El aislamiento, diferenciación y cuantificación de Human secretoras de anticuerpos células B de sangre: ELISpot como una lectura funcional de la inmunidad humoral

Resumen

La sangre periférica humana se utiliza habitualmente para la evaluación de la respuesta inmunitaria humoral. En este trabajo, se describen los métodos para aislar las células B humanas de la sangre periférica, diferenciar las células B humanas en células B secretoras de anticuerpos (Ab) en cultivo y enumerar el total de IgM- e IgG-ASC mediante un ensayo ELISpot.

Resumen

El sello distintivo de la inmunidad humoral es generar ASCs funcionales, que sintetizan y secretan Abs específica a un antígeno (Ag), tal como un patógeno, y se utilizan para la defensa del huésped. Para la determinación cuantitativa del estado funcional de la respuesta inmune humoral de un individuo, tanto Abs suero y ASC circulantes se miden comúnmente como lecturas funcionales. En los seres humanos, la sangre periférica es la muestra más conveniente y fácilmente accesible que se puede utilizar para la determinación de la respuesta inmune humoral provocada por células B de acogida. subconjuntos de células B distintos, incluyendo ASC, se pueden aislar directamente a partir de sangre periférica a través de la selección con microperlas Ab-conjugados específicos de linaje o mediante clasificación de células con citometría de flujo. Además, las células B vírgenes y de memoria purificadas se pueden activar y diferenciar en ASCs en cultivo. Las actividades funcionales de ASC para contribuir a la secreción de Ab se pueden cuantificar por ELISpot, que es un ensayo que converge enzima-vinculada ensayo de inmunoabsorbancia (ELISA) y tecnologías de Western Blot para permitir la enumeración de las ASC individuales a nivel de una sola célula. En la práctica, el ensayo ELISPOT se ha utilizado cada vez más para evaluar la eficacia de la vacuna debido a la facilidad de manejo de un gran número de muestras de sangre. Los métodos de aislamiento de células B humanas de sangre periférica, se describirán aquí la diferenciación de células B en ASCs in vitro, y el empleo de ELISpot para la cuantificación del total de IgM e IgG-ASC.

