Artículo de método

Técnica robótica automatizada de dispensación de Orientación de la superficie de las células y Bioprinting

DOI:

10.3791/54604

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18 de noviembre de 2016

 ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe una metodología de bioimpresión que utiliza un sistema de depósito robótico automatizado que incorpora señales de guía topográficas grabadas con la deposición de precisión de una célula que contiene biotinta de hidrogel. Las células impresas se entregan directamente a las características grabadas y son capaces de detectar y orientarse con ellas.

Resumen

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Este manuscrito describe la introducción de características de orientación celular seguido de la entrega directa de las células de estas características en un bioink hidrogel usando un sistema de dispensación robótico automatizado. Se seleccionó la bioink particular, ya que permite que las células se sedimentan hacia y detectan las características. El sistema de distribución bioprints células viables en bioinks de hidrogel utilizando un cabezal de impresión contrapresión asistida. Sin embargo, mediante la sustitución de la cabeza de impresión con un lápiz o un bisturí afilado, el sistema de dispensación puede también ser empleado para crear señales topográficas a través de ataque químico de la superficie. El movimiento de la aguja se puede programar en pasos de 10 micras en los ejes X, Y y Z. Las ranuras estampadas fueron capaces de orientar las células madre mesenquimales, influir en ellos para adoptar una morfología alargada en alineación con la dirección de las ranuras. El patrón podría ser diseñado utilizando software de trazado de líneas rectas, círculos concéntricos, y las ondas sinusoidales. En un procedimiento posterior, fibroblastos y células madre mesenquimales se suspendieron en un bioink gelatina 2%, para bioprinting en una contrapresión impulsado cabezal de impresión de extrusión. El bioink rodamiento celular a continuación, se imprime usando las mismas coordenadas programadas utilizados para el grabado. Las células bioprinted fueron capaces de detectar y reaccionar a las características grabadas como se demuestra por su orientación alargada a lo largo de la dirección de las ranuras grabadas.

Introducción

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El patrón deliberada de colocación celular permite la formación de las culturas que imitan in vivo organización celular 1. De hecho, la investigación sobre la interacción entre múltiples tipos de células puede ser asistido por la organización de su situación espacial 2,3. La mayoría de los sistemas de modelado se basan en procedimientos de modificación de superficie para promover o prevenir la adhesión celular con la deposición de células pasiva posterior. Bioprinting ofrece un control espacial y temporal sobre la distribución de la celda 1. Además de estas funciones, bioprinting ha sido descrita como un método técnicamente sencilla, rápida y rentable para la generación de andamios geométricamente complejas 4. Se utiliza el software de diseño por ordenador y permite la introducción de células en el proceso de fabricación 4.

Sistemas Bioprinting se han clasificado sobre la base de sus principios de trabajo como el láser basados, a base de inyección de tinta o de extrusión de base 4. Bioprinting de extrusión ha sido descrito como el más prometedor, ya que permite la fabricación de construcciones organizadas de tamaños clínicamente relevantes dentro de un marco de tiempo realista 4-6. Se lleva a cabo por cualquiera de presión mecánica o la parte posterior de extrusión asistida de un hidrogel bioink cojinete celular. En el método que aquí se presenta, se empleó la contrapresión. Como se ha mencionado, las células se entregan en un bioink citocompatible. Tal bioink debe apoyar la entrega de las células sin producir tensión de corte deletérea, y ser de una viscosidad suficiente para mantener la integridad de la huella impresa, sin colapsar o propagar (referido como "corrimiento de la tinta") 7-10.

La interacción de las células con su superficie adherente se sabe que influyen en el comportamiento celular. La topografía de la superficie se puede controlar la forma de la célula, la orientación 11, e incluso el fenotipo. En particular, la fabricación de ranuras y canales se han demostrado para inducirun estirado, morfología alargada en múltiples tipos de células. La adopción de esta morfología se ha encontrado para influir en el fenotipo de las células multipotentes y pluripotentes. Por ejemplo, cuando se alinea en ranuras, las células madre mesenquimales (MSC) mostrar evidencia de diferenciación hacia cardiomiocitos 12,13 y células musculares lisas vasculares adoptar el fenotipo contráctil sobre el sintético 10,14-17.

