Subcelulares patch-clamp grabaciones desde el dominio somatodendrítica de la sustancia nigra dopamina Neuronas

Resumen

Los registros subcelulares de patch-clamp ofrecen la posibilidad de investigar las propiedades funcionales de las dendritas. Sin embargo, estas finas estructuras no son fácilmente accesibles debido a su pequeño diámetro. El protocolo aquí descrito tiene como objetivo facilitar la recopilación de registros estables y fiables de las dendritas de las neuronas dopaminérgicas en cortes in vitro.

Resumen

Dendritas de las neuronas dopaminérgicas reciben y transmiten la entrada sináptica, el apoyo potencial de acción de propagación hacia atrás y la liberación de neurotransmisores. La comprensión de estas funciones fundamentales arrojará luz sobre la transferencia de información en estas neuronas. patch-clamp grabaciones dendríticas ofrecen la posibilidad de examinar directamente las propiedades eléctricas de las dendritas y los canales iónicos dependientes de voltaje subyacentes. Sin embargo, estas estructuras finas no son de fácil acceso para las pipetas de parche debido a su pequeño diámetro. Este informe describe un procedimiento paso a paso para recoger grabaciones estables y fiables a partir de las dendritas de las neuronas dopaminérgicas en rodajas agudas. Las medidas electrofisiológicas se combinan con la recuperación post hoc de la morfología celular. experimentos exitosos se basan en la mejora de la preparación de las rebanadas, soluciones y pipetas, el ajuste adecuado de la óptica y la estabilidad de la pipeta en contacto con la estructura grabada. principios estándar de somgrabación de patch-clamp ATIC se aplican a las dendritas pero con un enfoque más suave de la pipeta. Estas técnicas versátiles pueden ser implementadas para abordar diversas cuestiones relativas a las propiedades de las dendritas excitables.

Introducción

Las neuronas reciben información sináptica predominantemente en sus dendritas. Excitatorios e inhibitorios señales sinápticas extendido de su sitio de generación en el sitio de integración, donde los potenciales de acción (AP) son evocados como la señal de salida. En su camino, los potenciales sinápticos están influenciados tanto por la estructura de las dendritas y la interacción entre propiedades de la membrana pasivos y activos. La combinación de estos parámetros muy variables ensancha la potencia de cálculo de las neuronas ^1,2. Sin embargo, el pequeño diámetro de las dendritas impide sin embargo el estudio de sus propiedades eléctricas. El continuo desarrollo de la técnica de patch-clamp ^3, la óptica ⁴ y el perfeccionamiento de los métodos para la preparación rebanada ⁵ durante las últimas décadas han permitido a las grabaciones de muy delgada (0,7 - 3 m Ø) ^6,7 dendritas. Estos métodos eran, y son, en gran medida todavía utilizan para examinar la excitabilidad de las dendritas en una variedad of ⁸ neuronas. Grabaciones directas dendríticas son esenciales para determinar la distribución ^9-19 y las diferencias en las propiedades funcionales de los canales iónicos ^20-22 en compartimentos neuronales distintas. Estos datos son el complemento necesario de la distribución de los canales iónicos detectada por inmunohistoquímica, combinado a la luz y microscopía electrónica ^23,24. Grabaciones somatodendríticos duales se han implementado para explorar la propagación de los potenciales de acción ^{9,13-15,21,22,25-27} y propagación de los potenciales sinápticos ^13,16,18 a lo largo del dominio somatodentrítica de las neuronas, la obtención de modelos detallados de cable pasivas ^{28- 30} e investigar la resolución temporal de la integración neuronal ^31.

La sustancia negra (SN) es una región situada en el cerebro medio implicado en diversas funciones tales como el control de movimiento, la codificación de la recompensa y comportamientos habituales. La disminución de la dopamina debido a la específicala pérdida de neuronas dopaminérgicas (DA) en el SN está asociado con los trastornos motores observados en los pacientes que sufren de la enfermedad ³² de Parkinson. El circuito nigral se compone de dos tipos de células principales: dopaminérgicas y GABAérgicas neuronas. Curiosamente, estas neuronas tienen varias características que las distinguen de otras neuronas. El axón de una gran proporción de las neuronas DA y algunas neuronas GABA origina a partir de un sitio dendríticas que indica que el árbol dendrítico es heterogénea (axón-cojinete y dendritas axón-carente) ^25,26,33. La morfología de estas neuronas, por lo tanto contrasta con la organización típica de las neuronas en el que la transferencia de información sigue la ley de la polarización dinámica emitida por Cajal: a partir de las dendritas, al soma y finalmente a ³⁴ axón. También se conocen las neuronas DA a la liberación de dopamina a partir de sus dendritas ^35, generar actividad de ruptura ³⁶ y la plasticidad ³⁷ NMDA-receptor. la disecciónción de estos fenómenos es difícil de alcanzar sin grabaciones directas desde el lugar en que se iniciaron. Para hacerse una idea de la relación entre la ubicación exacta y las propiedades funcionales de los canales iónicos y su papel en la excitabilidad y la información de la transferencia dendríticas en las neuronas de la sustancia negra, grabaciones dendríticas directos son el método de elección.

Este informe describe un procedimiento detallado que se puede utilizar para obtener grabaciones de uno y dos patch-clamp de dendritas de las neuronas de la sustancia negra y el etiquetado de post hoc biocitina correspondiente. Los principios básicos para parchear el somática y la membrana dendríticas son muy similares. sin embargo la práctica, las grabaciones de sitios dendríticas requieren optimización específica en comparación con las grabaciones somáticas. grabaciones dendríticas exitosas dependen de la calidad de las rodajas, de ajuste óptimo de la óptica, de aproximación suave de la pipeta de parche y la estabilidad de las grabaciones.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales descritos aquí siguen las directrices institucionales y nacionales, Directivas de la UE para la Protección de los Animales y las Directrices de la Federación de Asociaciones de Ciencia Animal de Laboratorio Europeo.

1. Preparación de las soluciones

1. Líquido cefalorraquídeo artificial estándar (ACSF; Tabla 1)
   1. Utilizar sales de alta pureza ³⁸ y vasos de precipitados de vidrio limpio previamente enjuagado con agua bidestilada para preparar una solución fresca. El uso de alta calidad de agua bidestilada para la preparación de todas las soluciones extra e intracelulares.
   2. Tomar un vaso de 2 L para disolver NaHCO ₃ en 500 ml de agua y otro para disolver las otras sales con el fin de evitar la precipitación de iones divalentes ³⁹ de acuerdo con la Tabla 1. Limpiar la espátula sistemáticamente con agua bidestilada y se seca antes de tomar una sal . Utilice un agitador magnético para homogeneizar dissolutionorte. Añadir las soluciones de ambos vasos de precipitados a un matraz aforado adecuada y llevar al volumen apropiado.
   3. Asegúrese de que la solución extracelular final es totalmente transparente y sin ningún rastro de precipitación.
   4. Aplicar una mezcla de gases compuesta de 95% de O ₂ y 5% de CO ₂ (gas carbógeno) con una vela microfiltro de vidrio (Ø 13 mm) 20 - 30 min antes de la perfusión de las rodajas de ^38,40. controlar cuidadosamente la osmolaridad (2 - 3 mediciones consecutivas) de la ACSF con un osmómetro (rango óptimo: 314-325 mOsmol / L). Almacenar la solución restante después de la preparación a 4 ° C y usarla dentro de 3 días.
2. Solución de corte (sacarosa-ACSF; Tabla 2) ^5,13
   1. Preparar 3 L de solución fresca. Utilice 1 L para preparar las secciones de cerebro de un animal. Almacenar la solución restante a 4 ° C y usarla dentro de 3 días.
      NOTA: Alta Mg ²⁺ y bajas concentraciones ^{de Ca2 +} se utilizan para dla transmisión sináptica ecrease y la sustitución de algunos NaCl con sacarosa para preservar el tejido ^{de 5,40.}
3. soluciones intracelulares
   1. Prepárese por adelantado 100 ml de solución para las grabaciones de células enteras duales (Tabla 3).
   2. Incluir metilsulfato ^13,15,21 para obtener una buena recuperación de la morfología celular. Añadir biocitina (0,1 hasta 0,4%) para examinar posteriormente la morfología de la neurona. Incluir un colorante fluorescente (por ejemplo, Alexa 594 o sulforodamina 101 ⁴¹⁾ para seguir la extensión de dendritas durante la grabación (opcional).
   3. Preparar con antelación una solución de 100 ml de electrodos para las grabaciones adjunta células (Tabla 4). En este caso la solución interna es una solución de alto K ⁺ diseñado para aislar el macroscópico actual catiónico activado por hiperpolarización (I _h) y contiene los bloqueadores de los otros canales iónicos dependientes de voltaje.
   4. intra tiendasoluciones celulares en alícuotas de 2 ml a -20 ° C. Utilice una nueva alícuota para cada nueva sesión de grabación. Compruebe la osmolaridad de cada alícuota descongelados cuidadosamente con un osmómetro. Tome una nueva alícuota si la osmolaridad no se corresponde con el valor inicial.
   5. Transferir la solución de la alícuota en una jeringa de 3 ml en la parte superior de la cual se coloca un filtro de jeringa estéril de 0,22 micras. Mantener la jeringa en el hielo durante la sesión de grabación para limitar la degradación de sus compuestos (ATP, GTP o fosfocreatina).

