Caracterizar el transporte de electrones a través de Biofilms de vida

Resumen

Se presenta un protocolo para la medición de conductividad eléctrica de biofilms microbianos vivos en condiciones fisiológicamente relevantes.

Resumen

Aquí se demuestra el método de bloquear electroquímico utilizado para caracterizar la conductividad eléctrica de biofilms microbianos electrodo crecido en condiciones fisiológicamente relevantes. ¹ estas mediciones se realizan en vida biofilms en medio acuoso utilizando fuente y drenan electrodos en una superficie de vidrio en una configuración especializada que se refiere a como una matriz de electrodos interdigitados (IDA). Una biopelícula se cultiva que se extiende a través de la brecha que conecta la fuente y drenaje. Potenciales se aplicación a los electrodos (E_S y E_D) generando una corriente de drenaje de la fuente (I_SD) a través de la biopelícula entre los electrodos. La dependencia de la conductividad eléctrica en potencial de la puerta (la media de los potenciales de fuente y drenaje, E_G = [a_D E_S] / 2) se determina sistemáticamente cambiar la puerta potencial y midiendo la fuente resultante de cerebros actual. La dependencia de la conductividad en la puerta de posibles informaciones mecanicista sobre el proceso de transporte de electrones extracelular subyacente a la conductividad eléctrica de la biopelícula específica bajo investigación. El método electroquímico de medición bloquea aquí descrito se basa en que utilizada por M. S. Wrighton^2,3 y R. W. Murray^4,5,6 y colegas, colegas de 1980 s para investigar polímeros conductores de película delgada.

Introducción

Transporte de electrones extracelular (EET) es un proceso que permite a ciertos microorganismos para el transporte de electrones entre los procesos metabólicos intracelulares y aceptadores del electrón insoluble o donantes que residen fuera de la célula, que van desde minerales naturales a electrodos. En algunos casos, EET permite microorganismos formar eléctricamente conductores múltiples de la célula densamente biofilms en la superficie de los electrodos, en el que células no en contacto directo con el electrodo pueden todavía utilizarlo como aceptor de electrones metabólica o donante. Hay interés considerable en tales biofilms como catalizadores de electrodos para aplicaciones diversas, como microbiana electrosíntesis, contaminante de detección/eliminación y generación de energía remota y almacenamiento,^{7,8,9 ,10,11,12,13,14} debido a la diversidad de los procesos metabólicos de microorganismos y la durabilidad de los biofilms microbianos en comparación con a base de enzima bioelectrodes. ^{15 , 16} además, caminos EET pueden utilizarse potencialmente para eléctricamente control o señal de cambios en forma natural o genéticamente modificados procesos metabólicos microbianos implicados, por ejemplo, en la producción de un producto o la detección de un analito target o estímulo. La conductividad eléctrica de electrocatalítica biofilms, que les distingue de otros materiales biológicos, es un aspecto central de sus propiedades electrocatalítica, pero poco se entiende sobre el proceso subyacente de la EET en el entorno del electrodo, y lo que se conoce es altamente controvertido. ^{17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24}

Se describe aquí es un método de 2 electrodos para medir conductividad a través de la vida, crecido por el electrodo biopelículas usando arrays de electrodos interdigitados (ida). Ida consisten en paralelo electrodos rectangulares con dibujos en la superficie de vidrio plano que cada otra banda está conectado en lados opuestos de la matriz resultante en 2 electrodos (fuente y dren). Examen cuidadoso de una IDA (ver por ejemplo, figura 6.12b de ref #1) revela que las brechas que separan bandas adyacentes son también conectados de tal manera que forma un solo boquete que teje hacia adelante y hacia atrás a través de la matriz que separa los dos electrodos. El resultado es un espacio largo y estrecho separando los electrodos de la fuente y dren, rendimiento muy alto fuente-drenan corrientes cuando un material conductor es formado, fundido, polimerizado o crecido (en el caso del tipo de biofilms considerados aquí) en la matriz. Además, el pequeño tamaño de los electrodos resulta pequeño fondo actual debido a la capacitancia de carga y cambiar en estado de oxidación del material conductor con cambio de puerta posible, ya que la cantidad de material necesario para hacer de conductividad mediciones con IDAs son tan pequeñas. La técnica de IDA gating electroquímico descrito aquí, desarrollado para caracterizar polímeros conductores de película fina,^2,3,4,25 sólo recientemente se ha aplicado a los sistemas vivos. ¹⁸ otra técnica utilizada para medir la conductividad de los biofilms de vida utiliza un gran formato split electrodos fuente y dren y fuente metros para fijar la puerta potencial. ^{26 , 27} sin embargo, la preocupación de estos métodos ha sido detallada anteriormente. ¹⁸

