Preparación de CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células T para el Análisis de GD3 y GD2 gangliósidos membrana Expresión mediante microscopía

Resumen

Se describe un protocolo de tinción estándar de anticuerpos para su uso en la microscopía para determinar la expresión en la membrana y la localización de los gangliósidos en reposo y células T CD4 ⁺ vírgenes humanos activados. También se describen en tiempo real PCR experimentos usando <40.000 células que no requieren kits adicionales bajos de ARN de entrada.

Resumen

Los métodos aquí descritos para la activación de las células T CD4 ⁺ no tratados previamente en suspensión y su adhesión en cubreobjetos para el análisis de microscopía confocal permiten la localización espacial y la visualización de los gangliósidos que participan en la activación de células T CD4 ^+, que la expresión complemento experimentos de perfiles tales como citometría de flujo, en el oeste Blot o PCR en tiempo real. La cuantificación de la expresión de gangliósidos a través de citometría de flujo y su localización celular a través de microscopía se puede obtener por el uso de anticuerpos anti-gangliósido con alta afinidad y especificidad. Sin embargo, un manejo adecuado de células en suspensión implica el tratamiento de placas de cultivo para promover la adherencia necesaria requerida para la fluorescencia o la adquisición microscopía confocal. En este trabajo, se describe un protocolo para determinar GD3 y GD2 expresión de gangliósidos y colocalización con el TCR durante la activación de ingenuo células T CD4 ^+. También, en tiempo real, texperimentos ime PCR usando <40.000 células se describen para la determinación de la GD3 y GM2 genes / GD2 sintasa, lo que demuestra que los experimentos de análisis de gen se puede realizar con un bajo número de células y sin la necesidad de kits adicionales bajos de ARN de entrada.

Introducción

Las células T CD4 ⁺ orquestan la respuesta inmune a través de sus funciones efectoras después de la activación por las células presentadoras de antígeno ^1. El estudio de los mecanismos celulares que están moduladas durante la activación permite penetración en un proceso básico de la función inmune. Sin embargo, el estudio de las células T CD4 ⁺ vírgenes puede ser complicado debido a que representan una población muy pequeña de células en la periferia de sangre ^2.

A través de microscopía de fluorescencia varios informes han estudiado la localización de diferentes moléculas implicadas en la activa....

Protocolo

La sangre periférica de donantes varones sanos se obtuvo con el consentimiento informado y la aprobación del Comité de Bioética del Centro de Investigación en Dinámica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos.

1. Aislamiento y activación de T humanas indiferenciadas CD4 ⁺ células

1. Recoger 2 ml de sangre periférica derivadas de donantes humanos sanos mediante el consentimiento informado y se diluye con 2 ml de PBS estéril-EDTA (1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), EDTA 2 mM, pH 7,4). Añadir la sangre diluida lentamente en la parte superior de 3 ml de solución de sacarosa con 1,077 de densidad como....

Resultados

El protocolo descrito en este manuscrito hace que una buena calidad de culto y de descanso adherido y las células T CD4 ⁺ vírgenes humanos activados (Figura 1). Las células T CD4 ⁺ activadas muestran el perfil proliferativa característica (Figura 1B) en comparación con la condición de reposo (Figura 1A). El marcador de activación CD25 tarde es útil para evaluar la activación eficiente en 72 hr observada por microsco.......

Discusión

El protocolo descrito se puede utilizar para localizar gangliósidos o proteínas en las suspensiones de células de células T CD4 ⁺ o otras células inmunes (por ejemplo, PMBCs, figura 5) a partir de un pequeño número de células. Debido al pequeño tamaño de las células T y las propiedades no adherentes, la adquisición de fluorescencia imágenes microscópicas se obtenga información mala o baja calidad si las células están no se cumplen correctamente.

Este prot.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI avanzado 1640	Thermo Fisher Scientific	12633-012	Suplementado con un 3% de anticuerpo
CD3 humano anti ratón	eBioscience	16-0037-81	clon de OKT3
ratón anti humano anti humano anticuerpo CD28	ebioscience 16-0288-81		clon CD28.6
ratón anti humano GD3  anticuerpo	Abcam	ab11779	R24
ratón clon anti anti humano GD2 anticuerpo Santa	Cruz Biotechnology	sc-53831	clon 14G2a
anticuerpo anti-ratón IgG3 conjugado con FITC	Abcam	ab97259
Alexa Fluor 488 antiratón conjugado	Thermo Fisher Scieni¡ tific	A-21131
IgG2a anticuerpo
Alexa Fluor 647 antiratón conjugado	Thermo Fisher Scieni¡ tific	A-21241
			IgG2a
Hoechst 333258	Sigma-Aldrich	861405
Ficoll Paque-Plus	GE	17-1440-02
Trizol Reactivo	Invitrogen	15596-026
Naive CD4+ T Isolation Kit II, humano	MACS Miltenyi Biotec	130-094-131
BD FACSAria II	BD Biosciences		Sorting
Sistema de portaobjetos de cámara Nunc Lab-tek	Sigma-Aldrich	C7182
Olympus FV 1000 Microscopio Confocal Láser (Olympus)	Olympus		Upright BX61WI e IX81
Cebador de secuencia directa GD3 sintasa	5&agudo;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&agudo;		Ref. 7
cebador de secuencia inversa GD3 sintasa	5&agudo;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&agudo;		Ref. 7
Cebador de secuencia directa GM2/GD2 sintasa	5&agudo;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&agudo;		Ref. 7
Cebador de secuencia inversa GM2/GD2 sintasa	5&agudo;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&agudo;		Ref. 7

FBS Anticuerpo