2. La fabricación y el llenado de la pipeta Patch

1. Tracción
   1. Al usar un extractor de electrodos horizontales y tubos de vidrio de borosilicato de paredes gruesas. Para de células enteras y grabaciones unido a células, utilizar un / diámetro interno 2 mm de diámetro exterior 1 mm. Asegúrese de que el tubo de vidrio es absolutamente limpio ^38.
   2. Si este no es el caso, sumerja capilares de vidrio en un disolvente orgánico (por ejemplo, etanol) Primero y luego en agua bidestilada. Brevemente calentar terminaciones capilares con un mechero Bunsen. Alternativamente, los tubos de vidrio para lavó y se calienta directamente desde el fabricante (véase la lista de materiales).
   3. Para grabaciones somatodendríticos duales, asegúrese de que la resistencia de la pipeta somática es entre 6 y 10 mO ^6,11 y entre 8 y 19 mO para pipetas dendríticas cuando se llena con solución intracelular (Tabla 3). Estandarizar resistencia pipeta para las grabaciones adjunto célula a una resistencia de 10 mO de conseguir resultados comparables a lo largo del dominio somatodendrítica de la neurona ^16,18,42,43.
   4. Preparar pipetas frescas antes de cada sesión de grabación (cada día) o inmediatamente antes de parches y usarlos 5 - 8 horas después de su fabricación ^39. pipetas almacenar en un recipiente de vidrio cubierta para protegerlos del polvo y la obstrucción de la punta.
2. Pulido
   1. Inspeccionar y heat-pule cada punta de la pipeta con un microforge para obtener mejores sellos con la membrana. Antes de utilizar el microforge, fundir una pequeña pieza de vidrio en el filamento de calentamiento de platino. Reemplazar esta recubrimiento de vidrio en el filamento de platino al día durante la constancia (Peter Jonas, comunicación personal).
      NOTA: Las pipetas usadas para grabaciones adjunta células pueden recubrirse antes de la etapa de pulido de calor para reducir el ruido de fondo. Revestimiento se puede lograr con un agente aislante tal como cera dental fundido ^22,44 o un elastómero de silicona ^39.

3. Preparación de cortes de cerebro

1. Usar ratas Wistar sanas de edades comprendidas entre los 16 - 19 días de edad. No utilice animales enfermos o animales que sufren de hipotermia o deshidratación. Antes de comenzar la preparación de las rebanadas de mantener al animal en un lugar seguro y silencioso. Evitar tener cualquier otro animal en la sala mientras se prepara un animal. Manipular con cuidado los animales.
2. Verter sacarosa-ACSF en dos 400polipropileno ml vasos de precipitados (PP) y colocarlos en el congelador a -80ºC durante 45 min. Mezclar la solución para obtener una solución homogénea de hielo líquido frío / congelado y colocar los vasos en el hielo. Suministrar la solución de sacarosa-ACSF con el gas Carbógeno usando una vela microfiltro (Ø 13 mm) en cada vaso de precipitados PP.
3. Preparar la máquina de cortar y la cámara de reserva
   1. Utilice una máquina de cortar tejido de alta calidad con vibraciones verticales extremadamente bajos ^5,38 para minimizar el daño a las capas superficiales de rodajas tanto como sea posible. Fijar una hoja de afeitar fresca y entera en la máquina de cortar.
   2. Use una hoja de afeitar nueva para cada sesión de corte. Evitar la flexión de la cuchilla de afeitar. No retire la película grasa en la superficie de la hoja de afeitar (Josef Bischofberger, comunicación personal).
   3. Si está disponible, compruebe la vibración vertical con un vibroprobe proporcionado por el fabricante. También puede utilizar un vibroprobe medida ^5. Reducir las vibraciones verticales de la hoja so como para ser lo más cerca posible a 0 m.
   4. Preparar una cámara de reserva de 150 ml ^45,46 para las divisiones como se muestra en la pág. 201 en la Ref. ^39. Verter ACSF estándar en la cámara de reserva y lo coloca en un baño de agua. Suministrar la solución de cámara de reserva con Carbógeno usando una vela microfiltro (Ø 6 mm). Asegúrese de que las burbujas son CARBOGEN tan pequeño como sea posible.
      NOTA: Construir una nueva cámara de reserva de cada 2 - 3 meses para mantener constante la calidad de la rebanada.
4. las rebanadas cortadas
   1. En una habitación silenciosa en la que el experimentador no se perturba o estresado, decapitar al animal con tijeras de cirugía (longitud 150 mm) a nivel de la médula cervical.
   2. Cortar la piel en la parte superior de la cabeza del animal en la nariz de dirección caudal con un bisturí y sacarlo lateralmente. Cortar la parte superior del cráneo del caudal a la parte nasal de la cabeza con tijeras finas y eliminar las dos partes del cráneo lateralmente. Retire la blluvia con una espátula fina y colocar con cuidado en un vaso de precipitados que contiene PP enfriado con hielo (a 0 - 4 ° C) de sacarosa-ACSF equilibraron con ³⁸ Carbógeno.
      NOTA: Esta secuencia de pasos que hay que hacer lo más rápido posible, pero también meticulosamente (<< 1 min, aproximadamente 40 s).
   3. Mantener el cerebro en la solución del vaso de precipitados PP para ~ 2-5 min. Ajustar la presión de carbógeno para evitar movimientos del cerebro. Vuelva a colocar la vela microfiltro si las burbujas son demasiado grandes CARBOGEN por una nueva.
   4. Coloque el cerebro de un niño de 9 cm placa de Petri en el que la parte inferior en el interior está cubierto con una capa de unos 0,5 cm de espesor ~ ³⁸ Sylgard. Preparar este plato de Petri con antelación.
   5. Rodear el cerebro con helado de sacarosa-ACSF. Asegúrese de que alguna fase líquida de la solución de sacarosa ACSF-sumerge el cerebro. Para cortes coronales, corte la parte frontal del cerebro en el plano coronal con un bisturí o una hoja de afeitar. Retire el cerebelo con un corte coronal.
   6. aplicar cianopegamento de acrilato en la bandeja de muestras (área de ~ 1 cm ^2). Pegar el bloque de cerebro de tal manera que la parte frontal se enfrenta a la etapa de corte. Cuidadosamente gotear sacarosa-ACSF en la parte superior del cerebro pegado usando la abertura grande de una pipeta Pasteur de vidrio y posteriormente lentamente sumergir la cámara de corte de la máquina de cortar. Maniobra de la bandeja de muestra de modo que la superficie de corte (es decir, el primer tejido para golpear la cuchilla) es la superficie ventral del cerebro ^40.
   7. Aplicar Carbógeno con una vela microfiltro vidrio doblado (Ø 6 mm) a la cámara de corte (opcional).
   8. Ajuste la cuchilla de afeitar a un ángulo de ~ 15 ° con respecto al plano horizontal ^5. Cortar rodajas de cerebro coronales de ~ 500 micras en el caudal a la dirección nasal antes de llegar a la sustancia negra. Disminuir el espesor a cortar 300 - 350 micras rodajas gruesas que contienen la región de interés.
   9. rebanadas separadas del bloque de tejido con una aguja muy fina de perfusión unido auna jeringa paralela al borde de la cuchilla de afeitar. Doblar la aguja de manera que tenga un ángulo de 90 ° entre la aguja y la jeringa. Asegúrese de que no se aplica presión a la hoja de afeitar mientras que la eliminación de la rebanada del bloque de tejido.
5. rebanadas de tienda
   1. La transferencia de las rebanadas utilizando la mayor apertura de una pipeta Pasteur de vidrio (que se adjunta a una bombilla) en la cámara de reserva. Una vez que todas las rebanadas se transfieren a la cámara de reserva (Christoph Schmidt-Hieber, comunicación personal) llevar la temperatura del baño de agua a 34 ° C durante 0,5-1 h.
   2. Después de este período apagar el baño de agua y mantener las rodajas a temperatura ambiente. Ajustar la presión de carbógeno a fin de evitar movimientos de las rebanadas en la cámara de reserva. Mantener las rodajas durante otros 10 a 20 min antes de iniciar las grabaciones.
   3. Limpiar el equipo y las velas microfiltro cuidadosamente todavía a fondo con agua bidestilada en el extremo de la SLIcing procedimiento.

