genotipado de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; por Ribosómica espaciador de PCR (RS-PCR)

Resumen

Aquí, el espaciador ribosómico PCR (RS-PCR) se utiliza junto con un sistema de electroforesis miniaturizado como un método rápido y de alta resolución para el genotipado de S. aureus a costos moderados que permiten un alto rendimiento.

Resumen

El espaciador ribosómico PCR (RS-PCR) es un método de genotipado altamente resolutivo y robusto para S. aureus que permite un alto rendimiento a costos moderados y, por lo tanto, es adecuado para ser utilizado con fines rutinarios. Para obtener la mejor resolución, evaluación y gestión de datos, se requiere un sistema de electroforesis miniaturizado. Junto con un sistema de electroforesis de este tipo y el software desarrollado internamente (disponible gratuitamente aquí), la asignación del patrón de bandas a un genotipo está estandarizada y es sencilla. La extracción de ADN es sencilla (preparación por ebullición), la configuración de las reacciones es sencilla y se pueden realizar en cualquier máquina de PCR estándar. Los ciclos de PCR son comunes, excepto los tiempos prolongados de rampa y elongación. En comparación con la tipificación SPA y la tipificación de secuencias multilocus (MLST), RS-PCR no requiere secuenciación de ADN, lo que simplifica considerablemente el análisis y permite un alto rendimiento. Además, la resolución de las cepas bovinas de S. aureus es al menos tan buena como la de la tipificación en spa y mejor que la MLST o la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). La base de datos RS-PCR incluye actualmente un total de 141 genotipos y variantes. El método está altamente asociado con el patrón genético de virulencia, contagiosidad y patogenicidad de las cepas de S. aureus involucradas en la mastitis bovina. El genotipo B de S. aureus (GTB) es contagioso y causa problemas a los rebaños, causando grandes costos en Suiza y otros países europeos. Todos los demás genotipos observados en Suiza infectan a vacas individuales y cuartos. El genotipado por RS-PCR permite predecir de forma fiable el potencial epidemiológico y patogénico de S. aureus implicado en la infección intramamaria bovina (IMI), dos factores clave para la medicina veterinaria clínica. Debido a estas propiedades beneficiosas, junto con costos moderados y un alto rendimiento de muestras, el objetivo de esta publicación es proporcionar un protocolo detallado paso a paso para establecer y ejecutar fácilmente RS-PCR para el genotipado de S. aureus en otros laboratorios.

Introducción

Staphylococcus (S. aureus) se conoce como el patógeno más importante en todo el mundo responsable de la infección intramamaria (IMI) en el ganado ^1. El estudio realizado por Fournier et al., ² demostrado en las vacas suizas y los estudios realizados por Cosandey et al. ³ y de Boss et al. ⁴ en vacas de 12 países europeos que S. aureus aislado de bovino IMI es un grupo genéticamente heterogéneo. Mediante amplificación por PCR de la región espaciadora intergénica 16S-23S rRNA (RS-PCR), un total de 17 genotipos se detectaron inicialmente en 101 aislamientos epidemiológicamente independientes ^2. El genotipo B y C de genotipo (GTC) fueron más comunes (80%), mientras que los otros 15 genotipos (SMT) se produjeron en raras ocasiones, cada uno haciendo del 1 al 4% de todos los aislamientos. A nivel europeo ^3, GTB, GTC, GTF, GTI, y GTR fueron los genotipos más importantes que comprenden el 76% de todas las cepas analizadas (n = 456). GTB se encuentra en el centro de Europa wientras los otros genotipos se difundieron ampliamente. El 24% restante de las cepas incluyó 41 genotipos, muchos de ellos, sin embargo, se observaron sólo una vez.

Los estudios realizados por Fournier et al., ^2, Cosandey y col. ^3, y Graber et al. ⁵ demostraron además que los genotipos fueron altamente asociados con su patrón de genes de virulencia, así como en el suizo como a nivel europeo. Los estudios revelaron diferencias más grandes en la prevalencia entre IMI S. aureus GTB, GTC y los otros genotipos ^2,5: Teniendo en cuenta GTB, hasta el 87% de las vacas de un rebaño se infectaron por este genotipo. En el caso de GTC y de los otros genotipos, sin embargo, IMI fue sólo se encuentra en 1 a 2 vacas de un rebaño.

IMI causada por S. aureus, normalmente resulta en la inflamación de las glándulas mamarias correspondientes y un aumento de células inflamatorias en la leche. Como consecuencia de ello, la co células somáticasunts en la leche (SCC), el indicador clave de la calidad de la leche en la mayoría de los países, se incrementa dando lugar a una disminución del precio de la leche o incluso detener la entrega.