Introducción

las células B juegan un papel central en el desarrollo de la inmunidad humoral. En un principio se desarrollan en la médula ósea y entran en el torrente sanguíneo como ingenuo células B, que pueden migrar hacia los tejidos linfoides, tales como el bazo, los ganglios linfáticos, las amígdalas, para un mayor desarrollo. Al Ag encuentro, algunas células B vírgenes migran hacia los folículos linfoides, donde los centros germinales células B pueden diferenciarse en células B de memoria y plasmablastos (PBS) / células plasmáticas (PC). Aunque la mayoría de PBS / PCs de salida en la corriente de la sangre, unos pocos, finalmente, residen en la médula ósea para experimentar diferenciación terminal en PCs de larga vida ^1. Las células B en circulación son heterogéneas, y en el estado estacionario, PBS / PC son raros en la sangre periférica ^2. Como resultado de la disponibilidad de marcadores de superficie específicos de linaje, citometría de flujo se ha convertido en un método popular para la identificación y caracterización de los subconjuntos de células B en sangre periférica. Una aplicación extendida de flujo cytometry es la adición de una función de clasificación de células, lo que permite la separación y el aislamiento de subconjuntos individuales de células B con una alta pureza. Sobre la base de la expresión de receptores de superficie específicos en diferentes etapas de desarrollo, las células B circulantes humanos se clasifican generalmente en tres subpoblaciones principales: células B vírgenes (CD19 ⁺ CD27 ^- CD38 ^-), las células B de memoria (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^-), y PBS / PC (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^{+) 3-4} (Figura 1). células B vírgenes, por naturaleza, no se han encontrado con Ags. Sin embargo, pueden ser diferenciadas en células IgM ⁺ CD27 ⁺ B de memoria. Aunque las células B vírgenes son homogéneos en la expresión del receptor de antígeno de células B (BCR) -asociado moléculas (por ejemplo, CD19, CD20 y CD22) que son heterogéneos en su repertorio de inmunoglobulina ^5. La mayoría de las células CD27 ⁺ B de memoria se puede diferenciar en CD27+ / CD38 ⁺ hi PBS / PC ^6. Además, las células B de memoria y PBS / PCs son policlonales y exhiben heterogeneidad desarrollo y funcional ^4-7. PBS / PC en la circulación son normalmente de corta duración y no expresan CD138, pero los realizados para establecerse en la médula ósea se terminalmente diferenciarse y convertirse larga vida. Terminalmente diferenciadas PC expresan CD138 y regulan por disminución moléculas CD27 en su superficie ^8. Dado que tanto el PBS y PCs son capaces de secretar Abs, en muchas ocasiones se designan colectivamente como ASC. En cambio, ni las células B vírgenes ni las células B de memoria pueden producir cantidades apreciables de Abs ^9-10. Sin embargo, cuando se aíslan, tanto las células B vírgenes y de memoria pueden diferenciarse en ASCs en 3 - 10 días cuando se coloca en las condiciones de cultivo apropiadas ^{6, 11-15.} De hecho, las ASC derivadas de la diferenciación in vitro de acciones expresiones similares en la superficie de CD27 y CD38 con los fr aislados directamentesangre periférica om ^6. Además, las ASC diferenciadas in vitro expresan un bajo nivel de CD20 de superficie, similar al de circulación de PBS / PCs ^6. A pesar de las ASC derivados de cultivos de todo son de corta duración, que pueden secretar Abs, indicando que son funcionalmente competente y capaz de contribuir a la inmunidad humoral.

Ambos ELISA y ELISPOT son con mucho los métodos más comúnmente aplicado con los que obtener información funcional sobre la respuesta inmune humoral. ELISA es un ensayo basado en placa de 96 pocillos, y se utiliza frecuentemente para medir los títulos de Abs Ag-específica suero y otros analitos (por ejemplo, citoquinas). Es conveniente y escalable. ELISA está diseñado para utilizar un ensayo enzimático en fase sólida para detectar la presencia de ABS o de otras sustancias, tales como suero, en una muestra líquida ^16. Las lecturas de ELISA en suero han sido ampliamente utilizados para representar la respuesta inmune del cuerpo. Una herramienta necesaria para la adquisición de la readouts de ensayos ELISA es un lector de microplacas espectrofotométrico. El lector puede determinar la densidad óptica (OD) de los productos finales típicamente resultantes de la reacción de la peroxidasa de rábano picante (HRP) Abs detección conjugado y sus sustratos específicos ^17. Con respecto a la información de la respuesta inmune humoral, los niveles de suero AB determinados por ELISA denotan el colectivo, pero no individual, el rendimiento de ASC en el cuerpo. Además, ELISA no tiene en cuenta la participación de las células B de memoria, que no secretan Abs.

