los Drosophila Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

Resumen

Este protocolo se muestra cómo generar tumores clonales fluorescente marcada, genéticamente definidos en el ojo de Drosophila / discos imaginales de las antenas (EAD). En él se describe cómo diseccionar el EAD y el cerebro de la tercera fase larvaria y la forma de procesarlos para visualizar y cuantificar cambios de expresión génica y la invasividad tumoral.

Resumen

Drosophila melanogaster ha surgido como un poderoso sistema experimental para estudios funcionales y mecanicistas del desarrollo y la progresión tumoral en el contexto de un organismo completo. Las técnicas sofisticadas para generar mosaicos genéticos facilitan la inducción de clones marcados visualmente y genéticamente definidos rodeados de tejido normal. Los clones pueden ser analizados a través de diversos enfoques moleculares, celulares y ómicos. Este estudio describe cómo generar tumores clonales marcados con fluorescencia de diversa malignidad en los discos imaginales oculares/antenales (EAD) de larvas de Drosophila utilizando la técnica de Análisis de Mosaico con un Marcador de Células Represibles (MARCM). Describe los procedimientos, cómo recuperar el mosaico de EAD y el cerebro de las larvas y cómo procesarlos para obtener imágenes simultáneas de reporteros transgénicos fluorescentes y tinción de anticuerpos. Para facilitar la caracterización molecular del tejido mosaico, describimos un protocolo para el aislamiento de ARN total del EAD. El procedimiento de disección es adecuado para recuperar EAD y cerebros de cualquier etapa larvaria. El protocolo de fijación y tinción para discos imaginales funciona con una serie de reporteros transgénicos y anticuerpos que reconocen las proteínas de Drosophila. El protocolo para el aislamiento de ARN se puede aplicar a varios órganos larvarios, larvas enteras y moscas adultas. El ARN total se puede utilizar para la elaboración de perfiles de cambios en la expresión génica mediante enfoques candidatos o de todo el genoma. Por último, detallamos un método para cuantificar la invasividad de los tumores clonales. Aunque este método tiene un uso limitado, su concepto subyacente es ampliamente aplicable a otros estudios cuantitativos en los que se debe evitar el sesgo cognitivo.

Introducción

El cáncer representa uno de los grupos más genéticamente heterogéneo de enfermedades, cuya incidencia y la mortalidad está aumentando de manera espectacular, sobre todo entre las personas de edad en todo el mundo. El cáncer se origina por clonación de una célula de iniciación de tumor que se escapa mecanismos supresores de tumores inherente y divide fuera de control. La acumulación gradual de las lesiones genéticas que cooperativamente promueven el crecimiento, la proliferación y la motilidad, mientras que la inhibición de la muerte y la diferenciación transforma el sobrecrecimiento benigno inicial en un tumor altamente maligno, metastásico y mortal. Se ha hecho evidente que además de las alteraciones genéticas, la progresión del tumor requiere cambios en el estroma circundante y diafonía entre los tipos de células tumorales y múltiple (por ejemplo, fibroblastos, células inmunes y endoteliales) en su microambiente. La comprensión de los principios moleculares que subyacen a la transformación maligna, incluyendo las interacciones del tumor-estroma es de gran importancia para el desarrollo de prevencióny las estrategias de detección temprana, así como tratamientos nuevos y efectivos para combatir la metástasis del cáncer y la resistencia a los medicamentos.

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster se ha convertido en un sistema atractivo para la investigación del cáncer de ^1-4 debido a su tiempo de generación rápida, notable conservación de los nodos entre las moscas y los seres humanos, la redundancia genética limitada y la riqueza de herramientas genéticas avanzadas que facilitan la manipulación de casi cualquier gen en la señalización de manera temporal y espacialmente restringida. Tumores genéticamente definidas de malignidad variable pueden ser diseñados de forma reproducible en Drosophila mediante la introducción de ganancia y mutaciones de pérdida de función en un subconjunto de células progenitoras en un tejido de tipo salvaje de otro modo utilizando la técnica MARCM ^5. La herramienta combina MARCM FLP / FRT (FLP recombinasa / FLP del prisma) mediada por recombinación mitótica ⁶ con FLP de salida ⁷ y GAL4 / UAS (Upstream Secuencia de Activación) ⁸ gen dianasistemas de expresión de ^9. Con esta expresión método de cualquier transgén basada en UAS, incluyendo oncogén o ADNc de proteínas fluorescentes o repeticiones de ADN invertidas para el silenciamiento de genes inducido por dsRNA, se restringirá a un clon de células que han perdido un locus genético específico y un represor Gal4 debido a la recombinación (Figura 1A). Parches clonales marcados con fluorescente verde (GFP) o proteínas fluorescentes de color rojo (por ejemplo, RFP, DsRed, mCherry) puede ser fácilmente seguido en todo el desarrollo, aislado y analizado. Es importante destacar que, su comportamiento se puede comparar directamente con el tejido de tipo salvaje adyacente. Por lo tanto, las preguntas pertinentes a los efectos de células autónomas y no autónomas de lesiones genéticas pueden ser estudiadas convenientemente. Al igual que en los mamíferos, sólo los clones en los que las lesiones oncogénicas múltiples se combinan se vuelven malignas en Drosophila y recapitulan características principales de cáncer de mamífero. Ellos overproliferate, evadir la apoptosis, induce la inflamación, se convierten en inmortales y Invasiva, en última instancia, matar al anfitrión ^10-17.

