Artículo de método

Caracterización fenotípica de los macrófagos a partir de riñón de rata por Citometría de Flujo

DOI:

10.3791/54599

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18 de octubre de 2016

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1Renal, Vascular and Diabetes Research Lab, IIS-Fundaciòn Jiménez Dìaz, Autonoma University, 2Department of Physiology, Faculty of Medicine, Complutense University, 3Department of Immunology, Centro Nacional de Microbiologìa, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

En este artículo

Resumen

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Este manuscrito describe un protocolo detallado para fenotípica y análisis cuantitativo de los macrófagos residentes de riñones de rata por citometría de flujo. Las células teñidas resultantes también se pueden utilizar para otras aplicaciones, incluyendo la clasificación de células, el análisis de la expresión génica o estudios funcionales, aumentando así la información obtenida en el modelo experimental.

Resumen

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Cada vez hay más pruebas que sugieren el importante papel de la inflamación y, posteriormente, de los macrófagos en el desarrollo y la progresión de la enfermedad renal. Los macrófagos son células heterogéneas que han sido implicadas en la lesión renal. Los macrófagos se pueden clasificar en dos fenotipos diferentes: macrófagos activados clásicamente (macrófagos M1), que liberan citocinas proinflamatorias y promueven la fibrosis; y macrófagos activados alternativamente (macrófagos M2) que se asocian con funciones inmunorreguladoras y de remodelación de tejidos. Estos fenotipos de macrófagos deben ser discriminados y analizados para determinar su contribución a la lesión renal. Sin embargo, hay escasos estudios que reportan información fenotípica y funcional consistente sobre los subtipos de macrófagos en modelos de enfermedad renal inflamatoria, especialmente en ratas. Este hecho puede estar relacionado con los limitados marcadores de macrófagos utilizados en ratas, a diferencia de los ratones. Por lo tanto, son necesarias estrategias novedosas para cuantificar y caracterizar el contenido renal de estas células infiltrantes de forma fiable. Este manuscrito detalla un protocolo para la digestión renal y un análisis fenotípico y cuantitativo adicional de macrófagos de riñones de rata mediante citometría de flujo. Brevemente, los riñones se incubaron con colagenasa y se identificaron los macrófagos totales de acuerdo con la doble presencia de CD45 (antígeno común de los leucocitos) y CD68 (marcador de macrófagos PAN) en células vivas. A esto le siguió la tinción superficial de CD86 (marcador M1) y CD163 (marcador M2). Se utilizaron macrófagos peritoneales de rata como control positivo para la detección de marcadores de macrófagos por citometría de flujo. Nuestro protocolo resultó en una baja mortalidad celular y permitió la caracterización de diferentes marcadores intracelulares y de proteínas de superficie, limitando así la pérdida de integridad celular observada en otros protocolos. Además, este procedimiento permite el uso de macrófagos para otras técnicas, como la clasificación celular y los estudios de expresión de ARNm o proteínas, entre otros.

Introducción

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La enfermedad renal es un problema de salud global, con mayor prevalencia, y asociado a una elevada morbimortalidad1. Uno de los mecanismos más importantes implicados en la progresión y desarrollo de la lesión renal es la inflamación, desencadenada principalmente por los macrófagos. Los macrófagos desempeñan un papel fundamental en muchas enfermedades inflamatorias, incluidos los trastornos renales2. Así, se ha descrito una presencia elevada de macrófagos infiltrantes en biopsias de pacientes con lesión renal aguda (IRA) o enfermedad renal crónica (ERC)3,4. Estudios recientes sugieren que el resultado a largo plazo de la enfermedad renal podría ser controlado por los macrófagos5,6. En respuesta al microambiente local, los macrófagos pueden diferenciarse en diferentes fenotipos que desempeñan diversas funciones biológicas7. Se han establecido dos fenotipos de macrófagos bien diferenciados: los macrófagos activados clásicamente (macrófagos M1) y los macrófagos activados alternativamente (M2)8. Los macrófagos M1 promueven la inflamación, mientras que los macrófagos M2 tienen un papel antiinflamatorio y están involucrados en la reparación de tejidos9. Por lo tanto, es necesario un mejor conocimiento de la heterogeneidad de los macrófagos para comprender su regulación y contribución a la patología renal y desarrollar nuevos enfoques terapéuticos.

Tanto los modelos murinos como los de ratas han sido ampliamente utilizados para comprender el mecanismo molecular y celular implicado en la lesión renal10. Sin embargo, existen diferencias sustanciales en los diversos marcadores utilizados para identificar los fenotipos de macrófagos entre estos roedores. Por lo tanto, varios marcadores murinos, como F4/80 o Ly6C, no se utilizan en ratas, lo que limita la extrapolación de los hallazgos entre estas especies. Además, existe un número limitado de marcadores que describen los fenotipos de macrófagos en ratas, lo que explica los escasos estudios que analizan la heterogeneidad de los macrófagos en estos animales en comparación con los ratones. Por lo tanto, se necesitan nuevas estrategias para la caracterización de subconjuntos de macrófagos para comprender el papel de los macrófagos en modelos de enfermedad renal en ratas.

