Artículo de método

Caracterización fenotípica de los macrófagos a partir de riñón de rata por Citometría de Flujo

DOI:

10.3791/54599

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18 de octubre de 2016

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1Renal, Vascular and Diabetes Research Lab, IIS-Fundaciòn Jiménez Dìaz, Autonoma University, 2Department of Physiology, Faculty of Medicine, Complutense University, 3Department of Immunology, Centro Nacional de Microbiologìa, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

En este artículo

Resumen

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Este manuscrito describe un protocolo detallado para fenotípica y análisis cuantitativo de los macrófagos residentes de riñones de rata por citometría de flujo. Las células teñidas resultantes también se pueden utilizar para otras aplicaciones, incluyendo la clasificación de células, el análisis de la expresión génica o estudios funcionales, aumentando así la información obtenida en el modelo experimental.

Resumen

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Cada vez hay más pruebas que sugieren el importante papel de la inflamación y, posteriormente, de los macrófagos en el desarrollo y la progresión de la enfermedad renal. Los macrófagos son células heterogéneas que han sido implicadas en la lesión renal. Los macrófagos se pueden clasificar en dos fenotipos diferentes: macrófagos activados clásicamente (macrófagos M1), que liberan citocinas proinflamatorias y promueven la fibrosis; y macrófagos activados alternativamente (macrófagos M2) que se asocian con funciones inmunorreguladoras y de remodelación de tejidos. Estos fenotipos de macrófagos deben ser discriminados y analizados para determinar su contribución a la lesión renal. Sin embargo, hay escasos estudios que reportan información fenotípica y funcional consistente sobre los subtipos de macrófagos en modelos de enfermedad renal inflamatoria, especialmente en ratas. Este hecho puede estar relacionado con los limitados marcadores de macrófagos utilizados en ratas, a diferencia de los ratones. Por lo tanto, son necesarias estrategias novedosas para cuantificar y caracterizar el contenido renal de estas células infiltrantes de forma fiable. Este manuscrito detalla un protocolo para la digestión renal y un análisis fenotípico y cuantitativo adicional de macrófagos de riñones de rata mediante citometría de flujo. Brevemente, los riñones se incubaron con colagenasa y se identificaron los macrófagos totales de acuerdo con la doble presencia de CD45 (antígeno común de los leucocitos) y CD68 (marcador de macrófagos PAN) en células vivas. A esto le siguió la tinción superficial de CD86 (marcador M1) y CD163 (marcador M2). Se utilizaron macrófagos peritoneales de rata como control positivo para la detección de marcadores de macrófagos por citometría de flujo. Nuestro protocolo resultó en una baja mortalidad celular y permitió la caracterización de diferentes marcadores intracelulares y de proteínas de superficie, limitando así la pérdida de integridad celular observada en otros protocolos. Además, este procedimiento permite el uso de macrófagos para otras técnicas, como la clasificación celular y los estudios de expresión de ARNm o proteínas, entre otros.

Introducción

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La enfermedad renal es un problema de salud global, con mayor prevalencia, y asociado a una elevada morbimortalidad1. Uno de los mecanismos más importantes implicados en la progresión y desarrollo de la lesión renal es la inflamación, desencadenada principalmente por los macrófagos. Los macrófagos desempeñan un papel fundamental en muchas enfermedades inflamatorias, incluidos los trastornos renales2. Así, se ha descrito una presencia elevada de macrófagos infiltrantes en biopsias de pacientes con lesión renal aguda (IRA) o enfermedad renal crónica (ERC)3,4. Estudios recientes sugieren que el resultado a largo plazo de la enfermedad ren....

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Protocolo

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Este protocolo fue aprobado por las autoridades locales Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comités siguiendo la Directiva 2010/63 / UE del Parlamento Europeo y la Directriz Nacional 53/2013.