La célula de la alineación de canales o ranuras puede ser generada en una superficie polimérica a través de una serie de métodos, por ejemplo, en el fondo de ataque químico iónico reactivo, la litografía por haz de electrones, la impresión láser directa, láser de femtosegundo, fotolitografía y grabado en seco plasma 18. Estos enfoques son a menudo mucho tiempo, requieren un aparato complejo y puede ser limitante en la forma del patrón generado. Además, no se sincroniza con el patrón bioprinting y no permiten cellularization inmediata. El movimiento coordinadamente controlada de un automatizadosistema de dispensación puede seguir patrones complejos para la deposición de soluciones. Aquí demostramos cómo el movimiento microescala controlado puede ser explotada para crear canales para la orientación de la celda. Un lápiz o escalpelo afilado se encuentra junto a la cabeza de impresión en lugar de la jeringa de extrusión y el equipo se pueden grabar la superficie del polímero bajo la dirección del software de trazado. El método ofrece versatilidad en el diseño patrón y es aplicable a materiales poliméricos usados ​​comúnmente en la bioingeniería, tales como poliestireno, PTFE, y policaprolactona. Como paso posterior al ataque químico, las células pueden bioprinted directamente a las ranuras rayados. El bioink gelatina utilizada aquí fue capaz de mantener tanto la traza y permitir que las células depositadas al sentido las características grabadas. Las células madre mesenquimales bioprinted a las ranuras grabadas se demostraron para alargar lo largo de ellos en líneas distintas.

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Protocolo

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NOTA: Este protocolo describe el uso de un sistema de dispensación asistida por robot (Figura 1A) de nuevo a la presión como un ataque químico de la superficie (Figura 1B) y bioprinter a base de extrusión (Figura 1C) 10.

1. Modificación de una superficie de poliestireno

  1. Utilice 1 hojas mm de poliestireno desde placas de cultivo tisular de poliestireno tienden a inclinarse hacia arriba en el centro, arruinando la consistencia altura tanto de grabado y de impresión.
    NOTA: Como las láminas de poliestireno no se modifican para la adhesión celular, se lleva a cabo tratamiento de plasma.
  2. tratamiento con plasma de oxígeno.
    1. En primer lugar, seleccionar una presión de 2 bar en el regulador del cilindro de oxígeno conectada a la máquina de plasma. A continuación, cambie la máquina de plasma y la entrada de las siguientes condiciones en el panel de mandos de la máquina: 150 W, 30 SSCM de oxígeno, 10 min (para la energía, el flujo de gas y la hora, respectivamente).
    2. Coloque el substrat de poliestirenoE en la cámara de plasma, sellar la puerta y pulse el botón de inicio en el panel de control. Remojar el sustrato de poliestireno tratada con plasma de oxígeno en suero bovino fetal y se incuba a 37 ° C durante 2 horas antes de lavar tres veces con fosfato 1x solución salina tamponada (PBS).

