Artículo de método

Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

DOI:

10.3791/54587

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23 de octubre de 2016

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1Department of Biology, The Johns Hopkins University, 2Department of Biological Sciences, Duquesne University

En este artículo

Resumen

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La cuantificación precisa de los eventos de tráfico vesicular a menudo proporciona información clave sobre las funciones de proteínas específicas y los efectos de las mutaciones. En este artículo se presentan métodos para utilizar la pHluorina supereclíptica, una variante de GFP sensible al pH, como herramienta para la cuantificación de eventos endocíticos en células vivas mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa y citometría de flujo.

Resumen

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proteína fluorescente verde (GFP) y sus variantes son ampliamente utilizados para el estudio de las herramientas de localización de la proteína y la dinámica de los acontecimientos tales como la remodelación del citoesqueleto y el tráfico vesicular en las células vivas. utilizando metodologías cuantitativas GFP fusiones quiméricas se han desarrollado para muchas aplicaciones; Sin embargo, la GFP es algo resistente a la proteolisis, por tanto, su fluorescencia persiste en el lisosoma / vacuola, lo cual puede dificultar la cuantificación del tráfico de carga en la vía endocítica. Un método alternativo para la cuantificación de los eventos de tráfico de endocitosis y post-endocítica hace uso de superecliptic pHluorin, una variante sensible al pH de GFP que se apaga en ambientes ácidos. fusión quimérica de pHluorin a la cola citoplasmática de carga transmembrana proteínas resulta en una amortiguación de la fluorescencia tras la incorporación de la carga en los cuerpos multivesiculares (MVBs) y la entrega a la luz del lisosoma / vacuola. Por lo tanto, extinción de la fluorescencia vacuolar facilita cuantificación de endocitosis y primeros eventos en la vía endocítica. Este documento describe los métodos que utilizan cargas de etiquetado pHluorin para la cuantificación de la endocitosis por medio de microscopía de fluorescencia, así como ensayos basados ​​en la población usando citometría de flujo.

Introducción

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el tráfico vesicular juega un papel importante en el mantenimiento de la identidad y la función orgánulo en células eucariotas, y es un mecanismo clave para la regulación de proteínas y de la membrana composición de compartimientos celulares individuales. En la membrana de plasma, fusión de vesículas exocytic ofrece nuevas proteínas y las membranas de la superficie de la célula, mientras que las vesículas generadas a través de endocitosis eliminar membrana y proteínas de la superficie para el reciclaje o la orientación al lisosoma posterior. Por lo tanto, la endocitosis es importante para la absorción de nutrientes y para respuestas al entorno extracelular. Exocitosis y endocitosis están equilibrados para regular el área de superficie de la membrana plasmática, y para permitir renovación de las proteínas dañadas.

Los estudios en levaduras y células de mamíferos han identificado un gran número de proteínas implicadas en la endocitosis, así como múltiples vías endocítica que promueven la internalización de cargas específicas o que actúan en respuesta a una variedad de encondiciones ambientales. La vía mejor estudiada es la endocitosis mediada por clatrina (CME), en la que las proteínas de clatrina y accesorias citosólicas se ensamblan en una estructura de capa para estabilizar la vesícula endocítica naciente. Los experimentos en los ciernes levadura Saccharomyces cerevisiae han arrojado información clave en la dinámica y la orden de contratación para muchas proteínas endocítica 1-3. En particular, la maquinaria CME está altamente conservada a través de la evolución de tal manera que la mayoría de las proteínas relacionadas con el CME en la levadura tiene ortólogos humanos; por lo tanto, la levadura en ciernes ha sido una herramienta importante para la comprensión de los mecanismos de endocitosis que están conservados en eucariotas superiores. Por ejemplo, los estudios que utilizan levadura en ciernes determinaron que la formación y la maduración de las estructuras de CME (denominado a los parches de actina como corticales en la levadura) implica el reclutamiento secuencial de muchas proteínas, a partir de clatrina y adaptador de proteínas de unión con la carga, seguido por reclutamiento de accesorio endocítica adicional proteínas,la activación de la polimerización de actina mediada por 3 Arp2 /, y el reclutamiento de las proteínas implicadas en 1,2 vesícula escisión. El reclutamiento de proteínas de maquinaria CME a cortical parches de actina es un proceso altamente ordenado y estereotipada, y el orden preciso de la contratación para muchas proteínas se ha establecido con respecto a otros componentes de la maquinaria de CME. Es importante destacar que estudios recientes han confirmado una orden similar de reclutamiento para las proteínas de CME en depresiones revestidas de clatrina en células de mamífero 4.