4. Dual somáticas y Somatodendric Grabaciones en la sustancia negra neuronas y presentación Biocitina

1. Siga las descripciones para el montaje de una instalación de patch-clamp para las divisiones dadas en la guía axonal y en las referencias. ^39,40,47. La información relativa a los aspectos más básicos de la aplicación de parches están en la Ref. ^48.
2. Preparar cámara de registro
   1. Coloque 1 - 2 ml de agua doblemente destilada en la cámara de grabación. Compruebe que no tiene fugas. Coloque la cámara de la grabación en la mesa XY desplazamiento.
   2. Alimentar ACSF estándar a través de un sistema de tubos de perfusión impermeable al oxígeno (politetrafluoroetileno) a la cámara de registro. Se estabiliza el flujo de perfusión en la cámara a una velocidad de 4-5 ml min ^-1. Mantenga la longitud de la tubería de unirse al vaso de precipitados que contiene ACSF y la cámara de grabación de lo más corto posible (1 m).
   3. Seleccione una sección de cerebro de la cámara de reserva y la transfiere enla cámara de grabación con la mayor apertura de una pipeta Pasteur de vidrio. Cubrir la rebanada con un anillo de platino para anclarlo en la parte inferior de la cámara de grabación tal como se representa en la p. 201 en la Ref. ^39. Use un anillo de platino plana (Ø 1,5 cm) y la cola de hilos de nylon paralelos (separación> 2 mm) sobre el mismo.
3. Ajustar y optimizar la óptica
   1. Visualizar las rebanadas utilizando microscopía de rayos infrarrojos (IR) de vídeo ^4,47,49,50. Ajustar la iluminación Köhler ⁵¹ y optimizar el contraste diferencial de interferencia (DIC) ⁵¹ óptica o de la iluminación oblicua (Dodt Gradiente contraste - DGC) ^52,53. Más detalles sobre este procedimiento se dan en las referencias. ^40,49.
   2. Comprobar la calidad de la rebanada. mantener sólo las rebanadas con superficies lisas e incluso los que no están demasiado fuertemente contrastados y tienen sólo pequeños cráteres, dispersos.
   3. Llenar 2 pipetas parche nuevo y sin uso con la solución intracelular ( Tabla 3). Use un tubo de 0,5 ml que contiene la solución de la pipeta para llenar la punta de la pipeta por la acción de capilaridad. Para acelerar el llenado punta de pipetas sin filamento, aplicar presión negativa al extremo de la pipeta utilizando tubería unida a una jeringa.
4. Posición de las pipetas por encima de la superficie de la rebanada
   1. Compruebe la presencia de cloruro de recubrimiento de los cables de plata (electrodo de referencia y el baño de electrodo de conexión; para más detalles, consulte la guía del axón y las referencias ^39,54.).
   2. Insertar la pipetas secuencialmente en los soportes de pipeta y aplicar presión positiva (~ 70 mbar) utilizando un circuito de tubería que conecta el soporte de pipeta, un grifo de tres vías y un manómetro ^40. Bajar la pipeta en el baño de la cámara de grabación.
   3. Compruebe que el valor de la presión en el manómetro es constante para ~ 1 - 2 min. Si la presión está disminuyendo, compruebe el tubo o las juntas tóricas de sellado en el interior del soporte de pipetas.
   4. Coloque la punta de la pipeta en el centro del monitor de vídeo y asegúrese de que no esté obstruido. Asegúrese de que la punta de la pipeta no se mueve al aplicar o liberar la presión de la pipeta.
   5. Compruebe la deriva y las vibraciones de la punta de pipeta dibujando una pequeña cruz en el centro de la pantalla exactamente en la posición de la punta de la pipeta y observar durante 5 min posibles movimientos de la punta.
   6. Aplicar un escalón de tensión (5 mV) para vigilar la resistencia de la pipeta en un osciloscopio. Establecer el potencial de mantenimiento del amplificador de patch-clamp a 0 mV. Cancelar pipeta potencial de compensación de tal manera que la corriente DC pipeta lee cero en el metro amplificador ^39,51.
   7. Mover las pipetas hasta la rebanada y mantenerlas por encima de la superficie.
5. Seleccionar y parchear una neurona con dendritas largas
   1. Dentro de la sustancia negra seleccionar una neurona sana con dendritas largas que se pueden seguir a una gran distancia de aproximadamente la misma plane (Figura 1A y 1B) utilizando IR-Dodt Gradient Contraste (IR-DGC). Elija un cuerpo celular lisa y homogénea. Evitar las dos células fuertemente contrastadas en la superficie de la rebanada (Figura 1C y 1D), ya que es difícil de romper y para preservar las condiciones de grabación estables en el tiempo (estable resistencia en serie). Seleccionar las neuronas que tienen su soma 10-30 micras por debajo de la superficie de la rebanada.
   2. Mueva el electrodo somática cerca del soma (40 - 50 micras de distancia) y el electrodo cerca dendríticas a la dendrita a la misma distancia. Utilice una magnificación 2X (cambiador de cuatro veces) para seleccionar y el parche una porción de una dendrita. Obtener en el monitor un aumento absoluto de 2,100X sin aumento (1X) y de 5,500X con un aumento 2X.
   3. Ligeramente liberar la presión de la pipeta somática por 10 mbar. Si es necesario, regular la presión pipeta dendríticas y somática para evitar el desplazamiento de la cestructura ell (soma y dendritas) dentro de la división.
   4. Coloque la pipeta dendríticas cerca de la membrana con el fin de ver una pequeña formación de hoyuelos. Liberar la presión en la punta de la pipeta y el parche la dendrita mientras se controla la resistencia de la pipeta. En condiciones ideales, sólo una muy ligera succión es suficiente para obtener un buen sellado.
   5. Mantenga la pipeta dendríticas en el modo unido a células. Mover la pipeta cerca somática a la membrana somática y el parche de la membrana somática. Asegúrese de que se obtiene una alta resistencia al sellado antes de la ruptura de la membrana celular (> 1 GΩ) ^39. Ligeramente retraer ambas pipetas lejos de la membrana por un par de micras para evitar la deformación del cuerpo de la célula y de las dendritas.
   6. Para ambos pipetas, reducir tanto como sea posible la amplitud de los transitorios de pipeta de capacitancia en la parte superior del paso actual usando un pulso de voltaje con alta ganancia y poco filtrado ⁵¹ y el osciloscopio. Entra en el modo Wi-célula enteraTH la pipeta dendríticas y, posteriormente, con la pipeta somática.
   7. Eliminar los transitorios de capacitancia de célula entera y compensar la resistencia en serie. Monitorear y documentar la resistencia de acceso al comienzo de, y periódicamente durante el experimento. Si la resistencia serie es demasiado alta (> 50 mO), vuelve a intentar con otra pipeta.
   8. Recoge imágenes IR-DGC (Figura 1A y 1B) con una impresora de gráficos de video ^25, un capturador de fotogramas o una cámara digital a ampliaciones de alta y baja.
      NOTA: La inflamación de las neuronas durante la grabación (Figura 1E y 1F) se observa de forma esporádica, pero rara vez cuando la osmolaridad y el pH de las soluciones se ajusta correctamente ^39.
   9. Realizar una grabación de doble somáticas de células enteras (soma - soma) con el mismo procedimiento (Figura 2A).
6. Aplicar largos (varios cientos de ms) crecientes despolarizante actuales pasos secuencialmentecon la pipeta somática y dendrítica para evocar los puntos de acceso (Figuras 2B, 3C y 3D). Registrar el potencial resultante en el dendríticas y la pipeta somática simultáneamente.
7. Examinar la propagación de los potenciales postsinápticos excitatorios artificiales (aEPSPs) en las neuronas dopaminérgicas
   1. Crear una forma de onda de excitación de corriente postsináptica (EPSC) para inyectar como un comando de corriente durante grabaciones de corriente-clamp duales (Figuras 4A y 4B). Para ello, construir una doble función exponencial con valores de amplitud y tiempo curso correspondientes a los valores reales medidos para EPSCs en la neurona de interés ^55. controlar cuidadosamente las frecuencias de muestreo de la EPSC construido y de la forma de onda EPSC inyectada para preservar el curso de tiempo original.
      Nota: Antes de la aplicación de la forma de onda en una neurona real, prueba usando una celda de modelo.
   2. Secuencialmente inyectar la forma de onda a través de la dendríticas ypipeta somática y registro resultante potenciales tanto para pipetas somáticas y dendríticas de forma concomitante. Compruebe con regularidad por si deriva de las pipetas.
8. Terminación de la grabación de una neurona
   1. Tome una imagen IR-DGC con una ampliación baja (objetivo: 5x o 10x) para documentar la posición de la neurona dentro de la rebanada y los electrodos.
   2. Lenta y suavemente retirar la dendríticas y las pipetas somáticos a partir de la secuencia de la membrana neuronal con el fin de formar el exterior hacia fuera con parches ambos pipetas. Retire la pipeta usando una secuencia de movimientos laterales hacia ^arriba-38. Estos deben ser cortas al principio y luego aumentar gradualmente de longitud. Esta configuración de grabación favorece el cierre correcto de la membrana celular.
   3. Monitorear la disminución de las corrientes capacitivas (aumento de la resistencia de acceso) en respuesta a un impulso de tensión 5 mV en el voltaje-clamp mientras se retira la pipeta.
   4. Una vez que la membrana es marconducido alrededor de la punta de la pipeta, tomarlo completamente fuera de la cámara de grabación. Retire el objetivo de la bañera. Mantenga la rebanada en la cámara de grabación durante 15 - 20 min en estándar ACSF para permitir el equilibrio de biocitina (de la solución intracelular) en la neurona registrada.
   5. transferir suavemente el sector mediante la abertura grande de una pipeta Pasteur en un 25 ml de boca ancha de color ámbar botella de cristal (marrón) que contiene ACSF estándar. Cierre la botella con un tapón. Véase el punto 6 de la etapa de fijación.