Además de la RS-PCR de Fournier et al. ^2, se han descrito otros métodos de tipificación para subtipificación cepas bovinas de S. aureus ^8-11. Dos de los más comunes incluyen la tipificación spa de ¹² y Multi Locus Secuencia Typing (MLST) ^13. El primero de ellos está basado en el ADN secuenciación de la región espaciadora variable del gen que codifica para la proteína de spa estafilocócica A, mientras que el segundo se requiere la secuenciación de los genes de limpieza 7. Esto significa que un ¹² y siete PCRs ^13, respectivamente, necesitan ser realizados, seguido de purificación amplicón, reacción de secuenciación y el análisis utilizando equipo específico. En comparación con RS-PCR, estos métodos requieren un esfuerzo adicional considerable en el laboratorio que resulta en un flujo de muestras de bajo y altos costos. losel rendimiento es especialmente baja en el PFGE. Teniendo en cuenta la resolución de estos métodos para las cepas de la especie bovina de S. aureus, RS-PCR es por lo menos tan bueno como spa escribir ⁴ y mejor que MLST ⁴ o PFGE ^15.

Todos estos métodos que incluyen la tipificación binaria ¹³ demostraron su eficacia en la obtención de una mayor comprensión de la patogénesis de la IMI bovina causada por S. aureus, pero debido a las restricciones mencionadas son menos apropiados para grandes investigaciones clínicas. Además, la genotipificación por RS-PCR como se describe por Fournier et al. ² permite la predicción fiable de la epidemiológica y el potencial patógeno de S. aureus involucrado en el IMI bovina, dos valores clave en la medicina veterinaria clínica.

Protocolo

1. aislados de Staphylococcus aureus

1. Spread 10 l de S. aureus cultivo madre o una colonia crecida en un medio selectivo en placas de agar Columbia que contenían 5% de sangre de oveja (BA).
2. Incubar aeróbicamente a 37 ° C durante 18 horas a 24 horas.

2. Extracción de ADN

1. Preparar tampón TEL que contiene Tris-HCl 10 y 10 mM Na ₂ EDTA, pH 8,5. Preparar alícuotas y autoclave a 121 ° C durante 15 min.
2. Recoge 1 colonia de BA utilizando un asa estéril de plástico o un palillo de madera estéril y resuspender en 100 l TEL. Utilice tubos de 1,5 ml con tapones de rosca.
3. Incubar a 95 ° C durante 10 min. Después, colocar las muestras inmediatamente en hielo húmedo.
4. Diluir las muestras 1: 100 en H ₂ O adecuado para PCR (= molde de ADN para la PCR). Las muestras no diluidas y diluidas pueden conservarse a -20 ° C durante 1 mes.

3. RS-PCR

1. Para cada pipeta de la muestra en un tubo de PCR 1.5 l H ₂ O, 12.5 l Taq Master Mix, 2 l de cebador G1 10 M, 2 l L1 cebador 10 mM, y 7 l de plantilla de ADN que corresponde a aproximadamente 30 ng de pura ² ADN.
2. Ejecute el siguiente programa de ciclos en un ciclador de PCR estándar: 15 min 95 ° C, seguido de 27 ciclos que comprenden 94 ° C durante 1 min, seguido de una rampa de 2 min y recocido a 55 ° C durante 7 min. Después de otros 2 min rampa, se extienden a 72 ° C durante 2 min. Terminar PCR por una extensión final a 72 ° C durante 10 min seguido de enfriamiento a 4 ° C.
   NOTA: Los productos de PCR se pueden almacenar a -20 ° C durante 5 días.
3. Para cada serie de RS-PCR incluye un control positivo, es decir, una muestra con un genotipo conocido (normalmente GTB), y un control negativo (H ₂ O).

4. Electroforesis

1. Utilice un kit de electroforesis miniaturizado comercial de ADN (kit MED) juntocon un Bioanalyzer conectado a un PC y el software instalado. Estudiar los manuales correspondientes del fabricante cuidadosamente.
2. Configurar la estación de cebado de chips y ajustar el clip de jeringa de acuerdo con el manual del fabricante.
3. Preparar la mezcla de gel colorante según el manual del fabricante.
4. Carga de la mezcla de gel colorante (de acuerdo con el manual del fabricante).
   1. Equilibrar la mezcla de gel de colorante a RT durante 30 min antes de su uso.
   2. Ponga nuevo chip de ADN en el chip de la estación de cebado. Pipeta de 9 l de gel colorante en el G. bien marcado
   3. Asegúrese de que el émbolo se posiciona a 1 ml y luego cerrar la estación de cebado de chips. Presione el émbolo hasta que se lleva a cabo por el clip de jeringa. Espere exactamente durante 30 segundos y luego suelte el clip de jeringa.
   4. Espere a 5 seg. Tire lentamente el émbolo de 1 ml posición.
   5. viruta abierta estación de cebado y pipeta de 9 l de gel colorante en ambos pozos marcados "G".
5. Carga del MArker
   1. Pipeta 5 l de marcador en los 12 pocillos de muestra y en la escalera bien. No deje ninguna de las 13 pozos vacíos.
6. Cargando la escalera y las muestras.
   1. Pipeta de 1 l de escalera de ADN a la bien marcada con el signo escalera.
   2. Pipeta de 1 l de muestra (pozos utilizados) o 1 l de agua desionizada (pocillos no utilizados).
   3. Ponga el chip horizontalmente en el adaptador y de vórtice durante 1 min a 2400 rpm.
   4. Ejecutar el chip en el Bioanalyzer dentro de 5 minutos.
7. Ejecución del análisis
   1. Iniciar el Bioanalyzer y el ordenador conectado. Abra el software.
   2. Abra la tapa de la Bioanalyzer y colocar el chip en el soporte de chip (chip encaja de una sola manera). Cierre la tapa con cuidado.
   3. En el contexto del instrumento del software seleccione "Electroforesis"> "ADN de doble cadena"> "ADN 7500". Aceptar el prefijo del archivo actual del software o modificarlo.
   4. Haga clic en el botón de inicio presente en el software. Introduzca los nombres de las muestras en el software. Una vez finalizada la ejecución de chip (después de aproximadamente 30 min) el Fin del mensaje de ejecución aparece en el software Bioanalyzer.
   5. Retirar el chip y la limpieza de los electrodos de la Bioanalyzer de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