A continuación, se describe un protocolo para generar tumores clonales genéticamente definidos en el tejido ocular / antenal y el cerebro de las larvas de Drosophila utilizando la técnica MARCM. El método se basa en un aparato de ensayo de la MARCM que expresa la recombinasa FLP de levadura bajo el control del potenciador sin ojos (eyFLP) ^18,19. De esta manera, los clones GFP-etiquetados se generan tanto en el epitelio columnar peripodial y de la EAD y el neuroepitelio del cerebro a través de las etapas embrionarias y de larvas (Figura 1A, B y de referencia ^20). Los clones pueden ser fácilmente seguidos hasta la edad adulta como el EAD se desarrolla en el ojo adulto, la antena y la cabeza de la cápsula mientras que el neuroepitelio da lugar a neuroblastos que producen las neuronas del lóbulo óptico diferenciadas.

Para facilitar una amplia caracterización molecular y funcional y fenotípica del tejido de mosaico, que deescriba un protocolo para la disección de la EAD y el cerebro de la tercera estadio las larvas y delinear la forma de procesarlos para tres aplicaciones diferentes: (i) la detección de reporteros fluorescentes transgénicos y la inmunotinción, (ii) la cuantificación de la invasividad tumoral y (iii) el análisis de cambios de expresión génica utilizando una cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR) o una secuencia de ARNm de alto rendimiento (mRNA-seq) (Figura 1C).

El protocolo de la inmunotinción se puede utilizar para visualizar cualquier proteína de interés con un anticuerpo específico. Transgénicos reporteros transcripcionales fluorescentes proporcionan información espacio-temporal conveniente y preciso de la actividad de una vía de señalización particular. reporteros específicos de la célula de linaje, por otra parte, reflejan los cambios cualitativos y cuantitativos en las poblaciones de células dentro del tejido de mosaico y entre los tumores de los genotipos distintos. La cuantificación del comportamiento invasivo facilita la comparación de malignidad del tumor entre el genotipos. Por último, el protocolo de descripción de recogida y tratamiento de EAD mosaico para el aislamiento de ARN es adecuado tanto para aplicaciones posteriores a pequeña y gran escala, tales como la transcripción inversa seguida por QRT-PCR y en todo el genoma de mRNA-seq, respectivamente. Los datos cualitativos y cuantitativos obtenidos de estos ensayos proporcionan nuevos conocimientos sobre el comportamiento social de los tumores clonales. Además, producen una base sólida para estudios funcionales sobre el papel de los genes individuales, redes genéticos y microambiente tumoral en diferentes etapas y aspectos de la tumorigénesis.

Protocolo

NOTA: En este trabajo se utiliza el eyFLP1; Ley> y ^+> Gal4, UAS-GFP; Línea probador FRT82B, bañera-GAL80 MARCM 82B Verde ^11. Cruzando las vírgenes probador MARCM 82B verde a los machos de las cepas, tales como W; UAS-a; ^UAS-RNAi b, c FRT82B genotipo ^mut producirá progenie en la que se producirá la recombinación mitótica entre los brazos derechos de los cromosomas homólogos ^{de 3ª.} De esta manera, los clones mutantes homocigotos para el gen c situado distal al sitio FRT82B se genera dentro de la EAD y neuroepitelio cerebro. Estos clones expresarán GFP, transgén un dsRNA y para el gen de b (Figura 1A). Varias líneas probador eyFLP-MARCM para la recombinación en los ejes X, 2L, 2R, 3R y 3L se han establecido y están disponibles dentro de la comunidad mosca.