5. Los registros de células-adjunto

1. Seleccione una neurona con una dendrita que se extiende sobre una larga distancia en el mismo plano. Asegúrese de que la dendrita de interés puede ser seguido a una soma bien definido.
2. Llenar la pipeta de parche con una solución de electrodo (Tabla 4). Diseño de la solución para grabar la corriente de interés en la configuración de conexión de células mediante la inclusión de agentes farmacológicos específicos para bloquear otros cha de ionesnnels.
3. Parchear la dendrita en el modo conectado celular
   1. Visualizar una parte de la dendrita y el enfoque de la pipeta recodificación usando el manipulador. Adaptar la presión en la punta de la pipeta marcando el manómetro (70 - 80 mbar) para evitar el desplazamiento de la dendrita. Parche las dendritas como se describe en 4.5.4.
   2. Grabar las imágenes IR-DGC (Figura 5A). Trate de obtener una resistencia de sellado lo más grande posible (> 1 GΩ ^39), en el mejor de entre 3-10 GΩ para grabaciones adjunto de ^células-18 (Figura 5B). Retraer la pipeta fuera de la membrana por un par de micras para evitar la deformación de la dendrita.
   3. Observe corrientes de acción en el modo conectado por células que refleja los potenciales de acción espontáneos de las neuronas de la sustancia negra. Complementar la ACSF con Ca2 ⁺ y Na ⁺ bloqueadores de canal (CdCl ₂ y TTX, respectivamente) para suprimir las corrientes de acción.
   4. Aplicar una sv 2oltaje paso de -90 mV desde un potencial de 0 mV al parche para evocar I _h (Figura 5C). Tenga en cuenta que el potencial de la pipeta y el potencial de membrana en reposo están en serie en la configuración de conexión de ^células-56. Para más detalles, consulte la guía del axón y la Ref. ^39.
   5. Compruebe con regularidad por si deriva de la pipeta.
   6. Al final de la grabación, la ruptura del parche para ir en el modo de células enteras y de inmediato tomar una lectura del potencial de membrana. Retraer la pipeta como se describe en las secciones 4.8.2 y 4.8.3 para obtener un parche en el exterior hacia fuera.
4. Grabar en el soma correspondiente en el modo de células enteras
   1. Mira lo largo de la dendrita y localizar el soma correspondiente. Usar una pipeta de alta resistencia (5-10 mO) ^6,14,57 lleno de una solución de K ⁺ intracelular con base (Tabla 3). Aplicar una breve aspiración (presión negativa) a lapunta de la pipeta a la ruptura de la membrana con el fin de entrar en el modo de células enteras.
   2. Comprobar si la identidad de la neurona en la corriente-clamp mediante la aplicación a largo hiper e despolarizante pasos actuales (Figura 5D) y permitir biocitina se difunda a lo largo de las dendritas. Aplicar medidas actuales de despolarización cortos para visualizar el curso temporal AP.
   3. Después de ≤10 minutos, retirar la pipeta para obtener un parche en el exterior hacia fuera, como se describe en las secciones 4.8.2 - 4.8.3. transferir suavemente el sector mediante la abertura grande de una pipeta Pasteur en una botella de 25 ml de vidrio ámbar que contiene ACSF estándar. Cierre la botella con un tapón.
   4. Alternativamente, obtener primero un conjunto de células somáticas con una solución de la pipeta que contiene adicionalmente un colorante fluorescente. Permitir la difusión del colorante y seleccionar una parte de una dendrita ^26. Con una segunda pipeta, parchear la dendrita en el modo conectado por células. Utilizar un microscopio confocal si está disponible para mejorar la visualización de la etiqueta fluorescenteed dendrita ^14,22.
   5. Realizar grabaciones dendríticas en la configuración exterior hacia fuera, alternativa o adicionalmente a las grabaciones adjunta células ^10,22. Ver un ejemplo de una corriente de voltaje registrados a partir de un parche en el exterior hacia fuera en la Figura 5E y 5F.