Como ELISA, ELISPOT es un método ampliamente utilizado para la detección y el seguimiento de la respuesta inmune en muestras de sangre periférica ^17-18. ELISpot es una técnica relacionada con un sándwich ELISA. En ella, las células se colocan en el difluoruro de polivinilideno (PVDF) membrana pozos con respaldo de microplacas de 96 pocillos para un cultivo a corto plazo. El ensayo ELISPOT es análoga a la realización de Western Blot en una microplaca y developing las manchas en la membrana de PVDF en cada pocillo. Se requiere un sistema lector de ELISPOT automatizado o un estereomicroscopio para el recuento manual. La principal ventaja de ELISPOT en la detección de una respuesta inmune es su excelente sensibilidad en la cuantificación de las ASC y células secretoras de citocinas. Se informa de sus actividades funcionales en la inmunidad humoral y celular, respectivamente. En la medición de la función inmune humoral, los niveles de suero AB determinados por ELISA y el número de ASC enumerados por ELISPOT son a menudo correlacionados, pero las lecturas de datos de estos dos ensayos tienen algunas diferencias en implicaciones funcionales ^19-20. La principal ventaja de ELISpot es su sensibilidad de método. El nivel de los títulos de suero AB según lo informado por ELISA se presenta semi-cuantitativamente como lecturas de DO, que indica el nivel de Ab relativa, o más cuantitativamente, como las lecturas de concentración cuando se incluye una cantidad conocida de los isotipos apropiados de Abs para referencia. En contraste, los resultados de ELISPOT son Presented como el número absoluto de ASC en una piscina de célula de interés (por ejemplo, células no fraccionadas mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y células B purificadas de PBMCs). ELISpot puede detectar una sola ASC, pero ELISA requiere cantidades Ab de ASC para llegar a concentraciones de ensayo dependiente optimizados antes de la medición. Por lo tanto, ELISpot es obviamente superior a ELISA en la sensibilidad de la cuantificación. Por otra parte, ELISpot también es adecuado para la cuantificación de las ASC diferenciadas in vitro a partir de células B de memoria activados. células B de memoria no secretan Abs, pero pueden diferenciarse en ASC tras la activación; por lo tanto no tienen ninguna contribución a Abs suero detectados por ELISA. Por lo tanto, ELISpot es el método de elección en la medición de la respuesta inmune de las células B de memoria que circula después de la activación en cultivo. Permite la supervisión del mantenimiento de la inmunidad humoral a largo plazo.

Protocolo

sangre periférica humana debe ser obtenida de donantes sanos en el consentimiento informado, y el uso de muestras de sangre deben ajustarse a las directrices aprobadas establecidos por las juntas de revisión institucionales individuales. En este estudio, el protocolo a utilizar la sangre humana en una demostración de los resultados de la citometría de flujo (Figura 1) y ensayos de ELISPOT (Figura 3) fue aprobado por la Junta de Revisión Interna del Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán (número de protocolo 201307019RINB).

