genotipado de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; por Ribosómica espaciador de PCR (RS-PCR)

Resumen

Aquí, el espaciador ribosómico PCR (RS-PCR) se utiliza junto con un sistema de electroforesis miniaturizado como un método rápido y de alta resolución para el genotipado de S. aureus a costos moderados que permiten un alto rendimiento.

Resumen

El espaciador ribosómico PCR (RS-PCR) es un método de genotipado altamente resolutivo y robusto para S. aureus que permite un alto rendimiento a costos moderados y, por lo tanto, es adecuado para ser utilizado con fines rutinarios. Para obtener la mejor resolución, evaluación y gestión de datos, se requiere un sistema de electroforesis miniaturizado. Junto con un sistema de electroforesis de este tipo y el software desarrollado internamente (disponible gratuitamente aquí), la asignación del patrón de bandas a un genotipo está estandarizada y es sencilla. La extracción de ADN es sencilla (preparación por ebullición), la configuración de las reacciones es sencilla y se pueden realizar en cualquier máquina de PCR estándar. Los ciclos de PCR son comunes, excepto los tiempos prolongados de rampa y elongación. En comparación con la tipificación SPA y la tipificación de secuencias multilocus (MLST), RS-PCR no requiere secuenciación de ADN, lo que simplifica considerablemente el análisis y permite un alto rendimiento. Además, la resolución de las cepas bovinas de S. aureus es al menos tan buena como la de la tipificación en spa y mejor que la MLST o la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). La base de datos RS-PCR incluye actualmente un total de 141 genotipos y variantes. El método está altamente asociado con el patrón genético de virulencia, contagiosidad y patogenicidad de las cepas de S. aureus involucradas en la mastitis bovina. El genotipo B de S. aureus (GTB) es contagioso y causa problemas a los rebaños, causando grandes costos en Suiza y otros países europeos. Todos los demás genotipos observados en Suiza infectan a vacas individuales y cuartos. El genotipado por RS-PCR permite predecir de forma fiable el potencial epidemiológico y patogénico de S. aureus implicado en la infección intramamaria bovina (IMI), dos factores clave para la medicina veterinaria clínica. Debido a estas propiedades beneficiosas, junto con costos moderados y un alto rendimiento de muestras, el objetivo de esta publicación es proporcionar un protocolo detallado paso a paso para establecer y ejecutar fácilmente RS-PCR para el genotipado de S. aureus en otros laboratorios.

Introducción

Staphylococcus (S. aureus) se conoce como el patógeno más importante en todo el mundo responsable de la infección intramamaria (IMI) en el ganado ^1. El estudio realizado por Fournier et al., ² demostrado en las vacas suizas y los estudios realizados por Cosandey et al. ³ y de Boss et al. ⁴ en vacas de 12 países europeos que S. aureus aislado de bovino IMI es un grupo genéticamente heterogéneo. Mediante amplificación por PCR de la región espaciadora intergénica 16S-23S rRNA (RS-PCR), un total de 17 genotipos se detectaron inicialmente en 101 aislamientos epidemiológicamen....

Protocolo

1. aislados de Staphylococcus aureus

1. Spread 10 l de S. aureus cultivo madre o una colonia crecida en un medio selectivo en placas de agar Columbia que contenían 5% de sangre de oveja (BA).
2. Incubar aeróbicamente a 37 ° C durante 18 horas a 24 horas.

2. Extracción de ADN

1. Preparar tampón TEL que contiene Tris-HCl 10 y 10 mM Na ₂ EDTA, pH 8,5. Preparar alícuotas y autoclave a 121 ° C durante 15 min.
2. Recoge 1 colonia de BA utilizando un asa estéril de plástico o un palillo de madera estéril y resuspender en 100 l TEL. Utilice tubos de 1,5 ml con tapones de ro....

Resultados

Definición de un genotipo y sus variantes

Un perfil electroforético que difieren en más de una banda de todos los genotipos identificados se considera como un nuevo genotipo. Nuevos genotipos se nombran y se extendieron acuerdo con Fournier et al. ⁵ que conduce a los genotipos de GTA a la GTZ, seguido de los genotipos GTAA a GTAZ, y GTBA a GTBZ, y al GTCA GTCC en la actualidad. Variación en sólo una banda e.......

Discusión

El paso más crítico de todo el procedimiento es cuando hay un exceso de ADN en RS-PCR (> 30 ng de ADN / ensayo puro) ^2. En general, la resolución de un perfil es óptimo si todos sus picos de inicio y fin en la línea de base. Si dos picos están demasiado juntos, la resolución es incompleta. En estas condiciones, el software Bioanalyzer puede conducir a la identificación de los picos apropiado de manera que se requiere la identificación manual.

Todos los picos visiblemente separa.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tris(hidroximetil)-aminometano	Merck	1,08382,0500	Mw = 121,14 g/mol
Titriplex III	Merck	1,08418,0250	Mw = 372,24 g/mol; La sustancia es equivalente a Na2EDTA· 2H2
O Ácido clorhídrico 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sangre de oveja	bioMé rieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalizador	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 software experto	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'Primer
G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'