Además de CME, muchos tipos de células poseen una o más vías de clatrina independiente endocítica (CIE) que se basan en mecanismos alternativos para promover la formación de vesículas y la internalización de la membrana plasmática 5-7. En la levadura, recientemente hemos identificado una vía de CIE que utiliza la pequeña GTPasa Rho1 y su factor de activación de guanina intercambio de nucleótidos (GEF), Rom1 8,9. Rho1 activa el formin Bni1 para promover la polimerización de la actina 10,11, que se requiere para esta forma de endocitosis clathrin-independiente en la levadura 12. Por otra parte, la familia α-arrestina de proteínas reclutar la ubiquitina ligasa Rsp5 para promover la ubiquitinación de carga y la posterior interiorización a través de CME 13-17, y también promover la internalización de carga a través de la vía de CIE, posiblemente a través de la interacción directa con proteínas implicadas en la CIE 18. Una variedad de vías CIE también existen en células de mamífero, incluyendo las vías de clathrin independiente y fagocíticas que se basan en la ortholog Rho1, RhoA 9,19. El papel de RhoA en mamíferos CIE es poco conocida; por lo tanto, los estudios en levadura en ciernes pueden proporcionar conocimientos mecánicos adicionales que son aplicables a CIE mamíferos.

la cuantificación exacta de los acontecimientos de endocitosis puede proporcionar información importante acerca de las funciones de las proteínas específicas en la regulación de la endocitosis, y puede revelar los efectos de las mutaciones sobre la internalización de carga o progression a través de la vía endocítica. Para este propósito, los métodos bioquímicos se pueden utilizar para controlar la absorción de ligando o para medir las tasas de degradación de las proteínas de carga endocítica. En las células vivas, la fusión de proteína verde fluorescente (GFP) y sus variantes a cargas de interés permite la visualización directa de transporte de carga. Sin embargo, cargas GFP-etiquetados son de uso limitado para la cuantificación de la endocitosis porque GFP es resistente a la degradación en el lisosoma (o vacuola en levaduras). Por otra parte, la fluorescencia de GFP es sólo parcialmente sensible a los cambios en el pH, y permanece detectable dentro de la vacuola lumen 20,21. Por consiguiente, la fluorescencia de la etiqueta GFP persiste en la vacuola mucho después de que el resto de la carga se ha degradado, y toda la cuantificación basada en células de la intensidad de la carga puede ser inexacto debido a la fluorescencia de GFP a largo plazo en la vacuola.

Con el fin de superar los inconvenientes de la fluorescencia GFP vacuolar, que previamente hizo uso de pH supereclipticluorin, una variante sensible al pH de GFP que fluoresce brillantemente a pH neutro, pero pierde la fluorescencia en ambientes ácidos, tales como el lumen de la vacuola / lisosoma 20,22,23. La colocación de una etiqueta pHluorin en la cola citoplásmica de cargas endocítica permite la visualización de las cargas en la membrana plasmática y en los endosomas tempranos, donde la etiqueta pHluorin permanece expuesto al citoplasma (Figura 1A). A medida que maduran los endosomas tempranos, el complejo endosomal clasificación exigida en los paquetes de transporte (ESCRT) maquinaria cargas localizadas en la superficie en vesículas que brotan en el lumen del endosoma, la generación de cuerpos multivesiculares (MVBs) 24. Para las cargas que se han incorporado en vesículas internas MVB, la etiqueta pHluorin mira hacia el lumen de la vesícula. vesículas MVB internos se acidifican; por lo tanto, cargas marcadas con fluorescencia pHluorin pierden en los endosomas tempranos a medida que maduran en MVBs 20. fusión subsiguiente de la MVB con la vacuola entrega los contenidos luminales MVBpara la degradación, las etiquetas y pHluorin permanecen apagados en el ambiente ácido del lumen vacuola.