5. Inferir el genotipo de la Reseña Electroforesis

1. Cargar el software Mahal (software está disponible gratuitamente a partir de los autores).
2. datos de referencia de importación en el software Mahal: "Archivo"> ​​"Importar datos de referencia"
3. Abra la electroforesis ejecutarse en el contexto de datos del software Bioanalyzer. Seleccionar un perfil de electroforesis de una muestra.
4. Compruebe si los picos relevantes.
   1. Utilice el software Mahal para comprobar si los picos relevantes: "Herramientas"> "media de fluorescencia". Insertar en el cuadro de la "fluorescencia"los valores de fluorescencia indican como unidades de fluorescencia (FU), ya que se pueden leer desde el software Bioanalyzer. Inserte los 4 (3) con picos de fluorescencia más elevada en orden ascendente y separados por comas. Ejemplo: 126 130 132 137.
      NOTA: Si no todos estos picos FU se indican mediante el software Bioanalyzer, tienen que ser estimado por la lectura de estas naciones de la trama.
5. Presione el botón "Calcular". Un pico es relevante si la fluorescencia observado es superior al valor indicado en el cuadro de "pico de altura mínima".
6. Inferir el genotipo.
   1. Insertar en los Mahal cuadro de texto "Picos de entrada (pb)" a los tamaños en pares de bases de todos los picos pertinentes en orden ascendente y separados por comas. Ejemplo: 440.462.519.579.637.
      NOTA: Si no todos estos tamaños máximos se indican mediante el software Bioanalyzer, tienen que ser estimado por la lectura de estas naciones de la trama.
7. Presione el botón "Calcular".
8. En la listacaja, buscar la mínima distancia de Mahalanobis al cuadrado "d2m". Si el valor de P correspondiente derecho a es ≥0.05 entonces la probabilidad es ≥5% de que la hipótesis nula H ₀ se rechaza (H _0: el observado y el perfil de referencia son idénticos), que significa que el perfil observado se acepta ser idéntica a el perfil de referencia del genotipo indicada.
9. Si d2m es mínimo, pero el campo del valor P correspondiente está vacía, rechazar H ₀ con una probabilidad <5%.
   NOTA: Esto significa que los perfiles son desiguales aunque d2m es mínima. Tal resultado puede ser el resultado de condiciones que no sean promedio de electroforesis.
   1. Para corregir estas desviaciones, insertar en el cuadro de texto "Observado Pico (pb)" el ​​valor 395 y pulse el botón "Calcular". Revisar una vez más d2m mínimo y un valor de p correspondiente ≥0.05. Si no tiene éxito, trate de los valores 405, 415, y 425.
      NOTA: A veces pasos más pequeños son aúnindicado. Si todavía no tiene éxito, el perfil observado no está presente en los datos de referencia, puede ser un nuevo genotipo o variante.
10. Varios perfiles
    1. Repita los pasos 5.6 a 5.9 para cada perfil de electroforesis por separado.

Resultados

Definición de un genotipo y sus variantes

Un perfil electroforético que difieren en más de una banda de todos los genotipos identificados se considera como un nuevo genotipo. Nuevos genotipos se nombran y se extendieron acuerdo con Fournier et al. ⁵ que conduce a los genotipos de GTA a la GTZ, seguido de los genotipos GTAA a GTAZ, y GTBA a GTBZ, y al GTCA GTCC en la actualidad. Variación en sólo una banda e...

Discusión

El paso más crítico de todo el procedimiento es cuando hay un exceso de ADN en RS-PCR (> 30 ng de ADN / ensayo puro) ^2. En general, la resolución de un perfil es óptimo si todos sus picos de inicio y fin en la línea de base. Si dos picos están demasiado juntos, la resolución es incompleta. En estas condiciones, el software Bioanalyzer puede conducir a la identificación de los picos apropiado de manera que se requiere la identificación manual.

Todos los picos visiblemente separa...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tris(hidroximetil)-aminometano	Merck	1,08382,0500	Mw = 121,14 g/mol
Titriplex III	Merck	1,08418,0250	Mw = 372,24 g/mol; La sustancia es equivalente a Na2EDTA· 2H2
O Ácido clorhídrico 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sangre de oveja	bioMé rieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalizador	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 software experto	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'Primer
G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'