1. Aislamiento y purificación de células B de sangre periférica humana

1. Dibuje ~ 10 ml de sangre de la vena cubital media (en el anterior fosa cubital hasta el codo) en un tubo de 15 ml que contenía K ₂ EDTA (1,5 a 2,0 mg / ml de sangre) y se invierte inmediatamente el tubo varias veces para prevenir coágulos formación.
2. Añadir 35 ml de autoclave (121 ° C, 15 min) de glóbulos rojos (RBC) tampón (150 mM NH ₄ Cl, 10 mM de _KHCO3, y EDTA 1 mM de lisis; pH 7,4) al tubo que contiene la muestra de sangre fresca (≥ 3: 1 vol / vol) y se incuba a temperatura ambiente (RT) durante no más de 5 min.
   Nota: El aspecto de transmisión de la luz a través del tubo indica la finalización de RBC lisis.
3. Centrifugar a 600 xg a TA durante 5 min. Asegúrese de que la pastilla es de color blanco.
4. Resuspender el precipitado con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato autoclave (PBS, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 4,3 mM Na ₂ HPO _4, y 1,47 mM KH ₂ PO _4; pH 7,4) y se centrifuga como en el paso 1.3.
5. Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado con 10 ml de medio RPMI 1640 (suplementos: suero de ternera fetal al 10%, 100 U / ml de penicilina / estreptomicina, 0,25 mg / ml de anfotericina B, y 2 mM L-glutamina), y luego la placa de las células en una placa de cultivo de 10 cm (10 ml de sangre por placa). Coloque el plato en una incubadora a 37 ° con 5% de _CO2 durante 30 min.
6. Hacer girar suavemente la placa de cultivo unas cuantas veces y colocar elmedio de cultivo (células en suspensión) en tubos cónicos de plástico 15-mL. Desechar las células adherentes (principalmente macrófagos) en las placas de cultivo.
7. Centrifugar a 600 xg a TA durante 5 min. Descartar el sobrenadante.
8. Resuspender el sedimento con 1 ml de medio RPMI 1640. Contar el número de células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
   NOTA: La viabilidad de los leucocitos aislados es normalmente mayor que 90% por exclusión de azul de tripano.
9. Centrifugar como en el paso 1.7 y resuspender las células en ~ 200 l de tampón de PBS frío (0,5% de albúmina de suero bovino (BSA) y EDTA 2 mM) a la concentración de 5 a 10 x 10 ⁶ células / ml.
10. Añadir 5 l de Ab biotinilado cóctel anti-humano específico para células de la sangre (para la selección negativa de células B) por cada 10 ⁶ células y se incuba en hielo durante 30 min ^21.
    NOTA: El Ab cóctel anti-humano debería incluir al menos Abs específicos para CD2 (o CD3), CD14, y CD16.
11. Añadir un exceso de volumen de 10 vecesde PBS estéril a las células, se centrifuga a 600 xg durante 5 min, y descartar el sobrenadante.
12. Añadir la misma cantidad de microperlas de estreptavidina conjugada (5 l por 10 ⁶ células) al sedimento y mezclar bien.
13. Incubar en hielo durante 30 min en un tubo cónico de 15 ml de plástico.
14. Añadir 2 ml de tampón PBS en el tubo.
15. Se coloca el tubo en un soporte magnético y se incuba a temperatura ambiente durante 8 min. Las microperlas de color marrón se unirán gradualmente a la pared del tubo próxima al imán ^22.
16. Con el tubo que queda en el soporte magnético, transferir cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo estéril de 15 ml ^22.
17. Repita los pasos 1.14 a 1.16, y combinar los dos sobrenadantes que contienen las células B vírgenes. Desechar las microperlas.
18. Centrifugar a 600 xg a TA durante 5 min. Descartar el sobrenadante.
19. Resuspender el sedimento en medio RPMI 1640 para los experimentos posteriores.
    NOTA: Por lo general, 1 - 5 x 10 ⁵ células B ingenioha pureza superior al 95% a partir de 10 ml de sangre periférica puede ser aislado ^23.

2. purificación y separación de la Memoria y Naïve B a partir de células B aisladas

1. Utilice células purificadas de la etapa 1 y determinar el número de células utilizando un hemocitómetro o un contador de células automático.
2. Resuspender las células en 100 l de tampón de PBS frío después de centrifugación a 600 xg y RT durante 5 min.
3. Añadir 1 - 2 g de mAb CD27 biotinilado por cada 10 ⁶ células y se incuba en hielo durante 30 min.
4. Añadir 10 ml de tampón de PBS al tubo y centrifugar a 600 xg durante 5 min.
5. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 50 l de tampón de PBS.
6. Añadir cantidades iguales de microperlas magnéticas de estreptavidina (1 - / 10 ⁶ células 2 g) a células en un tubo cónico de plástico 15-mL.
7. Mezclar suavemente pocillo e incubar en hielo durante 30 min.
8. Añadir 2 - 3 ml de tampón de PBS al tubo.
9. Colocar eltubo en un soporte magnético y se incuba a temperatura ambiente durante 8 min para permitir que las microperlas de color marrón para insertarse en el lado más próximo al imán.
10. Con el tubo en el soporte magnético, transferir cuidadosamente la fracción sobrenadante en un nuevo tubo estéril. Esta fracción contiene el CD27 enriquecido ^- células B vírgenes.
11. Añadir 5 ml al tubo que contiene las microperlas y resuspender suavemente las microperlas (es decir, la fracción enriquecida de células CD27 ⁺ B de memoria) ^24-25.
12. Centrifugar a 600 xg a TA durante 5 min. Resuspender los pellets con medio RPMI 1640 para los experimentos posteriores.
    NOTA: Por lo general, ~ 30 - 60% de las células B puede ser purificado como células de memoria CD27 ⁺ a partir de las PBMCs de un donante sano ^{7, 25-26.}