1. Preparación de Reactivos y Soluciones

  1. Preparar todos los reactivos y soluciones en condiciones estériles y utilizar bajo una campana de flujo laminar. Mantener las soluciones a 4 ° C.
  2. Preparar tampón de tinción (2% de suero bovino fetal (FBS) en PBS de Dulbecco 1x).
  3. Preparar la solución de colagenasa mediante la adición de 0,5 mg de colagenasa a cada ml de solución salina.
  4. Preparar la solución de anestesia de ketamina....

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Resultados

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Se analizó la heterogeneidad de los macrófagos en un modelo experimental de lesión inflamatoria renal asociada a la mayor presencia de la infiltración de macrófagos en el riñón. En este modelo, el daño renal fue inducida por la administración de la aldosterona (1 mg kg -1 -1 día) más de sal (NaCl 1%) en agua de bebida durante 3 semanas en ratas Wistar, como se informó anteriormente 12.

El horar.......

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Discusión

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Los macrófagos son células heterogéneas que juegan un papel importante en diferentes enfermedades inflamatorias, incluyendo trastornos renales. Hay un creciente interés en la caracterización de los macrófagos subconjuntos en la enfermedad renal, ya que cada subpoblación de macrófagos contribuye de una manera diferente a la evolución de la lesión renal, como se informa en la glomerulonefritis, la nefropatía diabética y cáncer renal 14-16. En las primeras etapas de la lesión renal aguda, se observa un predomini.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo ha sido financiado por subvenciones de FIS/FEDER (Programa Miguel Servet: CP10/00479, PI13/00802 y PI14/00883), Sociedad Española de Aterosclerosis, Sociedad Española de Nefrología y Fundación Renal Iñigo Álvarez de Toledo (FRIAT) a Juan Antonio Moreno. Los fondos FIS/FEDER PI14/00386 y el Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrològica a Jesús Egido. Fundaciòn Conchita Rábago a Melania Guerrero Hue. Fundación Renal Iñigo Álvarez de Toledo (FRIAT) a Alfonso Rubio Navarro.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Campana de flujo laminarMás rápidoO equipo equivalente
CentrífugaHettichO equipo equivalente
Citómetro de flujo (FACSAria)BD Biosciences
Suero fetal bovinoBioWestS1820-500
PBS 10xLONZABE17-515Q Colagenasa
Sigma-Aldrich1/12/9001
ACK Tampón de lisadoThermo Fisher ScientificA10492-01
Filtros de citometría de flujoBD Biosciences340626
Falcon filtros celularesThermo Fisher Scientific352340
Tubos de citometría de flujoFalcon3520525 ml Poliestireno Tubo de fondo redondo
Tubos de centrífuga Corning centristar430791
baño de aguaMemmert GmbH + Co. KGWNE 737 ° C
Solución de fijación/permeabilización o tampón de permeabilización/lavadoBD Biosciences554714
Rompum (xilacina)Bayero equivalente
Ketalar (ketamina)Pfizero equivalente
Solución salina equilibrada de HanksSigma-AldrichH8264-500ML
Braun
Anti-CD45 (clon: OX-1) APC-Cy7Biolegend202216Diluido 1:100
Anti-CD68 (clon: ED1) FITCBio-RADMCA341FDiluido 35:1.000
anti-CD86 (clon: 24F) PEBiolegend200307Diluido 35:1.000
anti-CD163 (clon: ED2) Alexa Fluor 647Bio-RADMCA342RDiluido 4:100
Mancha viva/muerta Sondas molecularesL34955diluidas 3:1.000
622415

Referencias

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  1. Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
  2. Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages.<....

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Reimpresiones y permisos

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Etiquetas

Fenotipado de macr fagosdigesti n renaltinci n de CD45 y CD68marcadores CD86 y CD163macr fagos renales de rataclasificaci n M1 y M2tinci n de superficie celularcontrol de macr fagos peritonealesan lisis de la inflamaci n renal

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