Este manuscrito describe un protocolo para el análisis fenotípico y cuantitativo de macrófagos de riñones de rata mediante citometría de flujo. Esta técnica puede ser seguida por varios ensayos, incluyendo la clasificación de células y estudios de expresión de ARNm o proteínas para permitir una caracterización en profundidad del papel de los macrófagos en la enfermedad renal.

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Protocolo

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Este protocolo fue aprobado por las autoridades locales Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comités siguiendo la Directiva 2010/63 / UE del Parlamento Europeo y la Directriz Nacional 53/2013.

1. Preparación de Reactivos y Soluciones

  1. Preparar todos los reactivos y soluciones en condiciones estériles y utilizar bajo una campana de flujo laminar. Mantener las soluciones a 4 ° C.
  2. Preparar tampón de tinción (2% de suero bovino fetal (FBS) en PBS de Dulbecco 1x).
  3. Preparar la solución de colagenasa mediante la adición de 0,5 mg de colagenasa a cada ml de solución salina.
  4. Preparar la solución de anestesia de ketamina / xilazina (2: 1 v / v).

2. riñón de perfusión y Extracción

  1. Anestesiar las ratas por inyección intraperitoneal de ketamina / xilazina (75 mg / 12 mg / kg peso). pellizcar con cuidado un pequeño pliegue de la piel, para comprobar si el animal está suficientemente anestesiado. A continuación, cubrir los ojos con ungüento veterinario para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Nota: 4-month-ratas Wistar se utilizan en este ensayo.
  2. Una vez que la rata está totalmente anestesiado, colocarlo sobre una mesa de operaciones en posición supina.
  3. Aplicar 70% de etanol en el abdomen.
  4. Haga una incisión central a través de la piel abdominal y el peritoneo, desde el pubis hasta la caja torácica, para exponer las cavidades pleurales y abdominales.
  5. Inyectar solución salina (0,9%) en la aorta abdominal para perfundir los riñones utilizando un sistema de perfusión hasta que se elimina toda la sangre de los riñones. Cortar la aorta a nivel abdominal para ayudar a liberar la sangre.
  6. Retire ambos riñones de las ratas mediante la reducción del hilio renal (vena renal, arteria y uréter). Para decapsulate el riñón, presione el borde del riñón usando los dedos, separando con cuidado la cápsula 11.
  7. Coloque el riñón en la solución salina equilibrada de Hanks.

La digestión 3. Riñón y suspensión celular

  1. Cortar la mitad de un riñón con tijeras en trozos pequeños y poner elpedazos en un tubo de 1,5 ml.
    Nota: Todas las siguientes concentraciones se calculan para la muestra 1 (1/2 de riñón de rata).
  2. Añadir 1 ml de la solución de colagenasa y se incuba a 37 ° C durante 30 min. Mezclar por inversión cada 5 min para asegurarse de que la solución de colagenasa accede a todo el tejido.
  3. Recoger la solución y pasarla a través de un colador (40 micras) con la ayuda de un émbolo, y volver a suspender en 10 ml de tampón de tinción.
  4. Centrifugar a 400 xg durante 15 min.
  5. Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml ACK (amonio-cloruro y potasio) buffer de lisis. Después de 1 minuto 30 segundos a temperatura ambiente, se añaden 10 ml de tampón de tinción para detener la reacción.
  6. Centrifugar a 400 xg durante 10 min.
  7. Vuelva a suspender el sedimento en un volumen adecuado de tampón (1 ml) y la tinción y filtrar la suspensión celular utilizando un colador (30 micras).
  8. Contar el número de células por medio de exclusión de azul de tripano en un hemocitómetro y añadir 2 millones de células a un tubo de 1,5 ml para stanando.