Este documento proporciona una descripción detallada de los ensayos cuantitativos endocítica utilizando cargas con etiquetas pHluorin citoplasmáticos en la levadura. Las cepas que expresan cargas de etiquetado pHluorin se pueden utilizar en ensayos cinéticos y / o de punto final, dependiendo de las propiedades y el tráfico de comportamiento de la carga específica. Además, algunos cargamentos de etiquetado pHluorin son susceptibles de métodos de análisis de alto rendimiento, incluyendo citometría de flujo. Es importante destacar que la etiqueta pHluorin es una herramienta versátil para el estudio de eventos endocítica en las células vivas, lo que permite la cuantificación de la endocitosis y la comparación de la función endocítica de tipo salvaje y cepas mutantes.

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Protocolo

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1. Soluciones y Medios de Comunicación

  1. Preparar los Stocks De acuerdo con los medios de comunicación, y las placas:
    1. Para preparar 10x YNB, se disuelven 67 g de base nitrogenada de levadura carece de los aminoácidos en 1 L de agua. Esterilizar por filtración a través de un filtro de 0,22 micras de nitrocelulosa.
    2. Preparar medio YNB usando 1x YNB (de 10x) con 2% de dextrosa (de una estéril 50% w / v de valores) y la mezcla de 1x amino ácido / nutriente (de 100x de valores, véase la etapa 1.1.4). Para la selección de plásmido, omitir aminoácidos individuales o nutrientes según sea necesario. Para la inducción de la expresión Mup1, adicionalmente omitir metionina a partir de la mezcla de aminoácidos / nutriente.
    3. Preparar placas de YNB utilizando 1x YNB (de 10x), 2% de dextrosa (de una estéril 50% w / v de stock), 0,7 g / L de ácido amino mezcla / de nutrientes (véase la etapa 1.1.5) y 2,5% de agar. Preparar medio de placa por tratamiento en autoclave de 25 g de agar y 0.7 g de amino mezcla de ácido / nutriente por 860 ml de agua. Dejar que la mezcla se enfríe a 55 ° C, a continuación, añadir 100 ml de 10x YNB y 40 ml de of 50% de glucosa. Verter en las placas (aproximadamente 30 ml de medio por placa de 10 cm), dejar que el medio solidifique a temperatura ambiente, y las placas se almacenan a 4 ° C.
    4. Preparar la solución de amino ácido / nutriente Stock 100x (para medio líquido) por disolución de la siguiente en 100 ml de agua desionizada: 0,1 g L-metionina, 0,3 g cada uno de L-leucina y L-lisina, y 0,2 g de cada uno de L-histidina , L-triptófano, adenina y uracilo (otros aminoácidos y nutrientes pueden ser incluidos, según sea necesario para las cepas específicas). Use calor suave si es necesario para disolver y esterilizar a través de un filtro de 0,45 micras de nitrocelulosa. Almacenar a temperatura ambiente con protección de la luz. Para la selección del plásmido, preparar soluciones madre que carecen de componentes específicos, según sea necesario.
    5. Preparar ácido amino / mezcla de nutrientes (por placas) mediante la combinación de lo siguiente: 0,5 g de adenina, 4 g de L-leucina, y 2 g cada uno de L-histidina, L-lisina, L-metionina, L-triptófano, L- tirosina y uracilo. Triturar con un mortero y mano de mortero, y almacenar con Proprotección de la luz. Para la selección de plásmido, se preparan mezclas que carecen de componentes específicos, según sea necesario, y el uso de 0,7 g de mezcla de aminoácidos por litro de medio de placa (véase la etapa 1.1.3).
  2. Preparar portaobjetos de cámara de 8 pocillos para microscopía mediante el recubrimiento de la superficie de la corredera con concanavalina A (ConA). A cada pocillo de la diapositiva cámara, añadir 25 l de 2 mg / ml de ConA disueltos en agua. Utilizando una punta de pipeta, se extendió la cona través de la superficie inferior del pozo, y luego permitir que el portaobjetos se seque al aire a temperatura ambiente durante al menos 4-8 horas. Lo ideal es utilizar la cámara de diapositivas dentro de las 24 horas de recubrimiento ConA.
  3. Generar cepas de levadura con fusiones en marco de GFP o pHluorin a la carga endocítica de interés utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) método de integración basada describe en Longtine et al. y Goldstein y McCusker 25,26.
    NOTA: Los plásmidos que contienen pHluorin etiquetado casetes con genes de resistencia para kanamicina (KANMX6) y (nourseothricin NATMX4) se ha descrito previamente 20.
    1. Amplificar casetes GFP o pHluorin que contienen marcadores seleccionables con cebadores que contienen secuencias adicionales específicos para el sitio de integración genómica 20,25.
    2. Transformar el producto de PCR resultante en la cepa de levadura deseada usando el método de acetato de litio 27.
    3. Seleccionar para la integración de la casete por las células que crecen en placas de YPD que contienen el fármaco apropiado. Para preparar las placas, autoclave 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, 0,1 g de triptófano y 25 g de agar en 960 ml de agua. Antes de verter las placas, dejar que la mezcla se enfríe a 55 ° C, a continuación, agregar 40 ml de 50% de glucosa y, o bien G418 a una concentración final de 200 mg / ml para la selección KANMX6, o nourseothricin a una concentración final de 100 mg / ml para NATMX4 selección.
    4. Confirmar la integración de la GFP o etiqueta pHluorin en colonias individuales por PCR y / o transferencia de Western usando anticuerpos anti-GFP,así como por la detección de la proteína marcada por microscopía de fluorescencia 20.
      NOTA: cepas de levadura específicas y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en las Tablas 1 y 2, respectivamente.