1. Manipulación de la mosca, cruces, y estadificación

1. Expandir el probador MARCM madre apropiada a temperatura ambiente por poblar múltiples bottles al mismo tiempo. Voltear los adultos en botellas frescas cada 2-3 días, así que un número suficiente vírgenes pueden ser recogidos para cruces subsiguientes.
   NOTA: Al recoger vírgenes, evitar una exposición prolongada a CO ₂ ya que esto pone en peligro la fecundidad femenina.
2. Dependiendo de la escala del experimento, establecer cruces de moscas en viales utilizando al menos 10 vírgenes probador MARCM y 4 hombres (por ejemplo, para la obtención de imágenes de los reporteros fluorescentes y de inmunotinción) o en botellas con al menos 30 vírgenes y 10 machos (por ejemplo, para el aislamiento de ARN y la cuantificación de la invasividad).
3. Elevar la progenie a 25 ° C bajo un día largo ciclo de luz-oscuridad / 8 h 16 h. Voltear los padres en nuevos frascos / botellas cada 24 horas para facilitar la puesta en escena reproducible de larvas y para evitar el hacinamiento.
   NOTA: A partir del día 6 después de la puesta de huevos (AEL), a finales del tercer control de instar larvas dejan de alimentarse, empieza a deambular y entrar pupariation. Por el contrario, el comienzo de la transición larval-pupal se puede Delayed o inexistente en larvas con EAD portadores de tumores clonales hiperplásicas o malignas.

2. El cobro de larvas de tercer estadio

1. Para la inmunotinción, recoger aproximadamente 20 larvas de instar tercero tarde (deambulando en la pared y los de un tamaño de cuerpo comparable de los alimentos). El uso de fórceps para recoger suavemente las larvas del frasco o botella y transferirlos en un plato de cristal embrión llena con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   1. Para el aislamiento del ARN y cuantificación de invasividad, recoger al menos 80 finales de las larvas de instar tercero (deambulando en la pared y los de un tamaño de cuerpo comparable de los alimentos). Utilice una botella con atomizador a chorro de PBS en una botella que contiene larvas de mosca hasta que la superficie está cubierta.
   2. Suavizar las capas superiores de los alimentos con una espátula y vierta el puré de alimentos que contienen larvas en una placa de Petri. Con unas pinzas, elegir con cuidado las larvas y transferirlos a un plato de vidrio lleno de embriones con PBS.
2. Lavar con PBS larvas until toda la comida residual se elimina. Inspeccionar las larvas bajo el microscopio estereoscópico de fluorescencia con 8 a 16X aumentos para desechar todo "larvas de leopardo" que llevan manchas GFP-positivas al azar en todo el cuerpo de la larva (Figura 2A, 2B y la sección Discusión).
   NOTA: Para el aislamiento de ARN incluir una etapa de lavado penúltima en EtOH al 70% durante 1 min.
3. Coloque el plato que contiene larvas seleccionadas en PBS en hielo hasta la disección. larvas proceso dentro de 30 minutos para evitar los efectos adversos de frío y hambre.