4. Análisis de tinción celular y citometría de flujo

  1. centrifugar las células a 100 xg durante 5 min.
  2. Vuelva a suspender el precipitado en 100 l de suero de rata (diluido 1: 100) durante 10 min a 4 ° C para bloquear los receptores Fc.
  3. Lavar mediante la adición de 1 ml de tampón de tinción y centrifugar 100 xg durante 5 min.
  4. Mezclar los anticuerpos para la tinción de la superficie celular en 100 l de tampón de tinción para cada condición: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) y una solución para detectar células vivas (3: 1000).
  5. Vuelva a suspender el sedimento celular en la mezcla de anticuerpos durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
  6. Lavar mediante la adición de 1 ml de tampón de tinción y se centrifuga a 100 xg durante 5 min. Repita este paso.
  7. Añadir 600 l de solución / permeabilización de fijación durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
  8. Lavar 2 veces con 1 ml de tampón de permeabilización / lavado y centrifugar a 170 xg durante 5 min.
  9. Añadir el anticuerpo CD68 FITC (35: 1000) para la Intracellular tinción de 100 l de tampón de permeabilización / lavado para cada condición.
  10. Vuelva a suspender el sedimento en la solución de anticuerpos CD68-e incubar 50 min a 4 ° C en la oscuridad.
  11. Lavar con 1 ml de tampón de permeabilización / lavado y centrifugar a 170 xg durante 5 min.
  12. Vuelva a suspender el precipitado en 100 l de tampón de permeabilización / lavado, añadir anticuerpos CD86PE (35: 1000) y se incuba durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
  13. Lavar mediante la adición de 1 ml de permeabilización / tampón de lavado y centrifugar a 100 g durante 5 min.
  14. Vuelva a suspender el precipitado en 100 l de tampón de permeabilización / Lavar y pasarlo a un tubo de citometría de flujo.
  15. Analizar las muestras por citometría de flujo. Determinar la tinción de CD45 en células vivas cerrados a la luz la luz dispersada lateral / dispersa hacia adelante (/ FSC, SSC) ventana. En un segundo paso, analizar CD86 y la expresión de CD163 en células CD68 +.

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Resultados

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Se analizó la heterogeneidad de los macrófagos en un modelo experimental de lesión inflamatoria renal asociada a la mayor presencia de la infiltración de macrófagos en el riñón. En este modelo, el daño renal fue inducida por la administración de la aldosterona (1 mg kg -1 -1 día) más de sal (NaCl 1%) en agua de bebida durante 3 semanas en ratas Wistar, como se informó anteriormente 12.

El horar...

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Discusión

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Los macrófagos son células heterogéneas que juegan un papel importante en diferentes enfermedades inflamatorias, incluyendo trastornos renales. Hay un creciente interés en la caracterización de los macrófagos subconjuntos en la enfermedad renal, ya que cada subpoblación de macrófagos contribuye de una manera diferente a la evolución de la lesión renal, como se informa en la glomerulonefritis, la nefropatía diabética y cáncer renal 14-16. En las primeras etapas de la lesión renal aguda, se observa un predomini...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo ha sido financiado por subvenciones de FIS/FEDER (Programa Miguel Servet: CP10/00479, PI13/00802 y PI14/00883), Sociedad Española de Aterosclerosis, Sociedad Española de Nefrología y Fundación Renal Iñigo Álvarez de Toledo (FRIAT) a Juan Antonio Moreno. Los fondos FIS/FEDER PI14/00386 y el Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrològica a Jesús Egido. Fundaciòn Conchita Rábago a Melania Guerrero Hue. Fundación Renal Iñigo Álvarez de Toledo (FRIAT) a Alfonso Rubio Navarro.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Campana de flujo laminarMás rápidoO equipo equivalente
CentrífugaHettichO equipo equivalente
Citómetro de flujo (FACSAria)BD Biosciences
Suero fetal bovinoBioWestS1820-500
PBS 10xLONZABE17-515Q Colagenasa
Sigma-Aldrich1/12/9001
ACK Tampón de lisadoThermo Fisher ScientificA10492-01
Filtros de citometría de flujoBD Biosciences340626
Falcon filtros celularesThermo Fisher Scientific352340
Tubos de citometría de flujoFalcon3520525 ml Poliestireno Tubo de fondo redondo
Tubos de centrífuga Corning centristar430791
baño de aguaMemmert GmbH + Co. KGWNE 737 ° C
Solución de fijación/permeabilización o tampón de permeabilización/lavadoBD Biosciences554714
Rompum (xilacina)Bayero equivalente
Ketalar (ketamina)Pfizero equivalente
Solución salina equilibrada de HanksSigma-AldrichH8264-500ML
Braun
Anti-CD45 (clon: OX-1) APC-Cy7Biolegend202216Diluido 1:100
Anti-CD68 (clon: ED1) FITCBio-RADMCA341FDiluido 35:1.000
anti-CD86 (clon: 24F) PEBiolegend200307Diluido 35:1.000
anti-CD163 (clon: ED2) Alexa Fluor 647Bio-RADMCA342RDiluido 4:100
Mancha viva/muerta Sondas molecularesL34955diluidas 3:1.000
622415

Referencias

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  1. Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
  2. Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
  3. Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
  4. Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
  5. Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
  6. Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
  7. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  8. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
  11. Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
  12. Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946(2016).
  13. Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
  14. Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
  15. Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
  16. Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
  17. Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
  18. Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).

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