2. El punto extremo Ensayo de fluorescencia en estado estacionario de manera constitutiva internalizada por carretera Endocítica

  1. Inocular células (~ 3 colonias pequeñas) en 5 ml de medio YNB que carecen de aminoácidos o nutrientes según se requiera para el mantenimiento del plásmido (si es aplicable). Se cultivan las células durante 16-24 horas en un incubador con agitación orbital a 30 ° C, con 250 rpm de agitación. Alternativamente, consecutivas a ~ 1-2 mm colonia de células en una placa de YNB carece de los aminoácidos o nutrientes para la selección de plásmido, y hacer crecer las células durante la noche a 30 ° C.
  2. Medir la densidad (OD 600) de cada cultivo de una noche usando un espectrofotómetro. Preparar una dilución 5 ml a 0.35-0.4 OD 600 / ml en medio YNB carece de los aminoácidos o nutrientes para las zonamantenimiento smid, y crecer durante aproximadamente 3 horas a 30 ° C con agitación. Si se utilizan células manchadas en un plato, omita este paso y continúe con el paso 2.4 (véase más adelante).
  3. Medir la densidad (OD 600) de las células, que ahora debe ser de entre 0,6 a 1,0 OD 600 / ml. Transferir 1,5 ml de cultivo a un tubo de microcentrífuga, y células de pellets a 8.000 rpm (6.800 xg) durante 2 min. Retire 1.475 l de sobrenadante.
  4. Llevar células a un microscopio de fluorescencia. Antes de la formación de imágenes de cada muestra, preparar una diapositiva resuspendiendo las células en el medio restante, y montar 3 l de suspensión de células bajo un cubreobjetos. Alternativamente, se preparan portaobjetos de cámara de 8 pocillos como se describe a continuación en el protocolo 3, utilizando medio YNB como apropiado para la selección del plásmido. Idealmente, las células de imagen con un 100X, 1,4 o mayor apertura numérica (NA) de inmersión en aceite de lente de objetivo, una cámara de 12 o de 16 bits, y los filtros de excitación / emisión optimizados para la fluorescencia de GFP.
    NOTA: Si utiliza células cultivadas o rayandona placa, preparar la diapositiva mediante la colocación de 3 l de medio YNB fresco en una hoja de la cubierta. Utilizando una punta de pipeta, se recoge una pequeña colonia de células de la placa, dispersar las células en el medio YNB, y montar la suspensión resultante en un portaobjetos de vidrio inmediatamente antes de la imagen.
  5. Image 4-6 campos aleatorios de células para cada condición, usando los mismos parámetros de adquisición (es decir, conjuntos de filtros y el tiempo de exposición) para todas las imágenes dentro de un experimento.
    NOTA: La toma de una imagen DIC campo claro o para cada campo puede ser útil para las células en las que la señal pHluorin se apaga en MVB y compartimentos vacuolar.
  6. Cuantificar la intensidad de fluorescencia de al menos 30-50 células para cada condición (véase el protocolo 5).