6. Biocitina etiquetado de la sustancia negra neuronas

1. La fijación del tejido
   1. Si es posible, utilice habitaciones separadas para la grabación de rebanar / procesamiento histoquímico ^38.
   2. Fijar las rodajas mediante la sustitución de la ACSF con 4% de paraformaldehído en 0,1 M tampón fosfato salino (PBS, pH = 7,4) con una pipeta Pasteur. Utilice siempre la solución de fijación (<< 1 semana de edad) recién preparada.
      PRECAUCIÓN: Use guantes de la mano adecuadas y una campana química colocado en un laboratorio de histología para manipular paraformaldehído debido a su toxicidad. Lea la hoja de datos de seguridad de este producto peligroso antes de su uso y cdiablos de la normativa en materia de seguridad química (Directiva de Sustancias Peligrosas (67/548 / CEE) de la Comisión de la UE) ya que este polvo se cree que induce el cáncer. Otros detalles son en la Ref. ^58.
   3. Colocar las rodajas a 4 ° C durante la noche. Evitar la contaminación de la configuración de patch-clamp o cualquier equipo usado para electrofisiología y por paraformaldehído.
   4. Después de la fijación, reemplace la solución de fijación con PBS. Utilice un diferentes pipetas Pasteur para la eliminación de la solución de fijación y la aplicación de la PBS. Rebanadas de las tiendas en PBS a 4 ° C antes de su posterior procesamiento (1 - 2 semanas). En este caso, reemplace PBS dos veces a la semana. Utilice siempre recién preparada PBS (<< 1 semana de edad).
2. La tinción del tejido
   1. Preparar una placa de cultivo celular de 24 pocillos para las etapas de tinción. Utilice equipo limpio para transferir las rebanadas. Enjuague las rodajas de 3 x 5 min utilizando PBS fresca.
   2. Aplicar fluoresceína avidina DCS (avidina D, grado clasificador de células; 1 LUZ FLUORESCENTE mu lcein / ml Triton X-100) y 0,3% de Triton X-100 en PBS a 4 ° C durante la noche. Proteger las rebanadas de luz a lo largo de la tinción. Como una alternativa a la fluorescencia, las neuronas a través de la etiqueta 3,3 '-Diaminobencidina para la luz o el análisis microscópico de electrones ^21,58.
      PRECAUCIÓN: Triton X-100 es peligroso. Lea la hoja de datos de seguridad y las Directivas de la UE antes de usar esta sustancia.
   3. Enjuague 3 x 30 min con PBS y posteriormente con PB (tampón de fosfato, para evitar la formación de cristales en la superficie de la rodaja).
3. Montar las rebanadas en el portaobjetos de vidrio estándar. Cubrir las rodajas cuidadosamente con un medio de inclusión. Evitar las burbujas de aire en el medio de inclusión. Coloque el cubreobjetos con cuidado con el fin de cubrir completamente la rebanada. El aire seco de las diapositivas durante la noche antes de visualizar con un microscopio.
4. Almacenar las rebanadas marcados a 4 ° C después de la visualización. Trucos útiles en procedimientos histoquímicos están en las Refs. ^58,59.
5. Limpiar el equipo utilizado para la histología y la electrofisiología por separado. No mezcle la histología y el equipo de electrofisiología juntos.

7. Post Hoc La visualización de las neuronas llenas de Biocitina

1. Use un microscopio confocal para visualizar la morfología de las neuronas recuperados.
   1. Aproximadamente localizar la neurona marcada con fluorescencia en el sector con epifluorescencia. Examine el árbol dendrítico de las neuronas y localizar el axón y la ampolla axonal (de 2 - 4 m Ø) utilizando un objetivo de 10x o 20x. Documentar el curso del axón.
   2. Cambiar al microscopio confocal y seleccione el diodo láser de 488 nm para excitar la fluoresceína contenida en la neurona marcada. Siga la extensión del axón y dendritas en el eje z.
   3. Grabar imágenes sucesivas a fin de obtener una pila Z para toda la célula. Ajuste la resolución del eje z (distancia entre imágenes consecutivas) a 0,5 - 1 micra. Recoge imágenes confocal de un usin celularg baja (objetivo 10X) y alta (objetivo 60X, de inmersión en aceite) magnificación.
   4. Abra el archivo de imagen de la neurona obtenida con el microscopio confocal con un software de imagen (ImageJ) ^60. Comparación de la imagen z-proyección de una imagen IR-DGC con por ojo para localizar la posición exacta de las pipetas de parche durante la grabación electrofisiológico (Figuras 1, 2A, 3A, 4A, 5A y 5E).
   5. Determinar la morfometría de neuronas marcadas: medir el axón - distancia soma, las distancias entre las pipetas de registro a lo largo del dominio somatodentrítica y entre la pipeta y el axón dendríticas mediante la función "Medida" en ImageJ.
   6. Reconstruir algunas neuronas con NeuronJ (ImageJ), Imaris ²⁹ o ⁶¹ Neuromantic.

8. Análisis de datos electrofisiológicos

1. Utilice el paquete de software asociado con el amplificador para analizar groseramente los datos (por ejemplo, Clampfit) o directamente unaotro software de análisis de datos tales como Stimfit, un software de código abierto ^62,63 como en nuestra reciente publicación ¹³ o, por ejemplo WinWCP.

Resultados

El protocolo descrito anteriormente tiene la intención de facilitar la recogida de datos utilizando patch-clamp grabaciones dendríticas. Esta técnica, combinada con post hoc histoquímica, ayuda a hacerse una idea de los mecanismos de muchas señales eléctricas se originan o se extienden en las dendritas. Acceso directo a las dendritas con pipetas de parche es difícil, pero especial atención a varios aspectos metodológicos mejorará la tasa de éxito de las grabaciones. Un experimentador suficiente experiencia en la grabación somática estable puede esperar obtener una alta resistencia sellos (GΩ) y experimentos completos en la mayoría de los intentos. Una o dos grabaciones dendríticas de alta calidad pueden ser recogidos por la disección.

La disponibilidad de cortes de cerebro de alta calidad que contienen los cuerpos celulares y dendritas saludable es un requisito previo para acceder a estas estructuras finas (Figura 1). el Criteriuna para la selección de estas neuronas son una superficie lisa y homogénea por toda la célula y un soma y dendritas con bajo contraste cuando se observa con ajustado óptimas óptica (Figura 1A y 1B). Selección de las neuronas contrastan con demasiada fuerza generalmente conduce a grabaciones inestables (Figura 1C y 1C). Por lo tanto este tipo de neuronas deben ser evitados.

En comparación con otras neuronas, las neuronas DA nigrales exhiben características morfológicas y electrofisiológicas específicos. Estas características normalmente evaluados con una sola pipeta somática también se pueden observar en dual somática (Figura 2) y grabaciones somatodendríticos (Figura 3). Largas inyecciones actuales inducen una hiperpolarización potencial rectificación membrana llamada 'hundimiento' (Figuras 2B y 5D). El axón se origina, en la mayoría de los casos, en un sitio dendríticas como se identificautilizando criterios complementarios ^13,25,26, lo que indica que el compartimiento dendríticas en estas neuronas es heterogénea (Figura 3A - 3B). Como consecuencia de ello, el compartimento donde se observa la AP primero corresponde al compartimento en el que el axón surge (Figura 3C - 3D) ^13,25,26. El axón está generalmente terminada por una ampolla axonal causada por un corte de la axón durante el rebanado ^64, pero esta estructura no se detecta sistemáticamente.

