Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

Resumen

La cuantificación precisa de los eventos de tráfico vesicular a menudo proporciona información clave sobre las funciones de proteínas específicas y los efectos de las mutaciones. En este artículo se presentan métodos para utilizar la pHluorina supereclíptica, una variante de GFP sensible al pH, como herramienta para la cuantificación de eventos endocíticos en células vivas mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa y citometría de flujo.

Resumen

proteína fluorescente verde (GFP) y sus variantes son ampliamente utilizados para el estudio de las herramientas de localización de la proteína y la dinámica de los acontecimientos tales como la remodelación del citoesqueleto y el tráfico vesicular en las células vivas. utilizando metodologías cuantitativas GFP fusiones quiméricas se han desarrollado para muchas aplicaciones; Sin embargo, la GFP es algo resistente a la proteolisis, por tanto, su fluorescencia persiste en el lisosoma / vacuola, lo cual puede dificultar la cuantificación del tráfico de carga en la vía endocítica. Un método alternativo para la cuantificación de los eventos de tráfico de endocitosis y post-endocítica hace uso de superecliptic pHluorin, una variante sensible al pH de GFP que se apaga en ambientes ácidos. fusión quimérica de pHluorin a la cola citoplasmática de carga transmembrana proteínas resulta en una amortiguación de la fluorescencia tras la incorporación de la carga en los cuerpos multivesiculares (MVBs) y la entrega a la luz del lisosoma / vacuola. Por lo tanto, extinción de la fluorescencia vacuolar facilita cuantificación de endocitosis y primeros eventos en la vía endocítica. Este documento describe los métodos que utilizan cargas de etiquetado pHluorin para la cuantificación de la endocitosis por medio de microscopía de fluorescencia, así como ensayos basados ​​en la población usando citometría de flujo.

Introducción

el tráfico vesicular juega un papel importante en el mantenimiento de la identidad y la función orgánulo en células eucariotas, y es un mecanismo clave para la regulación de proteínas y de la membrana composición de compartimientos celulares individuales. En la membrana de plasma, fusión de vesículas exocytic ofrece nuevas proteínas y las membranas de la superficie de la célula, mientras que las vesículas generadas a través de endocitosis eliminar membrana y proteínas de la superficie para el reciclaje o la orientación al lisosoma posterior. Por lo tanto, la endocitosis es importante para la absorción de nutrientes y para respuestas al entorno extracelular. Exocitosi....

Protocolo

1. Soluciones y Medios de Comunicación

1. Preparar los Stocks De acuerdo con los medios de comunicación, y las placas:
   1. Para preparar 10x YNB, se disuelven 67 g de base nitrogenada de levadura carece de los aminoácidos en 1 L de agua. Esterilizar por filtración a través de un filtro de 0,22 micras de nitrocelulosa.
   2. Preparar medio YNB usando 1x YNB (de 10x) con 2% de dextrosa (de una estéril 50% w / v de valores) y la mezcla de 1x amino ácido / nutriente (de 100x de valores, véase la etapa 1.1.4). Para la selección de plásmido, omitir aminoácidos individuales o nutrientes según sea necesario. Para la inducción de la expresión Mup1, adicionalm....

Resultados

La localización de estado estacionario y la cuantificación de la carga de proteínas endocítica constitutivamente internalizado Ste3

Para demostrar que cargamentos de etiquetado pHluorin pueden ser utilizados para la cuantificación de la endocitosis en las células vivas, la localización de GFP quimérico y fusiones pHluorin con la cola citoplásmica C-terminal de Ste3, el receptor de feromonas un factor en la lev.......

Discusión

Aplicaciones de la pHluorin para la cuantificación de eventos endocítica en células de levadura hace uso de cargas transmembrana en el que la etiqueta fluorescente está fusionada a la cola citoplasmática de la proteína (Figura 1A). Para los ensayos descritos aquí, son cargas con fluorescencia brillante cuando la etiqueta pHluorin se expone a ambientes neutros, pero se convierten en extinguió cuando la etiqueta se encuentra con pHluorin condiciones ácidas. Por lo tanto, un cargamento endocítica-etiquetad.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Adenina	Sigma	A8626-25G	Uso para la preparación de mezclas de aminoácidos y solución madre
Bacto-agar	Fisher	BP1423-2	Uso para la preparación de medios de placa
BD Difco Levadura Base de nitrógeno (sin aminoácidos)	BD	291920	Uso para la preparación de medios líquidos y de placa
Concanavalin A	Sigma	C5275-5MG	Uso para el recubrimiento de la cámara portaobjetos
Dextrosa	Fisher	BP350-1	Uso para la preparación de medios líquidos y en placa
L-Histidina	Fisher	BP382-100	Uso para la preparación de mezclas de aminoácidos y solución madre
L-Leucina	Acros 125121000		Uso para la preparación de mezclas de aminoácidos y solución madre
L-Lisina	Fisher	BP386-100	Uso para la preparación de mezcla de aminoácidos y solución madre
L-Metionina	Fisher	BP388-100	Uso para la preparación de mezcla de aminoácidos y solución madre
L-Triptófano	Fisher	BP395-100	Uso para la preparación de mezcla de aminoácidos y solución madre
L-Tirosina	Acros	140641000	Uso para la preparación de mezclas de aminoácidos
Nunc Lab-Tek Cubreobjetos con cámara ( 8 pocillos)	Thermo Scientific	155411	Uso para ensayos cinéticos y de punto final de la internalización de Mup1-pHluorin
Uracil		Sigma U0750-100G	Uso para la preparación de mezclas de aminoácidos y solución madre
Microscopio invertido Axiovert 200	Carl Zeiss	Custom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Lens	Carl Zeiss		Objective debe ser 100X, 1.4NA o superior
La cámara Sensicam	Cooke Corporation		debe tener un rango dinámico de 12 bits o superior
X-Cite 120PC Q Fuente de iluminación	Software Excelitas Technologies
Slidebook 5	Intelligent Imaging Innovations
	Nacionales de Salud		http://imagej.nih.gov/ij/