3. Ensayo cinético para la cuantificación de la endocitosis de Cargos que se someten a endocitosis Regulado

  1. Inocular 2-3 colonias de células de levadura (aproximadamente 2 mm de diámetro por colonia) en 5 ml de medio YNB que carece de metionina y añadiraminoácidos itional o nutrientes para el mantenimiento de la selección del plásmido. Crecer los cultivos durante 16-24 horas a 30 ° C con agitación.
    NOTA: En este documento, los protocolos para el estudio de las proteínas de carga endocítica regulados harán uso de la permeasa de metionina, Mup1. Otras cargas que se someten a endocitosis regulada también son adecuados para el marcado con pHluorin (por ejemplo, el uracilo permeasa Fur4, que se acumula en la membrana plasmática en ausencia de uracilo, e internaliza en respuesta a la aplicada externamente uracilo); para estas cargas, las condiciones de los medios de comunicación deben ser modificados para reflejar las condiciones específicas de expresión, de inducción y de internalización para que dicha carga.
  2. Se mide la densidad (OD 600) de cada cultivo de la noche aproximadamente 3 horas antes de exponer. Preparar una dilución 5 ml a 0.35-0.4 OD 600 / ml en medio YNB que carecen de ácidos metionina y aminoácidos adicional o nutrientes para el mantenimiento del plásmido, y crecer a 30 ° C con agitación.
  3. Pre-equilibrar los microsfrente de cámara ambiental o etapa climatizada (si está disponible) a 30 ° C durante la incubación de 3 h de paso 3.2.
  4. Transferir 1 ml de cultivo celular a un tubo de microcentrífuga, y células de pellets a 8000 rpm (6800 xg) durante 2 min. Eliminar 975 l de sobrenadante.
  5. Preparar un tratado con ConA, porta con cámara de 8 pocillos con fondo de vidrio para la imagen (protocolo 1.2).
  6. Añadir 200 l de medio YNB que carecen de ácidos metionina y aminoácidos adicional o nutrientes para la selección de plásmido a cada pocillo. Resuspender el sedimento celular de la etapa 3.4 en el sobrenadante restante, y soltar 2,5 l de suspensión celular en el centro de cada pocillo. Dispersar células en toda la superficie del pozo pipeteando arriba y abajo, y permiten que las células se asienten durante 5-10 minutos.
  7. Colocar el portaobjetos de cámara en un microscopio de fluorescencia invertida equilibrada a 30 ° C (véase el paso 3.3). Localizar un campo de las células utilizando iluminación de campo claro.
  8. Añadir 50 l de medio YNB que contienen 100 mg / ml de metionina(Pre-calentado a 30 ° C) a los 200 l de medio en el pocillo para obtener una concentración de metionina final de 20 mg / ml. No perturbar el medio en el pozo con el fin de evitar que las células de flotación de la parte inferior.
  9. Permitir que las células equilibrar durante 2 min antes de comenzar la formación de imágenes. Inmediatamente antes de la captura de la primera imagen, ajustar el microscopio al plano focal deseada (típicamente, un plano focal ecuatorial funciona mejor).
  10. Adquirir imágenes GFP y campo claro (o DIC) a intervalos de 5 min durante 45-60 min, utilizando los parámetros de adquisición idénticos para todas las imágenes dentro de una serie de tiempo (por ejemplo, 100X 1,4 NA objetivo de inmersión en aceite y 500 mseg el tiempo de adquisición usando el filtro de GFP, 100 tiempo de adquisición mseg usando el filtro de DIC).
    NOTA: Si el escenario del microscopio y software de formación de imágenes no permiten para la corrección automática de la deriva de plano focal, puede ser necesario volver a ajustar manualmente el enfoque antes de cada punto de tiempo de formación de imágenes. Por otra parte, los tiempos de adquisiciónvarían entre microscopios debido a diferencias en la iluminación y filtros, y las condiciones óptimas deben ser determinados manualmente antes de comenzar el experimento. Si se utiliza una carga endocítica que no sea Mup1, puede ser necesario modificar los intervalos de tiempo de adquisición y formación de imágenes, así como la duración del experimento, para reflejar la cinética de internalización de esa carga.
  11. Cuantificar la intensidad de fluorescencia de las células individuales en cada punto de tiempo (véase el protocolo 5), y expresar los valores como un porcentaje de la intensidad inicial de la primera imagen.