2. Programación Patrones de impresión

  1. Utilizar el Programa para Primera atacar la superficie con una aguja o un bisturí.
    1. Cuando se utiliza una aguja, insertar una aguja textil 1,5 mm de diámetro (desde el interior con gran cuidado) en la boquilla de una jeringa de dispensación (ya sea 5 o 10 ml) hasta que se aprieta y se fija. Si se utiliza un bisturí, elegir un bisturí ronda manipulado de forma tal que se puede sujetar en el mecanismo de sujeción del brazo de la impresión.
      NOTA: El lápiz graba mejor que la hoja de bisturí patrones curvos.
    2. La primera vez que se intenta crear un arreglo bioprinted, dibujar el patrón deseado en papel cuadriculado con ejes numerados para generar las coordenadas XY. Entonces yonput las coordenadas del dibujo grabado / bioprinted en el software de hoja de cálculo (Figura 2).
      NOTA: El "patrón deseado" puede ser de muchas formas, tales como lineal, en forma de S, o circular. La elección depende del modelo experimental requerido, tales como líneas paralelas lineales para la diferenciación de las MSC en cardiomiocitos como se ha demostrado aquí. La función de gráfico de dispersión permite la visualización del patrón de trama propuesta.
    3. Abra el / la dispensación de software de impresión. Seleccionar "Programa> Agregar programa" seguido de "Edición> Añadir punto" para configurar el programa. Exportar el X y la coordenada y los valores obtenidos a partir de la hoja de cálculo en la impresión / software utilizando la dispensación de "copiar y pegar" función.
    4. Calibrar la altura "z" del robot antes de cada ejecución con el fin de colocar la boquilla de lápiz / impresión sobre la superficie.
      1. En el / software de dispensación de impresión, seleccione la opción "Robot", haga clic en "Cambiar el modo y# 34; y habilitar la opción "Modo de enseñanza". Una vez seleccionado, el software permite la función "Jog" del robot.
      2. Para correr, primero inicializar el robot a su posición predeterminada mediante la selección de los siguientes comandos desde la barra de menú; "Robot> Inicializar Meca", a continuación, seleccione "Robot> Jog". Introducir los valores numéricos (en mm) en el "X e Y" ranuras requeridas para colocar el lápiz exactamente en el origen del patrón.
      3. A continuación, introduzca un valor numérico (en mm) en la ranura para "Z" para colocar la boquilla de la aguja o la impresión en contacto con la superficie, pero no la flexión o sangría a la superficie. Este punto se designa como valor inicial "Z".
        NOTA: La profundidad de cada ranura se puede variar fácilmente usando el Z-altura del sistema. Las ranuras de 40, 80, y 170 micras se demuestran a cortar en la superficie de 1 mm de espesor láminas de poliestireno (Figura 4 y Tabla 1).
    5. Seleccione la pde instrucciones rint para cada uno de los puntos de coordenadas, es decir, "Inicio de la línea de dosificación" para definir el primer punto y el inicio de impresión, "línea de pase" para designar los puntos intermedios y "Fin de la línea de dosificación" para indicar al robot para poner fin a la tirada.
    6. Comunicar el programa al robot mediante la selección de los comandos de seguimiento de la barra de menú superior: "Robot> Enviar C & T de datos".
    7. Iniciar la marcha / impresión de grabado, cambiando el robot al modo "Run". Para ello, selecciona "Robot> Modo de Cambio> Cambiar el modo de funcionamiento" en la barra de menú superior.
    8. Iniciar el procedimiento de impresión pulsando el botón de "inicio" verde en la consola dispensador de robot.