3. clasificación de células para la recolección de células B, Naïve células B de memoria, y PBS / PC

1. El uso de las células purificadas de la etapa 1, determinar el número de células usando un hemocytometer o un contador de células automático.
2. Resuspender las células en tampón PBS frío a la concentración de 10 ⁷ por ml en un tubo de poliestireno de 5 ml.
3. Añadir 1 - 2 g de IgG humana por 10 ⁶ células y se incuba en hielo durante 10 min para el bloque de Fc.
4. Añadir 1 g cada uno de anti-CD19-APC (clon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (clon: O323), y anti-CD38-PE (clon: hit2) por 10 ⁶ células; mezclar bien e incubar en hielo durante 30 min ^{4, 27.}
5. En los últimos 5 minutos en el paso 3.4, añadir 5 l de la 7-aminoactinomicina comercial D (7-AAD).
6. Añadir 2 ml de PBS al tubo, vórtice, y se centrifuga a 600 g durante 5 min.
7. Resuspender las células en tampón de clasificación (estéril PBS con BSA al 2% y EDTA 2 mM) a una concentración de 1 - 5 x 10 ⁷ células por ml en un tubo de 15 ml.
8. Filtrar las células a través de un filtro de células de malla de nylon (40 micras de tamaño de poro) para eliminar grupos de células.
9. Separar las células con un flujo de citometría especieer equipado con tres láseres: violeta (405 nm), azul (488 nm) y rojo (640 nm).
   NOTA: El láser azul sola es suficiente para ^{27-28 de} citometría de flujo de 3 colores.
10. Ordenar las células en tres tubos de 15 mL (que contienen 5 ml de medio RPMI) para la recolección simultánea de las células B vírgenes (CD19 ⁺ CD27 ^-), células B de memoria (CD19 ⁺ CD27 ^+), y PBS / PC (CD19 ⁺ CD27 ^{+ /} CD38 ^{+ hi) 3-4, 28.}
    NOTA: Ordenado células B vírgenes y de memoria pueden ser cultivadas como se describe en el paso 4.

4. diferenciación in vitro de células aisladas CD19 humano ⁺ B, CD19 ⁺ CD27 ⁺ células B de memoria, y CD19 ⁺ CD27 ^- ingenuo células B

1. El uso de las células purificadas en pasos de 1.19, 2.10, 2.11 y 3.10, determinar el número de células con un hemocitómetro o un contador de células automático.
2. Resuspender las células con medio RPMI 1640a una concentración de 1 - 10 x 10 ⁵ por ml y alícuota ellos en los pocillos de una placa de 12 pocillos.
3. Añadir CpG (ODN 2006) a los 5 mg / 10 ⁶ células / ml ^{18, 29.}
4. Cultivar las células en una incubadora a 37 ° con 5% de CO ₂ durante 5 días.
5. Recoger las células de cada pocillo, colocarlos por separado en tubos de 15 ml, añadir 5 ml de PBS a cada tubo y centrifugar a 600 xg ellos y RT durante 5 min.
6. Contar las células utilizando un hemocitómetro o un contador de células automático. Resuspender las células a una concentración de 1 - 10 x 10 ⁵ por ml con medio RPMI 1640.