4. punto final del ensayo para la cuantificación de Endocítica Cargos que se someten a endocitosis Regulado

  1. Preparar las células para obtener imágenes como se describe en el protocolo 3 (pasos 3.1 a 3.6).
  2. Imagen 4-5 campos aleatorios de células para cada condición, inmediatamente antes de la adición de metionina, utilizando filtros de campo claro y GFP conjuntos.
  3. Añadir 50 l de medio YNB que contiene 100 mg / ml de metionina (antes de la guerramed a 30 ° C) a los 200 l de medio en el pozo para obtener una concentración de metionina final de 20 mg / ml. No perturbar el medio en el pozo con el fin de evitar que las células de flotación de la parte inferior.
  4. Image 4-5 campos aleatorios de células 30 min después de la adición de metionina, utilizando los mismos parámetros de adquisición como para el punto de tiempo 0 min (paso 4.2).
  5. Cuantificar la intensidad de fluorescencia de al menos 30-50 células para cada punto de tiempo (véase el protocolo 5). expresan valores como el porcentaje de Mup1-pHluorin internalizada después de 30 min mediante la fórmula: [intensidad media a 0 min - La media de la intensidad en 30 min] / [intensidad media a 0 min] x 100%.
    NOTA:. Es posible realizar simultáneamente hasta ocho puntos finales ensayos escalonando la hora de inicio de cada ensayo de la Tabla 3 proporciona un flujo de trabajo de ejemplo para ocho ensayos simultáneos.

5. Análisis post-adquisición

  1. Exportación de imágenes de software de adquisición como un 16 bits formato de archivo de imagen etiquetada (.tif o .tiff).
    NOTA: Otros formatos de archivos también pueden ser adecuados, e idealmente deben usar algoritmos de compresión sin pérdidas. imágenes de 8 bits en general no son adecuados para los propósitos de cuantificación.
  2. Abrir archivos utilizando el software ImageJ (libremente disponible con la opción "Abrir" en el menú "Archivo". Utilice la imagen de fluorescencia para la cuantificación, y la imagen de campo claro / DIC como referencia para identificar la ubicación de las células y para excluir las células muertas (si está presente ), que aparecen más oscuras que las células vivas cuando se ve por la DIC y se autofluorescent cuando se ve con filtros GFP de excitación / emisión.
  3. Realizar una sustracción de fondo la imagen de fluorescencia sucesivamente. Para imágenes con una señal de fondo desigual, utilizar el algoritmo de "sustracción de fondo encontrado en el menú 'Proceso'. Utilice la configuración predeterminada (radio de rodadura de la bola de 50 píxeles), que es generalmente suficiente para los propósitos de cuantificación.
    NOTA: Una alternativa background método de sustracción de imágenes con fondo uniforme se describe en el paso 5.3.1.-5.3.2; Sin embargo, el método anterior también funciona para el fondo uniforme.
    1. Para imágenes con fondo uniforme (es decir, la intensidad de fondo es aproximadamente constante en todos los bordes y en el centro de la imagen), realizar una sustracción de fondo manual. Haga clic en el botón 'selecciones a mano alzada' que se encuentra en la ventana principal de ImageJ y seleccione 3-5 regiones aleatorias dentro de la imagen que no contienen células.
    2. Abrir la función de 'set' Las mediciones se encuentra en el menú "Analizar", seleccione el parámetro 'valor de gris promedio', y medir los valores de intensidad utilizando la función "Medir" (también se encuentra en el menú "Analizar"). Calcular el valor medio de las regiones 3-5 medidos, y resta de todas las mediciones posteriores en esa imagen.
  4. Para la cuantificación de ensayos cinéticos (protocolo 3), generar una sola imagen, apilados para el timserie e. Abra las imágenes de fluorescencia de cada punto de tiempo en orden cronológico, y generar una pila utilizando las Imágenes 'para el apilado "función (que se encuentra en el menú" Imagen ", bajo el submenú Pilas).
  5. Esquema de una célula usando la herramienta de selección a mano alzada, asegurándose de incluir toda la célula, sino como pequeña zona exterior de la célula como sea posible.
  6. Medir los siguientes parámetros: 'superficie, densidad integrado "y" valor de gris promedio'. Elija los parámetros usando la función 'set' Las mediciones, que se encuentra en el menú "Analizar".
    NOTA: Integrado densidad corresponde a la suma de todas las intensidades de los píxeles dentro de la región seleccionada, y la media de valor de gris corresponde a [Integrated Densidad / Area], que corrige los valores de intensidad para el tamaño celular.
  7. Abra el "Administrador de retorno de la inversión", ubicado en el menú "Analizar", bajo sub-menú 'Herramientas'. En la ventana Administrador de ROI, haga clic en el botón "Añadir" para entrar en el regio resaltadan como una nueva región de interés (ROI).
  8. Repetir los pasos 5.4 a través de 5.6 para las células restantes en la imagen. Excluir las células muertas según la evaluación de campo claro / DIC y fluorescencia (células muertas aparecen más oscuras en las imágenes DIC, y tienen señal citoplasmática autofluorescent cuando se ve con GFP excitación / emisión; véase la Figura 2F), y cualquier célula que tocan el borde de la imagen. Guardar las regiones de interés seleccionadas como un archivo .zip haciendo clic en el botón "Más" en la ventana "Administrador de retorno de la inversión", y exportar todas las mediciones a una hoja de cálculo o software de análisis estadístico.
  9. Para la cuantificación de ensayos cinéticos (protocolo 3), delinear y medir una célula desde el punto de tiempo inicial como se describe en los pasos 5.4 y 5.5. Utilice el mismo retorno de la inversión para la medición de todos los puntos de tiempo posteriores en el experimento.
  10. Para los ensayos de punto final (protocolos 2 y 4), medida de un mínimo de 30-50 células para cada condición. Realizar la cuantificación de al menos 2-3 imágenes, e incluyen todas las células en cadaimagen que cumplen con los criterios señalados en el paso 5.8 en el análisis.
  11. Evaluar la significación estadística entre las muestras usando ANOVA de una vía, seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey para el análisis post hoc.

