En este trabajo, se prepararon andamios de poli(ácido láctico)/polietilenglicol (PLA/PEG) mediante el uso de una combinación de mezcla de fusión y lixiviación selectiva. El método aquí discutido permitió desarrollar andamios de tres capas mediante un alto control tanto de la porosidad como del tamaño de los poros. También se evaluaron las propiedades mecánicas en un ambiente fisiológico.
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Artículo de método
Un Facile y respetuoso del medio ambiente de ruta para la fabricación de poli (ácido láctico) Los andamios con graduado Tamaño de poro
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Resumen
Resumen
En los últimos años, los andamios funcionalmente graduados (FGS) han adquirido un papel crucial en la fabricación de dispositivos para la ingeniería de tejidos. La importancia de este nuevo campo de investigación en biomateriales se debe a la necesidad de desarrollar implantes capaces de imitar la compleja funcionalidad de los distintos tejidos, incluyendo un cambio continuo de una estructura o composición a otra. En este último contexto, un tema de gran interés se refiere al diseño de andamios apropiados para el tejido de la interfaz hueso-cartílago. En este estudio, los andamios de tres capas con tamaño de poro graduado se lograron mezclando poli(ácido láctico) (PLA), cloruro de sodio (NaCl) y polietilenglicol (PEG). Las distribuciones del tamaño de los poros se controlaron mediante granulometría de NaCl y solvatación con PEG. Los andamios se caracterizaron desde el punto de vista morfológico y mecánico. Se encontró una correlación entre el método de preparación, la arquitectura de poros y el comportamiento mecánico de compresión. La fuerza de adhesión de la interfaz se evaluó cuantitativamente mediante el uso de una prueba de fuerza interfacial diseñada a medida. Además, con el fin de imitar la fisiología humana, también se realizaron pruebas mecánicas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 °C. El método aquí presentado proporciona un alto control de la porosidad, la distribución del tamaño de los poros y el rendimiento mecánico, ofreciendo así la posibilidad de fabricar andamios de tres capas con propiedades a medida siguiendo una ruta sencilla y ecológica.
Introducción
El interés por los polímeros biodegradables ha crecido en importancia durante los últimos años tanto en el mundo académico como en la industria, debido a la creciente preocupación por los residuos plásticos y la reducción del uso de fuentes no renovables1-7. En particular, los polímeros sintéticos biocompatibles y biodegradables están muy extendidos en varios campos de aplicación biomédica, como la liberación controlada de fármacos8,9, los hilos de sutura absorbibles8,10, la intensificación de bioprocesos11 y la ingeniería de tejidos12.
La ingeniería de tejidos se centra en el desarrollo de dispositivos capaces de restaurar y mantener la función normal en tejidos enfermos o lesionados. La mayoría de los tejidos nativos están compuestos por diferentes tipos de células y matrices extracelulares (MEC) en jerarquías espaciales específicas. Por ejemplo, el cartílago articular (CA) consta de diferentes zonas con diferentes tipos y orientaciones de fibras de colágeno y proteínas de unión al colágeno. Además, el cartílago y el hueso muestran estructuras jerárquicas significativamente diferentes. En este contexto, la preparación de andamios multicapa con propiedades de ingeniería en cada capa podría permitir reemplazar tejidos heterogéneos teniendo en cuenta todos los microambientes locales de estos sistemas complejos13,14.
Basándose en las características celulares/biológicas y/o físico-químicas de los andamios, las principales estrategias adoptadas por la ingeniería de tejidos pueden dividirse en monofásicas, bifásicas y trifásicas. Los enfoques bifásicos y trifásicos (BTA) utilizan dos o tres arquitecturas de poros, materiales o rellenos diferentes para preparar dispositivos funcionales de múltiples capas. Además, se puede utilizar un solo material para lograr dispositivos bifásicos o trifásicos, siempre que sea posible crear un gradiente en sus propiedades físicas12.
La migración celular juega un papel clave en la morfogénesis, la inflamación, la cicatrización de heridas y la metástasis tumoral. El movimiento de las células se ve favorecido por la presencia de un gradiente de propiedades químico-físicas desde la superficie hasta el núcleo del dispositivo. Por lo tanto, los biomateriales que cumplen con los requisitos mencionados anteriormente pueden ser útiles para estudiar la migración celular. Además de los gradientes químicos que desencadenan la migración celular (quimiotaxis), las propiedades mecánicas del sustrato de cultivo celular también pueden conducir al movimiento celular (mecanotaxis)15.
La estructura multicapa también puede proporcionar la liberación sintonizable de fármacos específicos incorporados dentro de la matriz polimérica, cambiando el área específica de la capa o la cantidad de fármacos cargados.