3. La disección de las larvas

1. Para diseccionar el EAD bajo un microscopio estereoscópico, utilice un par de pinzas para presionar suavemente la parte media de la larva en contra de la parte inferior del plato de vidrio. Con la segunda pinza, agarra los ganchos de la boca de larvas y tirar de ellos fuera del cuerpo (Figura 2C).
   NOTA: La fuerza de tracción es a menudo suficiente para romper los tallos óptica que conectan el EAD pair para los lóbulos cerebrales. Si el cerebro o sus partes se mantienen unidas a EAD y su presencia no se desea para otras aplicaciones, cortar los tallos óptica con la ayuda de los dos pares de pinzas. Para los tumores invasivos (por ejemplo, Ras ^V12 scrib ¹⁾ la conexión entre la EAD y los lóbulos del cerebro se vuelve cada vez oscurecían con el tiempo por el crecimiento excesivo y la migración de células clonales.
   1. Para preparar el complejo EAD / cerebro con un cordón nervioso ventral intacta (VNC) (Figura 2D), el uso de fórceps para cortar una larva en el medio del cuerpo. Desechar la mitad posterior.
   2. Mantenga la mitad anterior del cuerpo de la larva entre las puntas de un fórceps, dar la vuelta a la larva de adentro hacia afuera empujando los ganchos de la boca con la punta de los segundos fórceps y haciendo rodar la cutícula sobre él con el primer par de fórceps.
2. Con unas pinzas retire con cuidado todos los tejidos extraños (por ejemplo, las glándulas salivales, la grasa corporal, y los intestinos), dejando el par o EADel complejo EAD / cerebro conectado a los ganchos de la boca. Separar los ganchos de la boca de la cutícula que recubre. Libertad para los VNC mediante el corte de las proyecciones axonales se extienden a los músculos del cuerpo y la epidermis (Figuras 1B, 2C, 2D).
   NOTA: Los ganchos de la boca permiten la manipulación segura del tejido con unas pinzas y facilitan hundimiento más eficiente y fácil reconocimiento del tejido durante el lavado. Diseccionado EAD cambio de morfología relativamente rápido cuando se mantienen sin fijar en PBS. Limitar el tiempo de disección para 20-30 min.
3. Para transferir el tejido, capa una punta de micropipeta P20 pipeteando el cuerpo restante de carcasas varias veces arriba y abajo. Para transferir los complejos EAD / cerebro más grande, cortar la punta de la micropipeta P20 con unas tijeras.
   NOTA: El procedimiento de revestimiento es fundamental para evitar que se pegue y pérdida de tejido diseccionado durante la transferencia. El uso de una micropipeta P20 minimiza la transferencia de PBS en la solución de fijación, dilución limitante no deseado.
   1. Para la inmunotinción, transferirel EAD diseccionado en un tubo de 0,5 ml lleno con 400 l de paraformaldehído al 4% fijador (PFA). Usar tubo de 1,5 ml con 1 ml de PFA para EAD mayor / complejos cerebrales destinados para la puntuación de invasividad.
      PRECAUCIÓN: PFA es altamente tóxico. Use guantes y ropa de protección. Evitar el contacto con la piel, los ojos o las membranas mucosas.
   2. Para el aislamiento de ARN transferir el DEE diseccionado en un nuevo plato de vidrio lleno de PBS frío. El uso de fórceps para limpiar EAD de las glándulas linfáticas en el anillo y, para minimizar la contaminación de la muestra.
   3. Separar el EAD de los ganchos de la boca mediante el corte de la conexión entre los discos de antena y ganchos de la boca con unas pinzas (Figura 2E). Para evitar la degradación del ARN y los artefactos de expresión génica, limitar el tiempo de disección para 30 min. Continúe con el paso 7.
      NOTA: Un investigador experimentado puede diseccionar alrededor de 60 larvas en 30 min Tiempo de exclusión necesarios para la recolección de larvas y lavado. los rendimientos totales de ARN dependen del tamaño EAD que varían entre los genotipos y developmentaetapas l. La disección de 80-100 pares de control EAD desde finales de larvas de tercer estadio debe ceder 5-8 g de ARN total.

4. Fijación, inmunotinción, y el montaje

1. Fijar las muestras en PFA fijador durante 25 min mientras nutación a temperatura ambiente. El tiempo de fijación se puede extender hasta 60 minutos sin alterar la morfología del tejido y la antigenicidad de las proteínas.
2. Retirar las muestras fijador y lavar con PBST (PBS con 0,1% de Triton X-100) tres veces durante 10 minutos usando un nutator. Utilice volumen suficiente de PBST para cada etapa de lavado (tubo de 400 l / 0,5 ml).
   NOTA: Se ha corregido complejos / EAD cerebrales destinados para la puntuación de invasividad no requieren inmunotinción. GFP señal se mantiene muy visibles después de la fijación. Continúe con el paso 4.4 para la disección final.
   1. Para la inmunotinción, tejido bloque en 200 l de una solución de bloqueo (PBST con 0,3% BSA) durante 20 min con agitación suave a temperatura ambiente.
      1. Incubar con primanticuerpos ary diluyeron en 100 l de una solución de bloqueo durante la noche a 4 ° C mientras se agita suavemente. Consulte la hoja de datos anticuerpo primario o la literatura publicada para la dilución de anticuerpos recomendada.
         NOTA: puede ser necesario optimizar la dilución del anticuerpo primario.
      2. Después de cinco lavados de 10 min en PBST, tejido mancha con los anticuerpos secundarios fluorescentes diluido en solución de bloqueo mientras agitando suavemente durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C en la oscuridad.
      3. muestras de lavado tres veces en PBST 10 min.
3. Reemplazar PBST con 500 l de solución de tinción DAPI. Para etiquetar F-actina, añadir faloidina conjugada con un colorante fluorescente a la solución de tinción DAPI. Después de 15 min de nutación en la oscuridad, lavar el tejido una vez por 10 min con PBST.
   NOTA: etiquetado F-actina se puede llevar a cabo de forma independiente de la tinción DAPI.
4. Para la etapa de la disección final, la transferencia de tejido nuevo en un recipiente de vidrio lleno de PBS utilizando una pi 1 mlpette. El uso de los dos pares de pinzas recortar de los ganchos de la boca.
   1. Separar los cerebros que serán utilizados para la cuantificación de la invasividad de la EAD cortando el tallo óptico como EAD cubierto pueda obstaculizar el análisis.
5. Colocar una gota de medio de montaje (15 l para un 22 mm x 22 mm cubreobjetos) en una diapositiva objetivo. Con la ayuda de fórceps consejos, distribuir el medio en una capa delgada. Transferir EAD, el cerebro o los complejos de EAD / cerebro en el medio de montaje con una micropipeta P20.
6. Use las puntas de las pinzas o una varilla de tungsteno para distribuir los tejidos y enderezar el VNC en la diapositiva.
7. Para evitar la formación de burbujas durante el montaje, el primer toque de un borde de un cubreobjetos para el medio de montaje y luego baje lentamente sobre el medio de montaje con la ayuda de unas pinzas. Use pequeños trozos de papel o tejido del filtro toallita para absorber el exceso de medio de montaje alrededor de los bordes cubreobjetos.
   NOTA: DABCO / poli (alcohol vinílico) 4-88 montaje endurece medianasa 4 ° C en una hora. Las diapositivas se pueden almacenar durante meses a 4 ° C.