6. Análisis de la Población Mup1-pHluorin endocitosis por Citometría de Flujo

  1. Inocular 2-3 colonias de células de levadura (aproximadamente 2 mm de diámetro por colonia) en 0,5 ml de medio YNB que carecen de aminoácidos adicionales o nutrientes para el mantenimiento de la selección del plásmido y metionina. Se cultivan las células en tubos de 5 ml de fondo redondo de 16 a 24 horas a 30 ° C en un tambor de rodillo.
  2. Añadir 1,5 ml de medio YNB que carecen de ácidos metionina y aminoácidos adicionales o nutrientes para el mantenimiento del plásmido, y crecer a 30 ° C durante 3 horas adicionales en un tambor de rodillos.
  3. Transferir 1 ml de células en cada uno de dos tubos de 5 ml de fondo redondo. Añadir 0,25 ml de medio YNB -Met al primer tubo (condición Met), y 0,25 ml de medio YNB que contiene 100 g/ Ml de metionina en el segundo tubo para dar una concentración de metionina final de 20 mg / ml (condición + Met). Se incuban las células a 30 ° C durante 45 min en un tambor de rodillo.
  4. Analizar las células por citometría de flujo, la selección de dispersión frontal (FS) como una medida del tamaño de la celda, y la intensidad de fluorescencia Mup1-pHluorin de un filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) como una medida de la interiorización de carga.
  5. Utilice los botones deslizantes para ajustar la tensión de los FS y canales de FITC para optimizar la detección de la intensidad rango de tamaño y fluorescencia de las células de levadura que se utiliza (para estos experimentos, los ajustes utilizados fueron 50 V para FS y 400 V para FITC).
    NOTA: Tensión para ambos canales variará dependiendo del citómetro de flujo que se utiliza. Este paso se debe hacer antes o durante el tratamiento de 45 min con metionina (paso 6.3).
  6. Medir la intensidad de fluorescencia FS y por 10.000 células de cada condición, mediante el ajuste de alta velocidad de flujo. Generar un gráfico de dispersión de FS contra fluocencia intensidad: haga clic en "añadir gráfica ', seleccione FITC (eje x) y FS (eje y), y el gráfico 1.000 puntos (el software mostrará los valores de 1.000 células, a pesar de que se midieron 10.000 células).
    NOTA: Para mantener la coherencia máxima, analizar las células de 45-50 minutos después de la adición de metionina; para los experimentos que involucran grandes cantidades de muestras, escalonar la adición de metionina para acomodar el tiempo requerido para la citometría de flujo análisis.
  7. Incluir condiciones Met + y se reunió por células de tipo salvaje (WT) como control. Uso de la función de puerta, asignar una puerta vertical usando la condición WT + Met, tal que aproximadamente el 5% de las células más brillantes caer a la derecha de la puerta. Utilice esta gating para todas las otras condiciones en el experimento.

