Artículo de método

Un sensor basado en polianilina de ácidos nucleicos

DOI:

10.3791/54590

⸱

1 de noviembre de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern Mississippi

En este artículo

Resumen

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Los ácidos nucleicos son analitos comunes para evaluar sistemas biológicos; sin embargo, el sesgo de la manipulación enzimática puede causar preocupación. Aquí se describe un método para la detección sin marcadores de ácidos nucleicos utilizando polianilina. Esta tecnología de sensores sensible y rentable puede distinguir las diferencias de un solo nucleótido entre moléculas.

Resumen

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La detección de ácidos nucleicos está en el centro de las tecnologías de diagnóstico utilizadas en la investigación y la clínica. Los enfoques estándar utilizados en estas tecnologías se basan en la modificación enzimática que puede introducir sesgos y artefactos. Un elemento crítico de las plataformas de detección de próxima generación será la detección molecular directa, evitando así la necesidad de amplificación o etiquetas. Los nanomateriales avanzados pueden proporcionar las modalidades químicas adecuadas para realizar sensores sin etiquetas. Los polímeros conjugados son ideales para la detección biológica, poseen propiedades compatibles con las biomoléculas y exhiben una alta sensibilidad a los cambios ambientales localizados. En este artículo se presenta un método para la detección de ácidos nucleicos utilizando el polímero electroconductor polianilina. Los oligonucleótidos "sonda" de ADN simples complementarios a los ácidos nucleicos objetivo se unen electrostáticamente al polímero, creando un sistema de sensores que puede diferenciar las diferencias de un solo nucleótido en las moléculas objetivo. Fuera de la naturaleza específica e imparcial de esta tecnología, es altamente rentable.

Introducción

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Los polímeros conjugados ofrecen muchas opciones para los sensores moleculares. Esto incluye respuestas de fluorescencia, electrónicas y colorimétricas1. Ha habido muchos esfuerzos para incorporar polímeros conjugados en sensores de ácido nucleico. Sin embargo, la mayoría de los sistemas requieren detección secundaria, lo que limitalas opciones de detección. Recientemente, reportamos una plataforma de sensores basada en polímeros conjugados construidos en polianilina (PANI) que explota las propiedades de este polímero, creando un sistema libre de etiquetas3. El PANI es un polímero electroactivo ampliamente conjugado con propiedades como la fluorescencia y la resistencia que son adecuadas para medir sistemas biológicos4. Los excitones dentro de la estructura no están localizados, lo que lleva a la movilidad de la carga positiva entre subunidades monoméricas. Esto proporciona un andamiaje flexible de cargas positivas que pueden interactuar con la columna vertebral cargada negativamente del ADN5,6. Es importante destacar que el ADN unido electrostáticamente está orientado de tal manera que las bases nitrogenadas pueden participar en el emparejamiento de bases. La asociación con el ADN altera las propiedades electrónicas de PANI, un efecto que puede ser potenciado por la irradiación UV (Figura 1)3. Con este sistema, los oligonucleótidos complementarios a los ácidos nucleicos diana pueden inmovilizarse en PANI. Múltiples estudios han demostrado que, tras la hibridación, los oligonucleótidos adsorbidos electrostáticamente se disocian de PANI u otras matrices catiónicas debido a cambios conformacionales causados por el cambio a una estructura de ADN bicatenario3,5,7.

En un sistema de sensores donde la fijación de la sonda modula las propiedades del polímero conjugado, los eventos de hibridación se pueden transducir sin etiquetas ni modificación enzimática de las sondas o ácidos nucleicos objetivo. Los polímeros conjugados ofrecen una gran flexibilidad en los métodos de detección, uno de los cuales es la fluorescencia. A través del monitoreo de la fluorescencia de PANI, se pueden detectar concentraciones de ácidos nucleicos objetivo tan bajas como 10-11 M (10 pM)3. La detección es rápida, se produce a los 15 minutos de la hibridación y es específica cuando se puede diferenciar un solo desajuste en una molécula objetivo3.

La fabricación de sensores PANI es sencilla. Se puede generar PANI de alto peso molecular que se dispersa bien en agua utilizando procedimientos de síntesis estándar que involucran monómero de anilina, surfactante y adición controlada de un oxidante. El rendimiento puede ser muy alto y el oxidante no reaccionado se elimina mediante el lavado con agua, lo que garantiza que no haya más crecimiento de Pani. La asociación PANI-sonda se produce espontáneamente tras la mezcla, y la formación de complejos se ve reforzada por una exposición leve a los rayos UV. La hibridación se puede llevar a cabo de inmediato, y los cambios en la fluorescencia de PANI se pueden analizar después de una incubación corta. La simplicidad de esta tecnología la hace muy accesible para muchos laboratorios.

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Protocolo

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1. Síntesis procesable PANI

  1. Disolver anilina (1 ml, 11 mmol) completamente en 60 ml de cloroformo en un matraz de 250 ml de fondo redondo. Se agita a 600 rpm durante 5 min y se enfría a 0-5 ° C con hielo. Esto suele tardar 15-20 minutos (Figura 2A).
  2. Añadir sodio dodecil benceno sulfonato (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) a la solución de anilina en un matraz de fondo redondo mientras se agitaba a 600 rpm.
  3. Disolver persulfato de amonio (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) en 20 ml de agua y añadir todos de la misma gota a gota durante 30 minutos para evitar el sobrecalentamiento de la reacción.
  4. Llevar a cabo la reacción a 0-5 ° C durante 24 horas, y permita que alcance la temperatura ambiente durante otras 24 horas.
  5. Observar la mezcla de reacción encender inicialmente de color blanco lechoso después de 15 minutos, a continuación, de color marrón oscuro después de 2 horas, y finalmente a verde oscuro después de 24 horas (Figura 2B-F).
  6. Filtrar la solución PANI-NaDBS con un embudo Buchner. Mezclar con 80 ml de cloroformo y 120 ml de agua en taneparation embudo (Figura 2G).
  7. Incubar la solución durante 24 horas a temperatura ambiente y recoger el PANI verde oscuro desde el embudo de separación, dejando NaDBS sin reaccionar y APS en el sobrenadante acuoso.