5. Imagen confocal

1. Adquirir secciones confocales individuales y pilas utilizando un microscopio confocal equipado con 20X, 40X y objetivos de aceite 60X.
2. Evitar la saturación de píxeles. Utilizar los mismos parámetros de adquisición de imágenes, incluyendo resolución de la imagen, la potencia de entrada del láser, la ganancia, offset, promediado marco, un tamaño de paso en una serie Z y mantener estos valores para todos los genotipos para permitir una comparación de intensidades de los píxeles entre los diferentes genotipos ^21,22.
   NOTA: Para la visualización del complejo / cerebro EAD, generar proyecciones de máxima y coser respectivas imágenes, vecinos. Para la preparación imagen final, utilizar el software de procesamiento de imágenes para el montaje posterior del panel y para ajustar el brillo y el contraste.

6. Cuantificación de la invasividad tumoral

1. Definir un sistema de puntuación que va a caracterizar los diferentes niveles de invasivenes tumoraless teniendo en cuenta el patrón espacial de la invasión y la cantidad de células positivas para GFP se extienden en el cerebro y VNC. Preparar hojas de evaluación de la documentación (Figura 3A).
2. Monte al menos 80 fija cerebro intacto para cada genotipo en una diapositiva utilizando 40 l de la solución de montaje por 24 mm x 50 mm cubreobjetos.
   1. Para permitir que la puntuación objetiva, pida una parte neutral para anonimizar las diapositivas, de modo que el procedimiento de puntuación es imparcial. Evaluar diapositivas anonimizados por dos miembros del laboratorio independiente. Divulgar genotipos sólo después de que se terminó el conteo.
3. Evaluar el grado de malignidad de una puntuación a ciegas de cerebros montados bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia equipado con un conjunto de filtros de GFP. Use un marcador para etiquetar los cerebros que ya han sido vistos para evitar el doble cómputo (Figura 3B).
4. Calcular el porcentaje de cerebros que caen en cada una de las categorías definidas invasivos por genotipo. Determinar los s estadísticosignificance utilizando una prueba de chi-cuadrado (Figura 3C).

7. Aislamiento de ARN, tratamiento DNasa, y comprobación de la calidad

NOTA: Todos los reactivos (soluciones, recipientes de plástico) que se utiliza en los siguientes pasos debe estar libre de la actividad RNasa. Siempre use guantes y una capucha química para trabajar con disolventes orgánicos.