El pandeo pronunciado observado en las neuronas DA nigrales consecutiva a la activación de I _h sugiere una alta expresión de las subunidades HCN. Para determinar la influencia de I _h en la integración de señales sinápticas, la corriente (EPSC) formas de onda sinápticas-como se generaron y se inyectaron a través del electrodo de registro dendríticas durante las grabaciones de doble somatodendríticos ⁵⁵ ( Figura 4). La cinética de estos EPSCs simulados se basaron en las constantes de la subida y el tiempo de desintegración de EPSCs espontáneas reales. El aEPSP resultante se registró con el electrodo somática. Bath aplicación de la I _h bloqueador de ZD 7288 aumentó la duración de la aEPSP, indicando la contribución de I _h a la evolución temporal de señales sinápticas (Figura 4B). ZD 7288 abolió también el potencial de membrana de rectificación que confirma que los resultados de colgar en la activación de I _h (Figura 4C). Los resultados obtenidos con los EPSP simuladas pueden ser correlacionados a los experimentos utilizando los EPSP evocados eléctricamente ^65. Para asignar la distribución precisa de la canal en el dominio somatodendrítica de neuronas DA, grabaciones adjunta células se llevaron a cabo (Figura 5). Un sello de alta resistencia (>> 1 GΩ) es una necesidad absoluta para las grabaciones adjunta células (Figura 5B I _h activa lentamente con pasos de voltaje de hiperpolarización de largo y se alcanza el estado estacionario actual después de cientos de ms (Figura 5C), como se indica anteriormente ^66. Esta observación indica que los canales HCN expresadas en las dendritas de las neuronas DA tienen diferentes subunidades en comparación con los de las neuronas piramidales u otros tipos de células ^10,16,66. Como la distribución del canal podría ser no homogénea en el compartimiento dendríticas y como el compartimiento dendríticas es en sí misma heterogénea, la identidad de la dendrita (axón-cojinete o dendrita nonaxon-cojinete) se revela mediante la comparación de la imagen de IR-DGC con la imagen confocal después de la tinción biocitina (Figura 3A y B). La recuperación de la morfología celular es por lo tanto necesario que ambas grabaciones somatodendríticos duales y para las grabaciones adjunta células a través de grabaciones de células enteras somáticas posteriores.

Figura 1. La visualización de las dendritas Soma y proximal de la sustancia negra neuronas dopaminérgicas Uso de infrarrojos videomicroscopia. (A) Imagen IR-DGC de una neurona DA nigral que muestra el soma y dendritas proximal y ambos pipetas somáticas y dendríticas. Una grabación somatodendrítica dual se realizó con éxito en esta neurona saludable. Observar el bajo contraste y la superficie lisa en todo el dominio somatodendrítica de la célula. (B) Otro ejemplo de una neurona DA saludable. (C) DA neurona con una superficie más rugosa y desigual y un contraste más fuerte. Si bien se ha obtenido una grabación dual, la estabilidad fue subóptima, y la duración de la grabación fue corto (~ 15 min) debido a un aumento gradual de la resistencia de acceso en ambos pipetas. (D) Segundo ejemplo de una neurona DA que muestra una fuerte contrastado soma y dendritas proximales. En este caso, se observó un fuerte aumento de la resistencia de acceso poco después de la ruptura en el modo de células enteras. Un intento de disminuir la resistencia acceso de presión negativa no tuvo éxito. Las neuronas en el panel C y D podrían haber sufrido daños durante el procedimiento de corte en lonchas y se deben evitar para los experimentos. (E) de grabación somática doble simultánea en una neurona DA saludable, al principio de la grabación. (F) La misma neurona como en el panel E con un cuerpo celular hinchada después de ~ 17 min. Tenga en cuenta la completa ausencia de contraste, la apariencia similar a una bola del soma y la presencia del gran núcleo que no es evidente en las neuronas sanas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. simultánea doble somática Grabación desde una neurona DA. (A) Imagen IR-DGC durante la grabación de doble somática a partir de una neurona DA. (B) hiperpolarizante y despolarizar largos inyecciones actuales 1 s (-160 a 80 pA, incremente 80 pA) y cambios de voltaje correspondientes grabar simultáneamente con las dos pipetas de parche. Cabe destacar la presencia del hueco en la traza de tensión con la larga etapa hyperpolarizing actual y el gran servicio post-hiperpolarización después de la AP durante el impulso de corriente de despolarización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Dual S grabación omatodendritic en una neurona DA. (A) Imagen IR-DGC de una neurona DA. La distancia entre el dendríticas y somapipeta tic es 29 micras imagen. (B) confocal z-proyección de la neurona en el panel A marcada con avidina conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC). La neurona se llenó con biocitina durante la grabación. El axón originó a partir de una dendrita proximal cerca de la soma como se indica por la flecha. (C) de grabación de voltaje de células enteras somatodendrítica dual simultánea de la neurona en el panel A. AP registrada en el soma (trazas de tensión negro) y dendrita (tensión rojo trazas) en respuesta a la larga etapa de inyección de corriente de un 1 s a través de la somática (de izquierda; negro traza actual) y la pipeta, alternativamente, dendrítica (derecha; rojo traza actual) (D) somático y AP dendríticas que se muestran en la escala de tiempo ampliado.. Con cualquiera somática o de inyección de corriente dendrítica, el AP somática (negro) precedió a la AP dendríticas (rojo). El retraso entre los puntos de acceso en esta neurona fue de 120 mu s y 210 mu s con somática y la inyección de corriente dendríticas, respectivamente. Los retrasosse midieron a AP amplitud máxima media durante la fase ascendente de la AP. El AP se observó por primera vez en el compartimiento cerca de la cual emerge el axón, lo que confirma observaciones anteriores ^25,26. En este caso, la grabación dendríticas se hace de una dendrita axón-deficiente. Un ejemplo de una grabación de una de las dendritas axón-cojinete está en la Ref. ¹³ (en su Fig. 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Propagación de EPSP artificiales A lo largo del eje del somatodendrítica DA neuronas. Imagen IR-DGC de una neurona DA (A). La distancia entre el dendríticas y la pipeta somática es 45 micras. Ambos pipetas de parche están en el modo de células enteras de grabación actual-clamp. (B) actualgrabado con la pipeta dendríticas en corriente-clamp y utilizado para generar la EPSP artificial (parte superior). La corriente se obtiene por la inyección de una forma de onda EPSC-como (t _altura = 0,6 ms; tau _decaimiento = 3 ms; amplitud = 100 pA) a través de la pipeta de grabación dendríticas ^55. En la parte inferior, aEPSPs registrados en el soma en el control de las condiciones (negro) propagada y después de la aplicación del baño de la ZD7288 I _h bloqueador (30 M; trazo rojo). Cada traza de tensión es el promedio de 40 barridos individuales. Observe el gran aumento en la duración del EPSP en presencia de ZD7288 que indica la contribución de I _h a la evolución temporal de los EPSP. (C) Tensión trazas grabadas desde el soma en condiciones de control (negro) y después de la aplicación de ZD 30 M 7288 ( rojo) en respuesta a una larga (30 pA; 1 s) paso actual de hiperpolarización. Nótese la ausencia de potencial de membrana de rectificación (sag) después de que el bloqueo de I _{h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.}

Figura 5. Presencia de I _h en las dendritas de las neuronas DA. (A) Imagen IR-DGC de una neurona DA pipeta sobre las dendritas proximales. (B) y las corrientes capacitivas de fuga durante un comando de tensión 5 mV en configuración de conexión celular. La resistencia del sello fue 5 GΩ en este ejemplo la etapa (C) de voltaje hiperpolarizante. (90 mV; parte superior) a partir de un potencial de membrana de 0 mV indujo una activación lentamente I _h. La traza actual se invirtió y equipado con una sola función exponencial dando una constante de tiempo de tau = 632 ms. (D) Tensiónrespuestas del soma registrada de células enteras (panel A) a 1 s hiper e impulsos de corriente de despolarización (-160 a 120 pA, 40 de incremento PA). La grabación de células enteras somática se realizó después de la grabación adjunta por células. Nótese la ausencia de puntos de acceso debido a la aplicación extracelular de TTX y Cd ²⁺ para suprimir la activación espontánea durante la grabación adjunta por células. Estos voltaje Na ⁺ y Ca ²⁺ se añadieron bloqueadores actuales para suprimir las corrientes de acción. Los paneles A - D son de la misma neurona (E) la imagen IR-DIC de otra neurona DA y una pipeta dendríticas corrientes (F) dependiente de la tensión activa mediante un impulso de prueba a 0 mV a partir de un prepulso de 50 ms a -120 mV.. en un parche en el exterior hacia fuera extirpado de la dendrita proximal de la neurona en el panel E. Holding potencial de -80 mV. Tenga en cuenta la inactivación dependiente del tiempo de la corriente. Haga clic aquí para ver una más grandeversión de esta figura.

