Este manuscrito proporciona una descripción de la metodología utilizada para establecer modelos de ratón de transducción-trasplante. Se da cuenta detallada de los errores técnicos que se deben evitar al realizar trasplantes de médula ósea. Se debe obtener una comprensión clara de la importancia del título viral alto, la transfección/transducción y la irradiación.
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Artículo de método
Transducción-Trasplante modelo de ratón de Neoplasias mieloproliferativas
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Resumen
Resumen
La transducción-trasplante es una forma rápida y eficiente de modelar neoplasias hematológicas humanas en ratones. Esta técnica da como resultado la expresión del gen de interés en las células hematopoyéticas y se puede utilizar para estudiar el papel del gen en la hematopoyesis normal y/o maligna. Este protocolo proporciona una descripción detallada de cómo realizar la transducción-trasplante utilizando mutaciones de calreticulina (CALR) identificadas recientemente en la neoplasia mieloproliferativa (NMP) como ejemplo. En este protocolo, las células de médula ósea completa de ratones donantes tratados con 5-flurouracil (5-FU) se transducen con un retrovirus que codifica CALR mutante y se trasplantan a huéspedes singénicos irradiados letalmente. Las células del donante que expresan CALR mutante se marcan con proteína fluorescente verde (GFP). Los ratones trasplantados desarrollan un fenotipo MPN que incluye plaquetas elevadas en la sangre periférica, expansión de megacariocitos en la médula ósea y fibrosis de la médula ósea. Proporcionamos una descripción paso a paso de cómo generar retrovirus, calcular el título viral, transducir células de médula ósea completa y trasplantarlas a ratones receptores irradiados.
Introducción
Transducción-trasplante es un método útil para modelar neoplasias hematológicas en ratones. Esta técnica ha sido particularmente valiosa para el estudio de las neoplasias mieloides que se remontan a la primera demostración de que la expresión ectópica de BCR-ABL1 podría recapitular fielmente la leucemia mielógena crónica en ratones 1. Esta técnica ha facilitado posteriormente el amplio estudio de JAK2 V617F y MPL W515K / L mutado neoplasias mieloproliferativas (MPN).
NMP son un grupo de neoplasias malignas hematológicas caracterizadas por la sobreproducción de células mieloides maduras y fibrosis de la méd....
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Protocolo
Este estudio fue aprobado y llevado a cabo de acuerdo con las recomendaciones del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de California, Irvine. Todos los procedimientos se realizaron bajo anestesia con isoflurano y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
1. Generación de Ecotropic Retrovirus
- Preparar plásmidos de alta calidad con una concentración de al menos 1 g / l usando un kit maxi-prep comercial o la purificación de cloruro de cesio.
NOTA: Estos incluyen un vector de MSCV columna vertebral que codifica el gen de interés (en este caso CALR 7,8) y marcador de ....
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Resultados
La técnica de transducción-trasplante resulta en la reconstitución hematopoyética de los ratones receptores con células que expresan el gen de interés. La Figura 1 muestra una visión general del modelo de ratón de transducción-trasplante de calreticulin mutado MPN. Brevemente, retrovirus que expresan CALRwt o CALRdel52 se utiliza para infectar las células BM a partir de un ratón donante C57B / 6. Las células transducidas se trasplantan en irradiado C57B / 6 ratón recepto.......
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Discusión
Este protocolo proporciona una descripción detallada de cómo llevar a cabo trasplantes de médula ósea en ratones recapitular una enfermedad esencial trombocitemia-como con la progresión de la mielofibrosis con CALRdel52 mutación como el conductor de la enfermedad. el éxito del trasplante de células que expresan los resultados CALRdel52 en un aumento de las plaquetas, la expansión de megacariocitos, y fibrosis de la médula ósea. A medida que el trasplante de médula ósea es un proceso de varios pasos, es importante recono.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo cuenta con el apoyo de la V Foundation Scholar (AGF) y la MPN Research Foundation (AGF).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T células | ATCC | CRL-11268 | |
| células 3T3 | ATCC | CRL-1658 | |
| Plásmidos | |||
| EcoPak, también conocido como pCL-Eco | Addgene | 12371 | Las líneas celulares de empaquetamiento retroviral, como EcoPack 2-293, se pueden usar en lugar del plásmido EcoPak y las células 293T estándar. Hay disponibles plásmidos adicionales de envoltura y empaquetamiento de γ-retrovirus en Addgene y otros. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG)Addgene | 20672 | disponibles plásmidos de transferencia γ-retroviral adicionales de Addgene y otros. | |
| Consumibles | |||
| 27 G x 1/2" agujas | BD | 305620 | |
| Suero fetal bovino | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicilina/estreptomicina/L-glutamina | Corning | MT-30-009-CI | |
| Tripsina-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Puede ser PBS casero |
| Corning | MT-21-031-CV | ||
| Platos de 10 cm | Fisher | 172931 | |
| tubos cónicos de 15 ml | Fisher | 12565268 | |
| platos de 60 mm | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher NC9840454 | ||
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100 µ Fisher | 22363549 | ||
| Tubos cónicos de 50 ml | Fisher | 12565270 | |
| placa de 6 pocillos | Fisher | 130184 | |
| Tubos FACS | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45 μ m filtros de jeringa | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK tampón | Lonza | 10-548E | Se puede hacer en casa |
| Recombinante murino IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinante murino IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Murino recombinante SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 Reactivo de transfección | |
| Tubos de centrífuga de 1,5 ml | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Equipment | |||
| BD Accuri C6 | |||
| Irradiador |
Referencias
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
- Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G.
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Reimpresiones y permisos