1. Transferir el DEE limpia con una punta de micropipeta P20 revestido en 1,5 ml tubo.
2. Deje disipador de tejido para la parte inferior del tubo, retirar con cuidado PBS y sustituirla por 100 de reactivo de lisis de ARN l (suficiente para un máximo de 140 EAD).
3. Lyse tejido por agitación. En este punto, las muestras pueden ser congelados en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C o directamente procesada con un protocolo de aislamiento de ARN estándar.
   NOTA: Las muestras de genotipos similares de múltiples rondas de disección se pueden agrupar en vez de reactivo de lisis de ARN.
4. Llenar el volumen de muestra de 0,9 ml con el reactivo de lisis de ARN. Añadir 0,2 ml de cloroformo y mezclar muestras Vigorously de 15-20 seg.
5. Después de 2-3 minutos de incubación a temperatura ambiente, centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
6. Transferencia incoloro superior ARN que contiene la fase acuosa a un tubo nuevo sin perturbar la interfase. Manténgase alejado de la interfase, ya que contiene proteínas y ADN genómico.
   NOTA: El volumen recuperado debe ser aproximadamente 60% del volumen de reactivo de lisis de ARN usado para la homogeneización.
7. Precipitar el ARN mediante la adición de 0,5 ml de alcohol isopropílico. Vortex e incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 min.
8. Centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
9. Eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento de ARN una vez con 600 l de etanol al 75%. Después de un corto vórtice y centrifugación (10.000 xg durante 7 minutos a 4 ° C) deseche todo el etanol y dejar que el precipitado de ARN se seque al aire durante 5-10 minutos colocando el tubo abierto en un pañuelo de papel limpio limpie.
   NOTA: El sedimento de ARN podría ser visible como un pequeño opaca st / blancomadura en la parte inferior del tubo o invisible. Las gotas de etanol restantes pueden eliminarse cuidadosamente con la punta de la micropipeta P10.
10. Disolver ARN en 50 l de agua tratada con DEPC por agitación o solución que pasa varias veces a través de una punta de pipeta.
11. Para minimizar la contaminación con el ADN genómico, el tratamiento de RNA total con DNasa mediante la adición de 50 l de una mezcla que contiene 1 l de DNasa (2 U / l) y 10 l de 10x tampón de ADNasa en agua tratada con DEPC. Vortex y centrifugar.
12. Incubar las muestras a 37 ° C en un baño de agua o un bloque de calentamiento durante 30 a 40 min. Después de la incubación, añadir 100 l de agua tratada con DEPC en cada muestra.
13. Para inactivar la actividad enzimática y el ARN limpia de DNasa, añadir 200 l de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1) de la solución, de vórtice durante 1 min y centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 7 minutos a 4 ° C.
14. transferir con cuidado la fase acuosa superior que contiene el ARN en un tubo nuevo. Añadir un volumen igual (200 l)de cloroformo, mezclar y repetir el paso de centrifugación desde arriba.
15. Recoger cuidadosamente la fase superior y precipitar el ARN mediante la adición de 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M, pH 5,2 preparado en DEPC H ₂ O y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Mezclar bien con un vórtex.
    NOTA: La adición de 0,5 l de glucógeno (20 mg / l) a una mezcla de precipitación ayuda a visualizar el sedimento de ARN. Para minimizar la pérdida de ARN, utilizar tubos siliconados, bajo vinculante microcentrífuga de 1,5 ml.
16. Precipitar ARN a -20 ° C durante al menos 1 hr.
    NOTA: La incubación puede llevarse a cabo durante la noche. Las muestras se pueden colocar a -80 ° C también.
17. ARN de pellets por centrifugación a 10.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Lavar y sedimento seco siguiendo la descripción de 7,9.
18. Disolver ARN en 10-15 l de agua tratada con DEPC. ARN almacenar a -80 ° C.
19. Determinar la cantidad y pureza del ARN midiendo la DO a 230 nm, 260 nm y 280 nm usando un espectrofotómetro. Calcula ARN concentration mediante la aplicación de la convención de que 1 DO a 260 nm es igual a 40 mg / ml de ARN.
    NOTA: La relación A _260/280 de ARN "puro" es igual a 2,0, mientras que una relación A _260/230 debe estar en el rango de 2,0 a 2,2. Las muestras de ARN con una relación de A _260/280 entre 1,7 y 2,0 son adecuados para aplicaciones posteriores tales como la síntesis de ADNc. Para la preparación de bibliotecas de ARNm-seq la calidad y la cantidad de ARN se controlen mediante un sistema de electroforesis automatizada. La relación 28S / 18S debe estar por encima de 1,8.

