Ensayos para estudiar el rol de vitronectina en la adhesión bacteriana y resistencia de suero

Resumen

Este informe describe los protocolos para la caracterización de las interacciones entre proteínas de membrana externa bacteriana y la vitronectina de regulador del complemento humano. Los protocolos pueden utilizarse para estudiar las reacciones de enlace y función biológica de vitronectina en cualquier especie bacteriana.

Resumen

Las bacterias utilizan reguladores del complemento como un medio de evadir la respuesta inmune del huésped. Aquí, describimos protocolos para la evaluación de la adquisición de vitronectina de papel en los juegos de célula bacteriana superficial en la resistencia al sistema inmune anfitrión. Experimentos de citometría de flujo identifican vitronectina de plasma humano como un ligando de la proteína de membrana externa bacteriana del receptor H de Haemophilus influenzae tipo f. Un análisis enzima-ligado del inmunosorbente era empleado para caracterizar las interacciones proteína-proteína entre proteínas recombinantes purificadas H y vitronectina y atar afinidad se evaluó mediante interferometría de la bio-capa. La importancia biológica de la Unión de la vitronectina a H la proteína en la superficie de la célula bacteriana en evasión de la respuesta inmune del huésped fue confirmada usando una prueba de resistencia de suero con suero humano normal y vitronectina-agotado. La importancia de la vitronectina en la adhesión bacteriana se analizó utilizando portaobjetos de vidrio con y sin recubrimiento de vitronectina, seguido de la tinción de Gram. Por último, se investigó la adherencia bacteriana a las monocapas de células epiteliales alveolares humanas. Los protocolos descritos aquí pueden adaptarse fácilmente al estudio de cualquier especies bacterianas de interés.

Introducción

Vitronectina (Vn) es una importante glucoproteína humana implicados en el mantenimiento de la homeostasis a través de la regulación del sistema fibrinolítico. VN también funciona como un regulador del complemento mediante la inhibición de la vía del complemento terminal durante la formación de complejos de C5b6-7 y la polimerización de C9. Varios patógenos bacterianos se han demostrado para reclutar Vn a la superficie celular como medio de resistencia complemento deposición^1,2,3. Además, Vn funciona como una molécula "sandwich" entre bacterias y receptores de las células epit....

Protocolo

1. Análisis de Vn como un ligando de la proteína bacteriana de la superficie

1. Detección de Vn-atascamiento en la superficie bacteriana mediante citometría de flujo
   Nota: En citometría de flujo, utilizamos lado dispersión y dispersión hacia delante para puerta de sucesos positivos. Para examinar las interacciones con Vn, Hif clínico aislados (n = 10) fueron seleccionados⁷ junto con e. coli BL21 (DE3) como control negativo (figura 1A).
   1. Cultura Hif clínico aislados de cerebro corazón infusión (BHI) suplementado con 10 μg/mL NAD y hemina a 37 ° C con agita....

Resultados

VN-Unión a la superficie de las bacterias fue determinada por citometría de flujo. Hif todos los aislados clínicos probados en este estudio reclutó a Vn a la superficie de la célula. Se observó ninguna interacción de Vn con la superficie de la célula para la cepa de control negativo e. coli (figura 1A). Como se muestra en la figura 1B, el PH es una importante proteína Vn en la superficie.......