3. Preparación e impresión de gelatina que contienen células Bioink

  1. Disolver 2% de gelatina en medio esencial mínimo alfa Medio (aMEM) (suplementado con 10% de FBS y 2% de antibiótico / antimycotic) a 60 ° C durante 2 horas para preparar las soluciones bioink.
  2. Precultivo la proteína roja fluorescente que expresan las células madre mesenquimales (RFP-MSC) a 70% de confluencia en 10 cm placas de cultivo de tejidos utilizando aMEM / 10% de SFB. Soltar las células unidas en suspensión eliminando el medio y el recubrimiento con una solución de 1x tripsina-EDTA durante 5 min a 37 ° C.
  3. Sedimentar las células por centrifugación a 1000 xg durante 5 min y separar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en 0,5 ml de PBS 1x y contar la densidad de células usando un hemocitómetro.
  4. Después de permitir que la bioink se enfríe a temperatura ambiente, la mezcla suavemente en un volumen suficiente para la suspensión de RFP-MSC en el bioink para lograr una concentración final de 5 x 10 6 células ml-1.
  5. Verter la bioink cojinete de células en una jeringuilla de impresión con la boquilla de sellado. Enfriar la jeringa cargada a 4 ° C con el fin de alcanzar una viscosidad imprimible.
  6. Coloque la jeringa cargada en la automatizadasistema de dispensación robótico y conecte las líneas de presión de aire. Retire la jeringa Luer sello y adjuntar la boquilla de impresión.
  7. Extruir la bioinks cellularized en líneas delgadas utilizando 0,05 MPa contrapresión, a las 5 mm / seg velocidad de escritura de una jeringa de 10 ml a través de un 27 G de aguja / boquilla (apretados recomienda más cilíndrica) sobre una superficie de la película de poliestireno, después de depositar previamente programada patrón descrito en el paso 2.1 para colocar el bioink cellularized en las ranuras pre-grabadas.
  8. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, añadir 10 ml de medio de crecimiento (suplementado con 10% de FBS y antibióticos) y se incuban las células durante 24 horas (para permitir que las células para detectar y reaccionar a las características grabadas al agua fuerte) antes de ver usando un microscopio de fluorescencia invertido un aumento de 10x.

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Resultados

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Los resultados representativos demuestran que el sistema de dispensación robótica asistida contrapresión se puede utilizar como un bioprinter a base de extrusión para llevar a cabo tanto de ataque químico de la superficie y la impresión bioink (Figura 1 A). Se puede utilizar para la generación de ranuras grabadas en superficies de polímero, y para imprimir posteriormente un bioink cojinete célula directamente a las características (Figura 1 B y C).

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Discusión

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El paso fundamental de este procedimiento es la entrega bioprinting real de las células madre ya que el proceso debe permitir la sedimentación de células a las características, imprimir sin bioink difusión / sangrado, entregar las células sin la muerte celular esfuerzo de corte y no desencadenar la diferenciación hacia el linaje no deseado.

Si la alineación de celdas esperado no se produce, entonces la viscosidad bioink, se debe evaluar su idoneidad para la impresión. Es importante que la bi...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero contrapuesto.

Agradecimientos

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El trabajo presentado aquí está respaldado por la Fundación Nacional de Investigación de Singapur bajo el programa CREATE (NRF-Technion): La Iniciativa de Medicina Regenerativa en el Programa de Investigación de Terapia de Restauración Cardíaca y por la Financiación del Sector Público (PSF) 2012 del Consejo de Investigación de Ciencia e Ingeniería (SERC) bajo la Agencia para la Ciencia, Tecnología e Investigación (A*STAR).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Equipment
Sistema de dispensación robóticoJanome2300N
Máquina de plasmaFemto ScienceCovance
Microscopio USB Microscopio
ópticoOlympusIX71
Name EmpresaNúmero de catálogoComentarios
SoftwareHoja de
cálculoExcel
Excel Impresión Excel Software de coordenadasJanomeJR C-Points
Software de imagenInstitutos Nacionales de Salud (NIH)ImageJ
NombreCompañíaNúmero de catálogoComentarios
Equipo
Stylus (Blade)OLFAAK-5
5 ml jeringa de impresiónSan-ei TechSH10LL-B
30 G agujade impresión San-ei TechSH30-0.25-B
poliestireno de 1 mmComprado localmente
Suero fetal bovinoInvitrogen 10270-098
Invitrogensalina tamponada con fosfato
de piel porcina, fuerza de gel 300, Tipo ASigma Aldrich9000-70-8
α MEMInvitrogen41061-029
Antibiotc antimicóticoSigma AldrichA5955-100ML
Células madre mesenquimales de proteína fluorescente roja (RFP-MSCs)Cyagen Biosciences IncorporaciónRASMX-01201
Hojas deGelatina

Referencias

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