5. Ensayo ELISPOT

1. Añadir 30 l de 35% de etanol en agua destilada a cada pocillo de las placas de ELISPOT durante 30 s.
   NOTA: Al pipetear, evite tocar la membrana en los pozos en todo momento.
2. Invertir las placas de ELISPOT para eliminar el etanol.
3. Ponga 150 l de ddH autoclave ₂ O en cada pocillo e incubarellos a TA durante 5 min para enjuagar el etanol residual; seguir con un lavado de PBS estéril a temperatura ambiente durante 3 min.
   NOTA: Los pasos 5.1 a 5.3 pueden ser opcionales, dependiendo de la fabricación de las placas.
4. Ponga 50 l de 5 mg / ml policlonal F (ab ') ₂ fragmento de anti-Ig humana (IgG + IgM + IgA) (en PBS) en cada pocillo de las placas de ELISPOT y incubarlos a 4 ° C durante la noche (preferido) o 37 ° C durante 2 h ^11.
   NOTA: Sellar los bordes de las placas con Parafilm hasta su uso.
5. Invertir las placas para eliminar Abs sin unir, añadir 200 l de PBS a cada pocillo, y se incuban dos veces a temperatura ambiente durante 3 min cada vez.
6. Añadir 200 l de PBS con 5% de BSA (o RPMI 1640) a cada pocillo para bloquear, y incubarlos a temperatura ambiente durante 2 h.
7. Invertir las placas para eliminar el tampón de bloqueo. Lavar cada pocillo dos veces con 200 l de PBS, como en el paso 5.5.
8. Añadir 100 ml de medio RPMI 1640 a cada pocillo y se incuba ellos en 37 ° C.
9. Cuando esté listo para sembrar las células, invertir las placas para eliminar el medio RPMI 1640.
10. Seed 100 l (5 x 10 ^4), 50 l (2,5 x 10 ^4), y 25 l (1,25 x 10 ⁴⁾ de las células (de medidas 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 y 4.6) en los pocillos de una placa de ELISPOT. Con medio RPMI 1640, llevar el volumen a 150 l / pocillo.
    NOTA: Un mínimo de una o dos diluciones en serie de 2 veces para el recubrimiento de las células se recomienda.
11. Se incuban las placas en una incubadora a 37 ° con 5% de _CO2 durante 8 a 14 h ^18. Evite mover las placas durante la incubación.
12. Invertir las placas para eliminar las células y el medio RPMI 1640.
13. Añadir 200 l / pocillo de PBS-T (PBS con 0,05% de Tween 20) y se incuba a 5 veces a temperatura ambiente, cada vez durante 3 min. Invertir la placa para eliminar el tampón de lavado entre cada uno de los 5 lavados.
14. Añadir o bien fosfatasa alcalina IgG-cabra anti-humano (AP), Abs Fc gamma-específico (para la detección de IgG, 1: 5000 en PBS-T) O de cabra anti-IgM humana-AP, Fcμ Abs-fragmento específico (para la detección de IgM, 1: 5000 en PBS-T) en los pocillos designados y se incuba a RT durante 2 horas en la oscuridad.
15. Lavar cada pocillo dos veces con 200 l de PBS, como en el paso 5.5.
16. Añadir 50 l de solución de sustrato / pocillo de bromochloroindolyl-nitro azul tetrazolio fosfato (BCIP / NBT). manchas de color violeta aparecen normalmente en el 5 - 15 min.
17. Añadir 100 ml / pocillo de _ddH2O para evitar el sobre-desarrollo de las manchas.
18. Se lavan las placas con agua corriente del grifo después del desarrollo completo de todos los puntos.
19. Retire el drenaje inferior de las placas y permitir que se sequen al aire en la oscuridad.
20. Contar las manchas usando un lector de placas automatizado con una unidad de adquisición de imágenes / análisis (por ejemplo, un escáner automático o manual a través de un microscopio de disección).
    NOTA: Las placas pueden almacenarse a temperatura ambiente en la oscuridad y se analizan más adelante.