Resultados

Para demostrar el potencial de la técnica eyFLP-MARCM para generar parches GFP-marcado de los genotipos definidos en Drosophila EAD, se indujeron tres tipos de clones: (1) control que expresa solamente GFP, (2) los tumores malignos que expresan una forma oncogénica de la pequeña G-proteína Ras (Ras ^V12) en un fondo de la pérdida homocigótica de un garabato gen supresor de tumor (scrib ^1), y (3) sobrecrecimiento pero no invasiva ras

Discusión

Las técnicas para generar mosaicos genéticos en Drosophila son algunas de las herramientas más sofisticadas para el análisis y la manipulación de la función del gen ^33. El sistema eyFLP-MARCM ha demostrado potente y robusto, ya que permite la inducción de, clones genéticamente definidos marcados visualmente de una manera restringida espacialmente, es decir, en los tejidos donde el potenciador sin ojos está activo ^9,18. Esto es particularmente importante cuando las lesione...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agar	Gewü rzmü hle Brecht, Eggenstein, Alemania	00262-0500 Receta de comida para	moscas: Prepare 20 L de comida para moscas con 160 g de agar, 360 g de levadura, 200 g de harina de soja, 1,6 kg de harina de maíz amarillo, 1,2 L de extracto de malta, 300 ml de jarabe de maíz ligero, 130 ml de ácido propiónico y 200 ml de nipagin al 15%. La comida para moscas debe cocinarse durante 1 hora a 85   °C.
Jarabe de maíz	Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Alemania	01939
Ácido propiónico	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania	6026.1
Reforma de harina	de maízKontor GmbH, Zarrentin, Alemania	4010155063948
malta	CSM Deutschland GmbH, Bremen, Alemania	728985
Harina de soja	Stockmeier Food GmbH, Herford, Alemania	1000246441010
Levadura	Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Alemania	210099K
Metil-4-benzoato/ Nipagin	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania	H5501	Prepare una solución madre al 15% con un 70%
de EtOH Viales de alimento para moscas Drosophila	Kisker Biotech, Steinfurt, Alemania	789008
Tapones de viales	K-TK e.K., Retzstadt, Alemania	1002
Botellas de comida para moscas Drosophila	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania	960177
Tapones para botellas	K-TK e.K., Retzstadt, Alemania	1002 S Poli
(alcohol vinílico) 4-88/[-CH2CHOH-]n	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania	81381	Receta del medio de montaje: Disolver 6 g de poli(alcohol vinílico) 4-88 en 39  ml de Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8,5) y 12,5 ml de glicerol. Revuelva durante la noche a 50   ° C y centrífuga 20  min a 5.000 rpm. Añadir DABCO al sobrenadante para obtener una concentración final del 2,5%. Almacene las alícuotas a -20  °C.
1,4-diazabicitilo[2.2.2]octano/ DABCO	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania	D2522
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania	9002-93-1
Solución salina tamponada con fosfato/ PBS			137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 y 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 en Millipore H2O
PBST			0,1% Triton X-100 en PBS
Paraformaldehído/PFA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania	158127	4% Receta de fijación de PFA: Disolver 4  g de PFA en 80 ml de Millipore H2O en una placa agitadora magnética calentada a 55  °C. Añadir 1 M de NaOH gota a gota hasta que se disuelvan todas las partículas de PFA. Añadir 10 ml 10x PBS y ajustar el pH a 7,4 con 1 M de HCl. Mezclar en 100 µ l Triton X-100 y llénelo con Millipore H2O hasta 100 ml. Guarde las alícuotas a -20 °C. Evite la descongelación repetida. (PRECAUCIÓN: El PFA es altamente tóxico. Prepare el fijador de PFA en una campana extractora. Use un aparato de respiración autónomo, guantes y ropa. Evite el contacto con la piel, los ojos o las membranas mucosas).
Albúmina sérica bovina/ BSA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania	A3059	Receta de solución bloqueante: Disuelva el 0,3% de BSA en PBST
Faloidina marcada con fluorescencia	Invitrogen, Karlsruhe, Alemania, Sondas moleculares	A12379, A22283, A22284	Solución madre de faloidina: Disolver el polvo (300 U) en 1,5 ml de metanol. Almacenar a -20 °C. Para la tinción, utilícelo en dilución 1:250 (A12379, A22283) y 1:100 (A22284) en PBST.
4',6-Diamidino-2-fenilindol Dihidrocloruro/ DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania	6335	Solución de tinción DAPI: Prepare una solución madre de 5 mg/ml en Millipore H2O y almacene las alícuotas a 4 °C. Utilizado en dilución 1:1,000 en PBST.
Anticuerpo anti-H2 de ratón	Kurucz et al., 2003		Utilizado en dilución 1:500 en solución bloqueante
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch, Suffolk, Reino Unido	715-175-151	Utilizado en dilución 1:500 en solución de bloqueo