Durante la última década, con el fin de desarrollar andamios que posean un gradiente discreto o continuo de propiedades morfológicas, como la porosidad o el tamaño de los poros, se han presentado varios enfoques16-31. Los trabajos más recientes se centraron en la preparación de BTA mediante la adopción: lixiviación de partículas 12,28,32, técnica de formación de espuma con gas 16, electrohilado17-19, técnica de fundición capa por capa20, prototipado rápido21,22, separación de fases inducida térmicamente (TIPS)22, liofilización por centrifugación24,25, superficies mínimas triplemente periódicas (TPMS)26, fundición por congelación27-30.
En el marco de este trabajo, presentamos una ruta rápida y sencilla para lograr andamios porosos de tres capas (TLS) basados en PLA, mediante la combinación de mezcla de fusión, moldeo por compresión y lixiviación de sal. A diferencia de la mayoría de las tecnologías comúnmente utilizadas para la producción de andamios, la estrategia aquí adoptada puede considerarse totalmente ecológica, ya que no requiere ningún solvente tóxico potencialmente peligroso para el medio ambiente y para las células y tejidos vivos32. Las relaciones básicas de procesamiento-estructura-propiedad establecidas en este estudio mediante el análisis de las características morfológicas y el comportamiento mecánico de los dispositivos fabricados proporcionan orientación para futuros avances en el diseño de andamios graduados multifuncionales con propiedades objetivo específicas.
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Protocolo
1. La fabricación de andamios
- Moler NaCl en un mezclador de laboratorio durante 20 min y se seca en una estufa a 100 ° C.
- Poner el NaCl se secó (45 g en el momento) en una máquina de tamizado durante 30 minutos a la frecuencia más alta disponible sin que se produzca en resonancia. Recoger seis fracciones de sal, que van desde 500 micras a 1000 micras (M 500); desde 300 micras a 500 micras (M 300); desde 100 micras a 200 micras (M 100); de 90 micras a 100 (M 90); de 45 micras a 65 micras (M 45) y, finalmente, M 10 con partículas de sal tamaño menor que 45 micras como se esquematiza en la Figura 1.
- Vacuum seque durante la noche todos los materiales a fin de evitar la escisión hidrolítica durante el procesamiento. Para cada material, seleccionar la temperatura a fin de maximizar el grado de secado sin superar - en el caso de los polímeros - la transición vítrea. Por lo tanto, elegir T = 90 ° C para PLA y T = 25 ° C para PEG, T = 105 ° C para el NaCl.
- AlimentarPLA, PEG y NaCl, con una composición de porcentaje en peso de 20/5/75 respectivamente, a una mezcladora por lotes de operación a T = 190 ° C y n = 60 rpm y luego los proceso hasta alcanzar un valor constante de par, por lo general después de unos 10 minutos. A partir de entonces, recoger rápidamente el material resultante.
- Preparar las mono-capas mediante el uso de una prensa de laboratorio que funciona a 210 ° C, poner las mezclas en moldes cilíndricos adecuados con un diámetro de 10 mm y una altura de 3 mm y mantenerlos durante 60 segundos a presión ambiental y 3 minutos a 180 bar . Después de ello, enfriar las mezclas a temperatura ambiente, manteniendo la presión de 180 bar.
- Montaje de tres capas mediante moldeo por compresión
- Preparar cada capa individual de la misma manera que el descrito en (1.5), pero usando diferentes moldes, es decir, que tiene un diámetro de 10 mm y una altura de 1 mm. Finalmente, obtener 6 discos con un diámetro de 10 mm y una altura de 1 mm, que contiene seis tamaños de partículas diferentes: M 500, M 300, M 100,
- for montaje de tres capas andamio A (TLS A), se acumulan M 500, M 300 y M 100 en el interior del molde cilíndrico y les compresión molde en una prensa de laboratorio que funciona a 210 ° C durante 60 segundos a presión ambiental y 3 minutos a 180 bar y después se enfrió a temperatura ambiente, manteniendo la presión de 180 bar.
NOTA: Preparar el TSL B por el apilamiento en uno a M 90, M 45 y M 10 en los mismos moldes y llevar a cabo la operación de compresión de moldeo siguiendo el mismo procedimiento que el utilizado para TLS A.
- Retire los discos de los moldes cilíndricos y los puso en un baño de agua hirviendo desmineralizada, sin agitación. 3 horas después, eliminar las estructuras porosas resultantes de la bañera y dejar secar durante 12 horas a temperatura ambiente en una campana química.
2. Análisis morfológico
- Evaluar las morfologías de los andamios por microscopía electrónica de barrido.
- Romper las muestras en nitrógeno líquido y luego coloque elmuestras sobre un trozo de aluminio utilizando una cinta adhesiva del carbón. Por último, por pulverización catódica con oro coate durante 90 s bajo una atmósfera de argón antes de formación de imágenes con el fin de evitar la descarga electrostática durante la prueba.