Resultados

PBMCs se agotaron de eritrocitos y las células adherentes (pasos 1.2 a 1.7). Una alícuota (2 x 10 ⁶⁾ de las células se sometieron a un análisis de citometría de flujo para ilustrar las poblaciones de células naïve B, células B de memoria, y PBS / PCs en la sangre periférica (Figura 1). En PBMCs de este donante, aproximadamente 10% de los linfocitos eran células B CD19 ^+. En el compartimiento de células B, el porcentaje de CD19 ⁺ CD27

Discusión

El aislamiento y la purificación de células B de sangre periférica humana

Normalmente, los glóbulos rojos se pueden romper de manera eficiente y borrar por tampón de lisis (paso 1.2). Es importante no incubar PBMCs con el tampón de lisis RBC más de 5 min, como la viabilidad celular puede verse afectado por el cloruro de amonio. Alternativamente, los glóbulos rojos y las plaquetas se pueden eliminar simultáneamente por el siguiente protocolo.

Mezclar la sangre entera...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	tubo de 10 ml
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	sin endotoxinas
	Biological Industries	03-102-1B
IMag Equipo de enriquecimiento de linfocitos B humano	BD Biosciences	558007
CD27 mAb biotinilado	Biolegend	302804	clon O323
Microperlas magnéticas de estreptavidina	BD Biosciences	9000810
15 mL Tubos Falcon	BD Falcon	352196
Filtro de celdas de malla de nylon azul, 40 μ m	BD Falcon	352340
Antihumano CD19-APC	Biolegend		302212 clon HIB19
Antihumano CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	clon O323
Antihumano CD38-PE-Cy7 Biolegend		303516	clon HIT2
El clon antihumano CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	HIT2
Anti-humano CD45-FITC	Biolegend	304006	clon HI30
Anti-humano CD45-FITC	BD Biosciences		555482 clon HI30
Anti-ratón/rata/humano CD27-PerCP Cy5.5	Biolegend	124213	clon LG.3A10
Anti-humano CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	clon L128
Anti-humano CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	clon LT19
Antihumano CD19-FITC	Clon de GeneTex		GTX75599 LT19
Antihumano CD20-FITC	BD Biosciences		555622 clon 2H7
biotinilado antihumano CD27 Biolegend		302804	clon O323
biotinilado antihumano CD27	eBioscience	13-0279-80	clon O323
7-aminoactinomicina D (7-AAD)	BD Biosciences	559925
CpG (ODN 2006)	InvivoGen	tlrl-2006	tipo B CpG
IL-2 humano recombinante	PeproTech	200-02
IL-10 humano recombinante	PeproTech	200-10
IL-21 humano recombinante	PeproTech	200-21
humano recombinante sCD40L	PeproTech	310-02
Proteína A de S. aureus Cowan (SAC)	Sigma-Aldrich	82526
Pokeweed mitógeno (PWM)	Sigma-Aldrich	L9379
Placas de filtro MultiScreen, 0.45 y micro; m tamaño de poro	Merck Millipore	MSIPS4510	estéril placa filtrante transparente de 96 pocillos con membrana hidrofóbica de PVDF
Solución BCIP/NBT	Sigma-Aldrich	B6404
BCIP/NBT reactivo único, sustrato de fosfatasa alcalina	Merck Millipore	ES006
IgG humana	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
IgG humana, fragmento Fc	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
F(ab')2 fragmento de Ig antihumano de cabra (IgG + IgM + IgA)	Jackson ImmunoResearch	109-006-127
Fosfatasa alcalina IgG antihumana de cabra, Fcγ fragmento específico	Jackson ImmunoResearch	109-055-008
Fosfatasa alcalina IgM antihumana de cabra, Fcµ fragmento específico	Jackson ImmunoResearch	109-055-043
IgG-peroxidasa antihumana de cabra, Fcγ fragmento específico	Jackson ImmunoResearch	109-035-008
IgM-peroxidasa antihumana de cabra, Fcµ fragmento específico	Jackson ImmunoResearch	109-035-095
Kit de sustrato BD ELISPOT AEC BD	Biosciences	551951
Analizador C.T.L. ImmunoSpot	C.T.L.