 14 ml | Thermo Scientific | 150268 | El mismo producto puede proceder de otra empresa |
| EDTA | Sigma | E6758 | El mismo producto puede proceder de otra empresa |
| Triton | Sigma | X100 | El mismo producto puede proceder de otra empresa |
| X-Gluc | X-GLUC direct | Deberá ir al sitio web para realizar el pedido - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Ferricianuro de potasio (III) | Sigma | 244023 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| Ferrocianida de potasio (II) | Sigma | P9387 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| Papel tornasol | Sigma | WHA10360300 | El mismo producto podría provenir de otra empresa |
| Hoja de afeitar de un solo filo | ProSciTech | L055 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| Hoja de afeitar de doble filo | ProSciTech | L056 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| Frasco de muestra con tapón de rosca | ProSciTech | L6204 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| Etanol | sigma | E7023 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| LR blanco | ProSciTech | C025 | El mismo producto podría obtenerse de otra empresa |
| Molde de incrustación | ProSciTech | RL090 | Recomendamos esta variedad, sin embargo, hay muchas opciones disponibles |
| Medios de montaje Water Soulable | ProSciTech | IA019 | Un ejemplo de un medio de montaje que podría utilizarse, sin embargo, existen otras opciones y podrían explorarse. |
| Peróxido de hidrógeno | Sigma | 216763 | Un producto similar podría obtenerse de otra empresa |
| Ácido acético glacial | Sigma | A9967 | Un producto similar podría obtenerse de otra empresa |
| Safranina O | ProSciTech | C138 | Un producto similar podría obtenerse de otra empresa |
| Microscopio electrónico de barrido ambiental | Quanta FEI | Este es el instrumento utilizado en parte de este estudio, pero cualquier otro SEM que tenga un modo de bajo vacío podría utilizarse. | |
| El software | de imágenes ImageJ se puede obtener de la siguiente URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
Referencias
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinni....
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Reimpresiones y permisos