3. Andamios Tamaño de poro
- Elaborar las imágenes obtenidas por análisis de SEM con un software de procesamiento de imágenes capaz de reconocer la distribución del tamaño de poros del andamio.
NOTA: En este trabajo el análisis de la distribución de tamaño de poro se llevó a cabo usando un software basado en MATLAB se ha descrito previamente 33
4. La porosidad
- Pesar las muestras antes de la lixiviación y evaluar la porosidad teórica de acuerdo con la siguiente expresión:
NOTA: M NaCl, m PEG y PLA m, son, respectivamente, la masa teórica de NaCl, PEG y PLA, asumiendo mezclas homogéneas. Tque las densidades (ρ) de NaCl, PEG y PLA son, respectivamente, 2,16 g / cm 3, 1,12 g / cm 3 e 1,24 g / cm 3. - Pesar las muestras después de la lixiviación y el secado con el fin de evaluar la densidad aparente de las muestras (ρ andamio), y luego evaluar la porosidad real como el recíproco de la relación entre la densidad aparente del andamio y la densidad de no porosa PLA por utilizando la expresión (2).
NOTA: Se expresa la relación entre el volumen vacío del andamio y el volumen total del andamio (vacío + completa).
5. Propiedades mecánicas
- Prueba de las muestras en el modo de compresión usando una máquina de tracción, equipado con una célula de carga 1 kN. Establecer una velocidad de deformación constante de 1 mm min -1.
- Con el fin de investigar el comportamiento mecánico de las muestras en medio fisiológico, equipar el dynamometer con un baño que contiene (PBS), (pH = 7,4) a 37 ° C y efectuar la prueba con la misma configuración que la descrita en el punto 5.1.
- Antes de cada medición en ambiente húmedo, remojar las muestras con PBS en un matraz de vacío durante 5 min con el fin de dejar PBS rellenar todos los poros. A partir de entonces, permiten que los andamios se mantengan en PBS a 37 ° C durante 15 minutos para alcanzar la temperatura de consigna.
- Determinar la fuerza de adhesión interfacial (IAS) entre las capas de TL TL A y B mediante el uso de un equipo de ensayo de resistencia interfacial de diseño personalizado, conectado a una máquina de ensayo mecánico siguiendo un método descrito en la literatura 32,34.
- Fijar el andamio en la plataforma y asegurar su correcta alineación con la célula de carga y la base de la platina de la máquina. Fije las muestras de andamios a los trozos de aluminio de prueba mediante el uso de un adhesivo de alta viscosidad y colocarlos en el equipo para la prueba.
- Para la condición de prueba en húmedo, hidratar las muestras en PBS durante 1 hr prio de la prueba. Utilice una célula de carga 1 kN, bajo una carga de tracción aplicada a una velocidad de deformación de 1 mm min -1.
NOTA: Tener en cuenta que el no puede ocurrir ya sea en la resistencia final a la tracción de una de las capas o debido a la deslaminación en las interfases. Evaluar la NIC como la fuerza máxima de la curva tensión-deformación.
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Resultados
La influencia del tamaño de las partículas de NaCl en la arquitectura de los poros de los armazones se evaluó cualitativamente y cuantitativamente mediante la investigación de la morfología de las muestras y el cálculo de la distribución del tamaño de poro mediante análisis de imagen, respectivamente Figura 2A -. F muestra micrografías SEM de andamios mono-capas resultantes de sal de lixiviación de materiales que contienen diferentes tamaños de partícula...
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Discusión
El primer paso crítico es la optimización de la eficiencia de tamizado. El alto control del tamaño de las partículas de NaCl es fundamental para la preparación de andamio con la distribución de tamaño de poro deseado. Otro paso crítico es evitar la fractura de las delgadas monocapas de PLA durante la extracción de la muestra del molde. El análisis de procesamiento de imágenes puede no ser representativa de todo el dispositivo.
Durante los ensayos de tracción, la muestra puede separarse de lo...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado financieramente por INSTM.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Poli(ácido láctico) | NatureWorks | PLA 2002D Poli | |
| (etilenglicol) | Sigma | 83797-1KG-F | |
| Cloruro de sodio | Sigma | 793566-5KG-D | |
| Solución tampón de fosfato | Sigma | P5368-10PAK | |
| Mezclador de laboratorio | Brabender | PLE 330 - Plasticorder | |
| Prensa de laboratorio | Carver | ||
| Phenom-world | ProX | ||
| Máquina de pruebas universal | Instron | 3365 (Reino Unido) | |
| BioPuls Bath | Instron, | ||
| Endecotts | E.V.F.1. | ||
| horno de vacío | ISCO | NSV9035 | |
| balanza de precisión | Sartorius | AX224 |
Referencias
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