Pinzas Dumont # 5	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania	11295-10
Placa de embrión de vidrio (30  mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Alemania	E90
Agujas de tungsteno	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania	10130-20
Soporte de alfiler niquelado	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania	26018-17
Portaobjetos de microscopio	VWR, Darmstadt, Alemania	631-1553
Cubreobjetos 22 x 22 mm (#1 Menzel-Glä ser)	VWR, Darmstadt, Alemania	631-1336
Cubreobjetos 24 x 50 mm (0.13-0.16  mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Alemania	1076371
Toallitas de precisión Kimtech Science	Thermo Scientific, Schwerte, Alemania	06-677-70
Microscopio estereoscópico de disección	Olympus, Hamburgo, Alemania	SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japón)
Microscopio estereoscópico fluorescente	Olympus, Hamburgo, Alemania	SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japón) con cámara	CCD DP72Equipado con el conjunto de filtros de paso de banda azul estrecho para la excitación de GFP, otros fluorocromos excitables azules (filtro de excitación BP460-480 nm, filtro de barrera BA495-540 nm) y filtro de barrera de excitación verde estrecho y paso largo para RFP y otros fluorocromos excitables verdes (filtro de excitación BP530-550, filtro de barrera BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11.
Microscopio confocal	Olympus, Hamburgo, Alemania	FV1000	Equipado con microscopio IX81 invertido. Objetivos: 20 veces; UPlan S-Apo (NA 0.85), 40 veces; UPlanFL (NA 1.30) y 60× UPlanApo (NA 1.35). Láseres: Diodo láser UV LD405 (50  mW), Láser de argón, multilínea 457/(476)/ 488/515 (40  mW), diodo láser amarillo/verde LD560 (15  mW) y diodo láser rojo 635 (20  mW). Software: Fluoview 2.1c Software
Drosophila incubadora refrigerada	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Alemania	Sanyo MIR553
Botella con atomizador	VWR, Darmstadt, Alemania	215-8105
BD Clay Adams Nutator Mezclador	VWR, Darmstadt, Alemania	15172-203
ELMI Agitador Mecedora Digital	VWR, Darmstadt, Alemania	DRS-12
5 PRIME Reactivo de lisis Isol-RNA	VWR, Darmstadt, Alemania	2302700	El protocolo es compatible con otros reactivos basados en TRIzol, ejemplo, TRIreagent de Sigma (Cat. Nr.T9424), reactivo TRIzol de Thermofisher (Nº de cat. 15596).
Pirocarbonato de dietilo/ DEPC	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania	D5758	Diluir DEPC 1:1.000 en Millipore H2O, agitar durante la noche y esterilizar en autoclave.
Fenol ultrapuro:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1)	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania	15593-031
Cloroformo	Merck, Darmstadt, Alemania	102445
TURBO DNasa (2 U/µ l)	Thermo Scientific, Schwerte, Alemania	AM2238
Invitrogen UltraPure Glycogen	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania	10-814-010
Acetato de sodio trihidrato	VWR, Darmstadt, Alemania	27652.232	Prepare una solución de acetato de sodio de 3 M con DEPC-H2O y ajuste el pH a 5,2
2-Propanol	Merck, Darmstadt, Alemania
Etanol	Merck, Darmstadt, Alemania	100983	Prepare una dilución de EtOH al 75% con DEPC-H2O.
espectrofotómetro UV/VIS NanoDrop ND-8000	Thermo Scientific, Schwerte, Alemania	ND-8000
Microcentrífuga Eppendorf (refrigerada)	Thermo Scientific, Schwerte, Alemania	5417R
Experion RNA StdSens Analysis Kit	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemania	7007103
Estación de electroforesis automatizada Experion	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemania	7007010
SuperScript III transcriptasa inversa	Thermo Scientific, Schwerte, Alemania	18080044
Oligo d(T) Primer	Integrated DNA Technologies, Lovaina, Bélgica		Prepare 100 µ M stock de soluciones en DEPC-H2O y almacene a -20 &0 ° C
dNTP Mezcla	Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, Francia	4030	Alícuotas de almacén de 25 µ l a -20 y grados; C
CFX96 Touch Sistema de detección de PCR en tiempo real	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemania	1855195
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemania	170-8882
Placas de PCR rígidas de 96 pocillos, pared delgada	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemania	HSP9601
Microseal 'B' Film	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemania	MSB1001
rp49 Imprimación directa	Integrated DNA Technologies, Lovaina, Bélgica		5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'
rp49 Imprimación inversa	Integrated DNA Technologies, Lovaina, Bélgica		5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'
mmp1 Imprimación directa	Integrated DNA Technologies, Lovaina, Bélgica		5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'
mmp1 Imprimación inversa	Integrated DNA Technologies, Lovaina, Bélgica		5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'