2. Mezcla PANI-sonda y la irradiación UV

  1. Diluir solución PANI 10x con cloroformo-agua (1: 3 v / v) y mezclar 200 l de PANI diluye con 6,4 mol de oligonucleótidos de ADN de la sonda por agitación suave durante 15 min en un tubo de microcentrífuga.
  2. Irradiar la solución PANI-ADN con 1200 mu J / cm 2 de UV en un agente de reticulación para 2 min. Es crítico que la exposición UV se limita a la cantidad indicada. La exposición prolongada a los rayos UV compromete el cambio de fluorescencia en el PANI, probablemente debido a la reticulación covalente del PANI y el ADN.
  3. complejos de pellets por centrifugación a 17.000 xg durante 6 minutos, y se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se precipitan de nuevo y volver a suspender en PBS.

3. Hybridization del PANI-sonda

  1. Añadir 8 l de 100 mM oligonucleótidos de ADN complementario o ácidos nucleicos diana de 200 l de complejos PANI-sonda.
  2. Realizar la hibridación por balanceo mezcla en solución durante 15 minutos a 40 DO.
  3. Se precipitan los complejos PANI por centrifugación a 17.000 xg durante 6 minutos. Lavar con PBS y resuspender en agua.

4. Emisión Steady Estado Medición de fluorescencia

  1. Añadir PANI de diferentes tratamientos en una microplaca de 96 pocillos y medir la fluorescencia de emisión en el rango de 270 a 850 nm mediante excitación a 250 nm. Un pico de emisión para el PANI se debe observar alrededor de 500 nm.

5. microscopía de fluorescencia Medición de Hibridada Duplex

  1. Caída de PANI abrigo en un cubreobjetos de vidrio de borosilicato y se seca a 40 ° C durante 48 horas.
  2. Añadir la sonda (8 l de 100 mM) en una película de PANI seca e irradiar con luz UV (1.200 mu J / cm2 ) durante 2 min.
  3. Se lava la película de PANI-sonda con PBS y se seca a 40 ° C durante 48 horas.
  4. Realizar la hibridación durante 15 min mediante la adición de ácidos nucleicos diana. Esto podría ser una muestra biológica o un oligonucleótido objetivo de control (8 l de 100 mM). Siga con un lavado PBS.
  5. Obtener las imágenes fluorescentes en un aumento de 40X, con un filtro de paso largo 500 nm.

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Resultados

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Figura 2A captura la configuración de la reacción en el comienzo del proceso de polimerización, es decir, antes de la adición de APS. La formación de micelas es el paso inicial en la reacción se produce la síntesis de proceso de PANI en la interfase micelar. La Figura 2B muestra una solución lechosa después de 5 min. 30 min después de APS se añade la reacción se convierte en un color ligeramente marrón. Figura 2C muestra el camb...

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Discusión

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Un sensor basado en PANI de los ácidos nucleicos requiere la solubilización del polímero en agua con el fin de interactuar con el ADN y el ARN. La dispersión de la PANI en el agua se logra usando agentes tensioactivos, que forman micelas como se informó anteriormente 8. Además de los NaDBS utilizados aquí otros tensioactivos aniónicos, tales como éster de dodecilo de ácido 4-sulfoftálico, tensioactivos no iónicos como los etoxilatos de nonilfenol, o tensioactivos catiónicos tales como bromuro de cetiltrimetil...

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Divulgaciones

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El trabajo fue apoyado por la Facultad de Ciencia y Tecnología de la Universidad del Sur de Mississippi y la Facultad de Ciencia y Tecnología de Mississippi y el programa Mississippi INBRE (Premio Número P204M103476 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales).

Agradecimientos

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Los autores no tienen nada que revelar.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anilina Fisher Scientific A7401-500 ACS, líquido, refrigerado
Peroxidisulfato de amonioFisher Scientific A682-500 ACS, cristalino
Sultonato de dodecilbenceno sódicoPfaltz & Bauer D56340 95% sólido
CloroformoFisher Scientific MCX 10601 líquido
cebadores de ADNMWG operónn/asecuencia de ADN personalizada ~20 
Microplaca bps Científico de EE. UU. 1402-9800 96 pozo, el polipropileno, ya que no reacciona al cloroformo
Película adhesiva de microplacaEE. UU. Scientific 2920-0000 Reduce la contaminación de pozo a pozo, el derrame de muestras y la evaporación
Cubierta de vidrio para microscopioFisher Scientific 12-544-D Recubrimiento PANI sobre cubreobjetos irradiado UV
Reticulante UV UVP HL-2000 Energía: x100 μ J/cm2; Tiempo: 2 min
Horno de hibridaciónVWR01014705 TTemperatura: 400  ° C; con balanceo durante 15 min
Aparato de vidrio Matrazfondo redondo de tres cuellos de Fisher Scientific para reacción; embudo de caída, tapones, condensador, embudo de separación
Leica IMC S80Aumento 20X; Pseudo color 536 nm; Exposición: 86 mseg; Ganancia 1.0x; Lector de microplacas Gamma 1.6
Dispositivos moleculares 89429-536
de Microscopio Leica Microsystems 

Referencias

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