Sustancia	g / mol	Concentración	para 1 L
NaCl	58.443	125 mM	7.305 g
NaHCO3	84.007	25 mM	2.100 g
KCl	74.551	2,5 mM	0,186 g
NaH 2 PO 4	137.99	1,25 mM	0,172 g
glucosa	198.17	25 mM	4,95 g
MgCl 2	1 M (solución)	1 mM	1 ml
CaCl 2	1 M (solución)	2 mM	2 ml
Osmolaridad: ~ 310 mOsmol / L (rango óptimo: 314-325 mOsmol / L), pH = 7,4

Tabla 1: líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF).

Sustancia	g / mol	Concentración	para 1 L
NaCl	58.443	87 mM	5.084 g
NaHCO3	84.007	25 mM	2.1001 g
KCl	7.551	2,5 mM	0,18637 g
NaH 2 PO 4	137.99	1,25 mM	0,17248 g
MgCl 2	1 M (solución)	7 mM	7 ml
glucosa	198.17	10 mM	1,9817 g
sacarosa	342,29	75 mM	25,672 g
CaCl 2	1 M (solución)	0,5 mM	0,5 ml
Osmolaridad: ~ 326 mOsmol / L, pH = 7,4

Tabla 2: sacarosa-ACSF para preparar rodajas.

Sustancia	g / mol	Concentración	para 100 ml
KMeSO 4	150,2	120 mM	1,8024 g
KCl	74.56	20 mM	0,14912 g
MgCl 2	1 M (solución)	2 mM	200 l
Na 2 ATP	551.1	2 mM	0,1102 g
Na 2 GTP	523,2	0,5 mM	0,02661 g
Na 2 -Phosphocreatine	255.1	5 mM	0,1275 g
EGTA	380,4	0.1 mM	3.803 mg
Hepes	238,31	10 mM	0,23831 g
biocitina	1 mg / mL		0,1 g
Osmolaridad: ~ 302 mOsmol / L, pH = 7,2 ajustado con KOH

Tabla 3: solución intracelular para las grabaciones duales.

Sustancia	g / mol	Concentración	para 100ml
KCl	74.56	120 mM	0,8947 g
CaCl 2	1 M (solución)	2 mM	200 l
MgCl 2	1 M (solución)	1 mM	100 l
Hepes	238,31	10 mM	0.23831
TEA-Cl	165,7	20 mM	0,3314 g
4-AP	94.11	5 mM	0,04705 g
BaCl2	244.26	1 mM	0,02443 g
CdCl2	183.32	0.02 mM	0.3666 mg
TTX	1 mM	200 nM	20 l
Osmolaridad: ~ 290 mOsmol / l, ajustado con D-glucosa (Ref. 16); pH = 7,4

Tabla 4: solución de electrodos para grabaciones unido por células.

Discusión

Este informe describe un protocolo paso a paso para implementar registros de célula entera somatodendríticos duales y grabaciones dendríticas locales. Es útil para la determinación de la influencia de los canales iónicos (es decir, I _H) en el curso temporal de los potenciales postsinápticos y mapeo de la distribución del canal iónico (I _h) a lo largo del dominio somatodendrítica de neuronas DA nigrales, respectivamente. Resultantes mediciones electrofisiológicas se combinan para publicar histoquímica hoc para recuperar la morfología celular. Se empleó el procedimiento para investigar las neuronas DA situados en la sustancia negra, pero puede ser generalizada para las neuronas de la sustancia negra vecinos de GABA, las neuronas DA área tegmental ventral o otras neuronas del cerebro medio. Todos los pasos también pueden ser seguidos para examinar otros canales iónicos expresados en dendritas de las neuronas de la sustancia negra sin modificaciones importantes. Visualización post hoc es particularmente pertinente para las neuronas con axones de soportedendritas, como las neuronas de la sustancia negra, ^25,26 interneuronas del hipocampo Oriens-alveus ²¹ o algunas neuronas piramidales CA1 ^67. Curiosamente, las neuronas que comparten esta característica parece ser más común de lo que generalmente se piensa ^67. El análisis morfológico revela también la posición exacta de los electrodos y del axón. La detección de este último puede ser optimizado por el etiquetado de las proteínas expresadas en el segmento axonal inicial (canales de Na ⁺ dependientes de voltaje o Ankyrin G) mediante inmunohistoquímica ^68,69.

La fiabilidad de los datos recogidos con grabaciones dendríticas y etiquetado neuronal posterior siempre depende de la calidad de la rebanada. esfuerzo máximo necesita, por tanto, que debe aplicarse para preservar la viabilidad de las células dentro del tejido. Esto se consigue con un manejo suave de los animales sanos, herramientas de alta calidad y reactivos, la oxigenación suficiente de las temperaturas del tejido y heladas durante la preparación de las rebanadas. condiciones de grabación estables dependen de la selección de las neuronas sanas. En el modo de células enteras, la resistencia serie debe inicialmente ser tan bajo como sea posible y mantenido constante durante todo el experimento. La estabilidad de las grabaciones depende más de manipuladores de alta calidad carentes de deriva y las vibraciones. Estas perturbaciones pueden ser reducidos mediante la optimización de la estabilidad de la pipeta: comprobar la conexión a soporte de pipeta y para cabezal de la platina, el control de cables que son micromanipulador holgura, evitar cambios bruscos de temperatura o movimiento de la platina y de comprobar el mecanismo del manipulador. Para grabaciones duales, metilsulfato ^13,15,21 se ha incluido en la solución intracelular, pero gluconato ^9,14,25 alternativamente se pueden emplear. Sin embargo, el anión principal puede alterar el potencial de membrana ^70,71 y algunas corrientes dependientes de voltaje ^72. solución intracelular puede ser complementado con ATP, GTP y fosfocreatina para preservar la physiologicas funciones de las neuronas. Además, la adición de un colorante fluorescente en la solución de la pipeta (por ejemplo, Alexa 594 o sulforodamina 101 ⁴¹⁾ para visualizar las dendritas durante una grabación somática puede ser útil por ejemplo para colocar una aplicación de presión (Figura 7 en la Ref. ⁴¹⁾ o un estimulante eléctrico pipeta. La solución de la pipeta para las grabaciones adjunta células contiene una alta concentración de K ⁺ y Na ⁺ sin registrar grandes I _h. Cabe destacar la relación de la concentración de Na ⁺ / K ⁺ influye en la amplitud de la corriente ^10, el potencial de inversión de la corriente ¹¹ y la compuerta de I _h ^73. Alternativamente, I _h también se pueden grabar utilizando fuera de espera ^10. En esta configuración de grabación sin embargo, el medio intracelular en la proximidad de los canales puede ser perturbado. En consecuencia, las diferencias en la activación dependiente de la tensión de I _{h se observa cuando se comparan las corrientes obtenidas usando parches adjunta células y fuera de espera ^10. Hinchazón de las neuronas se encuentra ocasionalmente durante la grabación de patch-clamp, y, a menudo surge de causas distintas, tales como la baja calidad del agua, fuerte desequilibrio de la osmolaridad o pH entre el ³⁹ soluciones o errores intra y extracelular en la composición de las soluciones. La calidad de los registros electrofisiológicos tiene una incidencia directa sobre la calidad de la morfología de las neuronas recuperados. Alta resistencia pipetas somáticas se utilizan para grabaciones duales (6 - 10 mO, como en Refs ^6,11.) Y para las grabaciones somáticos individuales después de grabaciones adjunta células para reducir al mínimo la dilución del medio intracelular ^14. Por lo tanto, la grabación somática de células enteras después de la grabación adjunta celular se mantiene corto (<10 min). parches exterior hacia fuera tanto de la somáticas y pipetas dendríticas son esenciales para el cierre correcto de la cmembrana ell y la posterior recuperación de la morfología celular. Además de la estructura de la célula, el contenido neuroquímico se puede determinar para las neuronas registradas ^59,74. Por ejemplo, el intracelular tirosina hidroxilasa proteína se puede immunolabeled para la identificación inequívoca de las neuronas DA ^13.}

