Administración sostenida de mitógenos de células β de los islotes intactos mouse<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso Biodegradable poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas

Resumen

Aquí, presentamos una metodología para generar y administrar microesferas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) cargadas de interés a islotes de ratón intactos en cultivo con el posterior análisis de inmunofluorescencia de la proliferación de células β. Este método es adecuado para determinar la eficacia de los mitógenos candidatos a β células.

Resumen

El desarrollo de biomateriales ha aumentado significativamente el potencial para la entrega dirigida de fármacos a una variedad de tipos de células y tejidos, incluyendo las células ß pancreáticas. Además, las partículas de biomateriales, hidrogeles, andamios y también proporcionan una oportunidad única para administrar sostenida, la administración de fármacos controlable para ß-células en cultivo y en modelos de tejidos trasplantados. Estas tecnologías permiten el estudio de los factores de proliferación de células β candidato utilizando islotes intactos, así como un sistema de traslación correspondiente. Por otra parte, la determinación de la eficacia y la viabilidad de los factores de candidatos para estimular la proliferación de las células β en un sistema de cultivo es fundamental antes de seguir adelante con los modelos in vivo. Aquí se describe un método para co-cultivo de islotes de ratón intactas con el compuesto biodegradable de interés (CDI) poli RESORTE (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) con el fin de evaluar los efectos de la liberación sostenida in situ ofactores mitogénicos f sobre la proliferación de las células β. Esta técnica se describe en detalle cómo generar microesferas de PLGA que contienen una carga deseada usando reactivos disponibles comercialmente. Mientras que la técnica descrita utiliza el factor recombinante humano de crecimiento de tejido (rhCTGF) como un ejemplo, fácilmente se podría utilizar una amplia variedad de COI. Además, este método utiliza placas de 96 pocillos para reducir al mínimo la cantidad de reactivos necesarios para evaluar la proliferación de células β. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para utilizar biomateriales alternativos y otras características de las células endocrinas, tales como la supervivencia celular y el estado de diferenciación.

Introducción

células ß pancreáticas son las únicas células productoras de insulina en el cuerpo y son críticos para mantener la homeostasis de glucosa en sangre. Mientras que los individuos sanos tienen suficiente masa de células β y la función de regular adecuadamente la glucosa en sangre, las personas con diabetes se caracteriza por la masa de células β insuficiente y / o función ^1,2. Se ha propuesto que la inducción de la proliferación de células β última instancia, puede aumentar la masa de células β y restaurar la homeostasis de la glucosa en individuos con diabetes ^3. Sin embargo, la evaluación y validación de los posibles compuestos de proliferación d....

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados y realizados de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional Vanderbilt.

1. El etiquetado con fluoróforo COI (Opcional)

1. Elija un colorante fluorescente que reaccionará con una amina primaria libre (por ejemplo, en una proteína), tales como ésteres de succinimidilo o derivados de fluoresceína, para visualizar la carga de las microesferas. Disolver exceso molar 8x (con relación a moles de COI) de fluoróforo en 200 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO).
2. Resuspender 50 mg de COI hasta un volumen final de 800 l en una solución de vehículo (concentración fin....

Resultados

La Figura 1 es una representación visual de las microesferas generadas utilizando el protocolo anterior. El protocolo descrito aquí produce microesferas cargadas con rhCTGF de varios tamaños. La mayor fracción de microesferas estará entre 1 y 10 micras de diámetro, aunque algunas microesferas pueden ser más grandes (Figura 2). Si se desea, el tamaño de las microesferas se puede ajustar y optimizado sobre la base de parámetros de fabricac.......

Discusión

El estudio de la proliferación de células β en cultivo típicamente se ve obstaculizada por varias dificultades. En primer lugar, las líneas de células inmortalizadas β se caracterizan por grados más altos de proliferación de lo que se encuentra en las células beta en los islotes endógenos en vivo. Además, estas líneas celulares inmortalizadas carecen de la arquitectura normal crítico para la función de las células β normal. Estos dos hechos hacen que sea difícil determinar si los resultados obtenidos usando líneas de cé.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Verde Oregón 488 Ácido carboxílico, éster succinimidílico, 6 isómeros	ThermoFisher Scientific	O6149	Para el etiquetado de COI con fluoróforo
DMSO Dimethyl Sulfóxido Fisher	BioReagents	BP231-1	Para disolver fluoróforo en el paso 1
Columnas de desalinización PD-10 desechables GE	Healthcare	17-0851-01	Columna de desalinización utilizada en el paso 1
Resomer RG 505, Poli(D,L-lactida-co-glicólido), terminado en éster, peso molecular 54.000 - 69.000	Sigma-Aldrich	739960	Utilizado en la generación de microesferas en el paso 2
Peso molecular de poli(alcohol vinílico) 89.000 - 98.000	Sigma-Aldrich		341584 Utilizado en la generación de microesferas en el paso 2
RPMI 1640	Thermo Scientific	11879-020	Para el cultivo de islotes
Dextrosa Anhidra	Fisher BioReagents	200-075-1	Suplemento para medios de islotes
Penicilina-Estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4333	Antibióticos para medios de islotes
Suero normal de caballo	Jackson ImmunoResearch	008-000-121	Suplemento para medios de islotes
placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos	Corning	3603	Para el cultivo de islotes
Etileno glico-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético	Sigma-Aldrich	E4378	Suplemento para medios de islotes previos al ensayo
Cytospin 4 Citocentrífuga	Thermo Scientific A78300003		Para hacer girar células en portaobjetos de microscopio
EZ Single Cytofunnel	Thermo Scientific A78710020		Para hacer girar células en portaobjetos de microscopio
Ácido etilendiaminotetraacético	Fisher BioReagents	BP118-500	Utilizado en la disociación de islotes
paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6148	Para la fijación de células
Triton  X-100	Fisher BioReagents	BP151	Para permeabilizar células
Suero de burro normal	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Reactivos bloqueantes para inmunofluorescencia
Anticuerpo anti-Ki67	ABCAM	AB15580	Para inmunofluorescencia Ki67
Conejillo de indias policlonal Anti-Insulina	Dako	A0564	Para inmunofluorescencia de insulina
Cy3 AffiniPure Burro Anti-Conejo	Jackson ImmunoResearch	711-165-152	Para Ki67 inmunofluorescencia
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig	Jackson ImmunoResearch	706-175-148	Para inmunofluorescencia de insulina
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)	ThermoFisher Scientific	D1306	Para la visualización de núcleos en inmunofluorescencia
Aqua-Mount	Lerner Laboratories	13800	Medios de montaje de secado rápido
FreeZone -105 ° C 4.5 Litros Cascade Standtop Liofilizar Sistema de liofilización	Labconco	7382020	Para la liofilización de microesferas