Discusión

Patógenos bacterianos reclutan Vn a la superficie de la célula y utilizan este regulador complemento para evitar la deposición de los factores de complemento y completar el complejo de ataque de membrana². VN también funciona como una molécula puente entre proteínas de la superficie bacterianas y receptores de superficie celular host, permitiendo así que los patógenos se adhieren a la superficie de las células epiteliales y posteriormente median internacionalización. En este estudio, se describen .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Termomezclador de 1,5	mL Eppendorf	5355	agitador de calentamiento y enfriamiento de bloque seco
mL de poliestireno tubo de fondo redondo	BD Falcon	60819-138	12 × 75 mm estilo
5% CO2 incubadora suministrada	Thermo Scientific
Tubo de poliestireno de fondo redondo de 6 mL	VWR	89000-478	12 × 75 mm estilo con tapón
Placas de 24 pocillos	BD Falcon	08-772-1H	Grado de cultivo celular
30% Peróxido de hidrógeno (H2O2)	Sigma-Aldrich	H1009-100ML	Grado de análisis de laboratorio
75 cm2 matraz de cultivo de tejidos	BD Falcon	BD353136	Vented
Placa de fondo plano negro de 96 pocillos	Greiner Bio-One	655090	Cultivo de tejidos tratado y micro; Placas negras transparentes
A549 Línea celular humana	Sigma-Aldrich	86012804-1VL
Enzima de desprendimiento de células (Accutase)	Sigma-Aldrich	A6964-500ML
Sensores AR2G	Pall Life Science	18-5095	Sensor para proteína inmovilizada por acoplamiento de aminoácidos
Acetona	VWR	97064-786 Grado de	análisis
Albúminas séricas bovinas (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	Adecuado para cultivo celular
Papel bibuloso	VWR	28511-007
Interferómetro biocapa	Pall Life Science	FB-50258 Equipo de	medición de interferometría bicapa
Solución violeta cristalina	Sigma-Aldrich	HT90132-1L
C4BP (proteína de unión C4b)	Complement Technology, Inc.	A109	Comprado como forma líquida congelada
Cloruro de calcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670-500G
Solución de carbol-fucsina	Sigma-Aldrich	HT8018-250ML
Ácido cítrico	Sigma-Aldrich	251275-500G	Grado de la American Chemical Society (ACS)
Solución decolorante	Sigma-Aldrich	75482-250ML-F
E. coli huésped (E. coli BL21)	Novagen	69450-3	Expresión de proteínas huésped
F12 medio	Sigma-Aldrich	D6421	Citómetro
	BD Biosciences	651154	Grado de análisis celular para aplicaciones de investigación
Suero fetal de ternera (FCS)	Sigma-Aldrich	12003C	Adecuado para cultivo celular
Suero humano normal (NHS)	Complement Technology, Inc.	NHS	Suero humano agrupado
FITC-conjugado burro anti-ovejas anti-ovejas	AbD Serotec	STAR88F	Gentamicina policlonal
	Sigma-Aldrich	G1397	Grado de cultivo celular
Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
Gelatina	Sigma-Aldrich	G9391	Adecuado para cultivo celular
Hemotómetro	Marienfeld	640210
HRP-conjugado anti-His tag anticuerpos	Abcam	ab1269	policlonal
complemento del factor humano H	, Inc.	A137	Comprado como líquido congelado de
C4BP	Complement Technology, Inc.	A109	Solución congelada
Albúmina sérica humana	Sigma-Aldrich	A1653-10G	polvo liofilizado
Columna de resina de afinidad con histidina (HisTrap HP)	GE Health Care Life Science	17-5247-01	Columnas preempaquetadas con Ni Sepharose
PH marcado con His			Recombinante expresado y purificado en nuestro laboratorio
Solución de yodo	Sigma-Aldrich	HT902-8FOZ
Metanol	VWR	BDH1135-1LP	Grado de análisis
Microscopio	Olympus	IX73	Microscopio invertido Portaobjetos
de microscopio	Sigma-Aldrich	S8902	liso, tamaño 25 mm y 75 mm
Cloruro de magnesio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266-1KG
Plásmido que contiene C terminal 6x His-tag en la columna vertebral (pET26(b)	)Novagen	69862-3	DNA vector
Polysorb microtitulación placas	Sigma-Aldrich	M9410	para ELISA
Hidróxido de potasio (KOH)	Sigma-Aldrich	6009	Chemical Society (ACS)
grado Anticuerpos Vn antihumanos para ovejas	AbD Serotec	AHP396	Agitador policlonal
	Stuart Scientific	STR6	Agitador
de plataforma Matraz de cultivo de tejidos	BD Falcon	3175167	75 cm2
Termomezclador	Sigma-Aldrich	T3317	Agitador de calentamiento y enfriamiento de bloque seco
Tetrametilbencidina	Sigma-Aldrich	860336-100MG	Grado ELISA
Vitronectina (Vn) de plasma humano	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	grado de cultivo celular

5 BBD6220 de grado de cultivo celular de flujo de grado de cultivo celular Tecnología del American