Neuronas DA se concentran principalmente en la SN pars compacta, con una densidad mucho más baja presente en el SN pars reticulata, donde se entremezclan con un mayor número de neuronas GABA ^75. Mientras que el cuerpo celular de las neuronas DA es a menudo mayor que el de neuronas GABA, la identificación visual de estas células con IR-videomicroscopy es incierto y parcialmente impedido por la opacidad de los pars compacta. Para evitar estas limitaciones, la pre-selección de las neuronas DA puede ser facilitada por el uso de ratones transgénicos que expresan un marcador fluorescente en una población específica de neuronas (TH ⁶⁵ o DAT para neuronas DA, GADpara las neuronas GABA) y la iluminación de epifluorescencia. Alternativamente, un colorante fluorescente puede ser incluido en la solución del electrodo somática para facilitar la visualización de las dendritas. El aumento de la resolución de la célula fluorescente es traído por hilatura Nipkow confocal de disco ^14,22,30 o microscopía de dos fotones ⁷ combinado con IR-DGC ^6. Varias ventajas están relacionadas con DGC en comparación con DIC. En primer lugar, ya que no se requieren prismas DIC, la imagen IR-DGC puede ser superpuesta con una imagen de fluorescencia ^49,52,53,76. En segundo lugar, DGC se puede combinar con la fotoestimulación y optogenética ^77.

Una desventaja de rebanada preparación es la preservación de la integridad de las neuronas. Neuronas DA extienden sus dendritas en los tres planos del espacio ^78,79 y por lo tanto el truncamiento del compartimiento dendríticas no pueden evitarse por completo en rodajas ^80. La elección de la orientación de las rebanadas (coronal, horizontal o parasagital) es un trade-off. El origen de la inervación y el diseño experimental se debe considerar para seleccionar la orientación correcta de las rebanadas.

parches dendríticas directa es la técnica utilizada para mapear la distribución de los canales iónicos funcionales en los diferentes compartimientos de las células. Además, esta técnica ofrece para determinar la variabilidad en las propiedades funcionales de los canales ^20. Como complemento de la ubicación y densidad de los canales iónicos se pueden determinar mediante inmunohistoquímica en los niveles de luz y microscopía electrónica ^17,23. Este enfoque también ofrece la posibilidad de determinar la densidad de canales en las estructuras de pequeño calibre que son inaccesibles para las pipetas de parche. Sin embargo, estos canales pueden estar en un estado funcional distinta ²⁴ o incluso inactivos en comparación con los registrados utilizando técnicas de patch-clamp. Ambas técnicas son, por tanto, necesaria para obtener una imagen completa de la ubicación y las propiedades decanales iónicos en una región celular específica ^17. Con el desarrollo de colorantes sensibles al voltaje, de formación de imágenes de tensión se ha utilizado para examinar la propagación de puntos de acceso y los EPSP en las neuronas en múltiples lugares ^81. Como alternativa a las grabaciones de doble patch-clamp, este enfoque aún se puede implementar para dendritas finas que no son accesibles a las pipetas de parche, pero requieren una calibración precisa de la señal y el promedio.

Si bien las neuronas DA en el SN y el área tegmental ventral son ampliamente investigados a través de grabaciones somáticas en el contexto fisiológicos y fisiopatológicos, las propiedades funcionales de sus dendritas sigue siendo en gran parte desconocidos en ambas condiciones. Parches de dendritas se ha implementado para las neuronas dopaminérgicas nigrales por varios grupos con éxito ^13,25,26 y sigue siendo el método de elección para diseccionar propiedades excitables de estas estructuras subcelulares finas ^8. grabaciones dendríticas proporcionan una mayor opportunidad de controlar la eficiencia y la plasticidad de la transmisión sináptica y la plasticidad de la excitabilidad dendríticas ^82,83.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agua bidestilada	Millipore	Super Q	Resistividad >14 MΩ cm, ideal 18,2 MΩ cm a 25  ° C, filtrado (0,22 y micro; m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Velas de microfiltro	Robu	Porosidad 3, 6 mm o 13 mm de diámetro
Cortadora de pañuelos con vibrosonda	Leica	VT1200	Parámetros de corte: velocidad 0,07, amplitud 1,40
Cortadora de pañuelos	Dosaka	DTK-1000 Parámetros de	corte: velocidad 4, frecuencia 7
Cuchillas de afeitar	Gilette	Super Silver
Herramientas de disección	Braun, Aesculap
Cámara de reserva			PP a medida
beckers	VWR	213-1725	400 ml
Filtro de jeringa	Merk Millipore	Millex - GV 0.22 µ m
Pegamento de cianoacrilato	UHU	"Sekunden Kleber"	pegamento líquido
Cámara de grabación	Luigs & Neumann	Slice mini cámara
Extractor de pipetas horizontal	Sutter Instruments	Brown-Flaming P-97
Pipetas	Hilgenberg	1807524	2 mm de diámetro exterior/1 mm de diámetro interno capilares de vidrio, extremos pulidos al fuego, lavados
Cera dental	Coltè Tiras	de cera para bandeja ortodóntica
Rejilla			para anclar lonchas en la cámara de grabación, hecha a medida con un disco de platino
Microforge	Narishige	MF-830	para puntas de pipeta pulidas al fuego
Sulfato de metilo de potasio	MP Biomedicals 215481
Biocytin	Sondas moleculares	B1592
Manómetro	GREISINGER electrónico	GDH 13 AN
Microscopio	Zeiss	FS
Dodt Gradient Contrast	Luigs & Manipuladores Neumann
	Luigs & Neumann	LN Mini 25
Capturador de fotogramas	La fuente de imagen	Cámara DFG/USB2pro
	Condensador DAGE-MTI	NC-70
Condensador	Zeiss		alta apertura numérica que funciona con aceite
Objetivo	Zeiss	W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR	63X ampliación, larga distancia, alta apertura numérica 1.0 inmersión en agua objetivo
Cambiador cuádruple	Luigs & Neumann		entre la cámara y el microscopio
Monitor de vídeo en blanco y negro	Sony	SSM-175CE	16 pulgadas, 850 líneas de TV, analógico
Frascos de muestra, vidrio ámbar, con tapón	VWR	215-2409	para transferir cortes de la instalación a la sala de histología
The Axon Guide	Molecular Devices		Book
Stimfit	https://github.com/neurodroid/stimfit		Análisis de datos electrofisiológicos
Paraformaldehído	Sigma	441244	ver FICHA DE DATOS DE SEGURIDAD y Directiva de Sustancias Peligrosas (UE) antes de usar
pocillos	Greiner-Bio-One	662160	para la tinción de lonchas fijas
Triton X-100	Merk	108643	ver FICHA DE DATOS DE SEGURIDAD y Directiva de Sustancias Peligrosas (UE) antes de su uso
Concentración de trabajo monoclonal primaria anti-TH de ratón	Immunostar	22941	1/1.000
anticuerpo secundario anti-ratón anti-ratón de cabra - Alexa Fluor 568	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	A-11031	concentración de trabajo: 1/500
Suero de cabra normal	Sondas moleculares Dako	X0907
ProLong Diamond Antifade	- Thermo Fisher Scientific	P36961
Fluoresceína Avidina DCS	Vector Lab	A-2011
Microscopio confocal	Olympus	FV1000
ImageJ	http://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJ	http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/		plugin para ImageJ
Imaris	http://www.bitplane.com		Reconstrucción de neuronas llenas de biocitina
Neuromantic	http://www.reading.ac.uk/neuromantic/		Reconstrucción de neuronas llenas de biocitona
WinWCP	http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm		Análisis de datos electrofisiológicos