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Resultados

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La localización de estado estacionario y la cuantificación de la carga de proteínas endocítica constitutivamente internalizado Ste3

Para demostrar que cargamentos de etiquetado pHluorin pueden ser utilizados para la cuantificación de la endocitosis en las células vivas, la localización de GFP quimérico y fusiones pHluorin con la cola citoplásmica C-terminal de Ste3, el receptor de feromonas un factor en la lev...

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Discusión

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Aplicaciones de la pHluorin para la cuantificación de eventos endocítica en células de levadura hace uso de cargas transmembrana en el que la etiqueta fluorescente está fusionada a la cola citoplasmática de la proteína (Figura 1A). Para los ensayos descritos aquí, son cargas con fluorescencia brillante cuando la etiqueta pHluorin se expone a ambientes neutros, pero se convierten en extinguió cuando la etiqueta se encuentra con pHluorin condiciones ácidas. Por lo tanto, un cargamento endocítica-etiquetad...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

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Nos gustaría agradecer a Gero Miesenböck y Tim Ryan por compartir el ADNc de pHluorin utilizado para generar reactivos en este estudio, a Nathan Wright, Joanna Poprawski y Lydia Nyasae por su excelente asistencia técnica, a los miembros del laboratorio de Wendland por sus útiles discusiones, y a Michael McCaffery y Erin Pryce en el Centro Integrado de Imágenes (Johns Hopkins) por su asesoramiento y asistencia con la microscopía y la citometría de flujo. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (a B.W., GM60979) y la Fundación Nacional de Ciencias (a B.W., MCB 1024818). K.W. fue apoyado en parte por una beca de capacitación de los Institutos Nacionales de Salud (T32-GM007231). A.F.O. contó con el apoyo de fondos de desarrollo del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Duquesne y la beca CAREER de la Fundación Nacional de Ciencias 553143.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AdeninaSigmaA8626-25GUso para la preparación de mezclas de aminoácidos y solución madre
Bacto-agarFisherBP1423-2Uso para la preparación de medios de placa
BD Difco Levadura Base de nitrógeno (sin aminoácidos)BD291920Uso para la preparación de medios líquidos y de placa
Concanavalin ASigmaC5275-5MGUso para el recubrimiento de la cámara portaobjetos
DextrosaFisherBP350-1Uso para la preparación de medios líquidos y en placa
L-HistidinaFisherBP382-100Uso para la preparación de mezclas de aminoácidos y solución madre
L-LeucinaAcros 125121000Uso para la preparación de mezclas de aminoácidos y solución madre
L-LisinaFisherBP386-100Uso para la preparación de mezcla de aminoácidos y solución madre
L-MetioninaFisherBP388-100Uso para la preparación de mezcla de aminoácidos y solución madre
L-TriptófanoFisherBP395-100Uso para la preparación de mezcla de aminoácidos y solución madre
L-TirosinaAcros140641000Uso para la preparación de mezclas de aminoácidos
Nunc Lab-Tek Cubreobjetos con cámara ( 8 pocillos)Thermo Scientific155411Uso para ensayos cinéticos y de punto final de la internalización de Mup1-pHluorin
UracilSigma U0750-100GUso para la preparación de mezclas de aminoácidos y solución madre
Microscopio invertido Axiovert 200Carl ZeissCustom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion LensCarl ZeissObjective debe ser 100X, 1.4NA o superior
La cámara SensicamCooke Corporationdebe tener un rango dinámico de 12 bits o superior
X-Cite 120PC Q Fuente de iluminaciónSoftware Excelitas Technologies
Slidebook 5Intelligent Imaging Innovations
Nacionales de Saludhttp://imagej.nih.gov/ij/
Software ImageJ Institutos

Referencias

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