El siguiente protocolo encapsula nuestra experiencia con realizar medidas de conductividad de vida Geobacter sulfurreducens y biocathode MCL biofilms. G. sulfurreducens es un electrodo modelo reduce organismo capaz de utilizar materiales insolubles, incluyendo electrodos, como el aceptador del electrón metabólica única. Además, forma biofilms gruesos que son capaces de transportar electrones en múltiples longitudes de célula, lo que es un organismo modelo para estudiar la transferencia de electrones extracelular larga distancia anódica. También se incluye información para el estudio de biocathode MCL, un biofilm comunidad mixta aeróbica, autótrofos aislado del cátodo de una célula de combustible microbiana béntica. Biocathode MCL (llamado así por los tres componentes primarios – Marinobacter, Chromatiaceaea y Labrenzia) es capaz de oxidar un electrodo como su donante del electrón único y transportar electrones en múltiples longitudes de célula, haciendo es un interesante sistema catódico para estudiar. Además, biocathode MCL tiene la más alta conductividad reportada para un sistema de vida hasta la fecha utilizando estos métodos. La inclusión de estos biofilms diversos electroactivas en este protocolo se pretende resaltar que esta técnica es aplicable para medir el transporte de electrones a través de cualquier biofilm viva capaz de interactuar eléctricamente con electrodos.

Protocolo

1. preparación de microelectrodo interdigitados arsenal (IDA)

1. Obtener IDA comercialmente disponible electrodos patrón sobre un sustrato no conductor o sintetizar usando métodos estándar de litografía. ²⁸
   Nota: Dimensiones de IDA o materiales pueden variar basado en las condiciones deseadas para diversos experimentos. IDAs utilizan aquí fueron obtenidos comercialmente y consistió en dos microelectrodos oro interdigitados en un sustrato de vidrio conectado a electrodos grandes en los extremos opuestos de la matriz. Los electrodos están expuestos mientras que las líneas de autobús conectan los electrodos a las almohadillas de contacto grandes están recubiertas con material aislante fino. IDAs utilizan aquí están compuestos por dos conjuntos de 10 μm de ancho y 2 mm microelectrodo largo oro bandas (fuente y dren) espacian aparte 5 μm en una superficie de vidrio plano. IDAs utilizan aquí tenía 65 pares de electrodo (130 bandas interdigitados total). Bandas alternas están conectadas a electrodos en los extremos opuestos de la matriz.
2. Cable y aisle IDA
   1. Conecte un cable a cada almohadilla de electrodo grande con epoxi conductivo.
      1. Preparar conductor epoxi según instrucciones del fabricante para el epoxi específico en uso con una boquilla mezcladora, varilla o pipeta (las instrucciones pueden variar según el fabricante).
      2. Coloque un cable en cada plataforma de oro, seguro en su lugar con cinta de laboratorio. Cubra el alambre y el cojín con epoxi, utilizando una boquilla mezcladora, varilla o pipeta.
      3. Cuidadosamente hacia un horno de 80 ° C por 1 h a cura o curación basada en las recomendaciones del fabricante para el específico conductora epoxi utilizado.
      4. Después de que el epoxi cura, use un multímetro para asegurar la conexión eléctrica entre el extremo del cable y las almohadillas. La resistencia entre el alambre y la almohadilla debe ser < 5 Ω. También, utilice el multímetro para verificar que no epoxy conductivo es conectar múltiples electrodos, como esto puede corta la matriz. Si epoxi conductora es conectar múltiples contactos, utilice a un escribano para aislar los conductores.
   2. Aísle la conexión con cubriendo la conexión con una térmica, eléctrica y aislante impermeable. Resinas de poliuretano ignífugas a menudo son adecuadas.
      1. Quite la punta de un tubo de centrífuga cónico de 15 mL (en aproximadamente la marca de 2,5 mL) como molde para el material aislante. Hacer dos agujeros pequeños en la parte inferior de los cables que salgan con una aguja de 21g.
      2. Inserte a la IDA en el molde y los cables por los agujeros en el fondo del molde.
      3. Preparar el material de aislamiento específico. Siga las instrucciones proporcionadas con la resina específica obtenida.
      4. Pipeta el aislante en el molde para que el epoxi es totalmente cubierto (~2.5 mL) y deje que se seque según las especificaciones del fabricante.

2. configuración del reactor electroquímica, pruebas y la inoculación

1. Configurar la celda electroquímica.
   1. Inserte IDA, contra electrodo y electrodo de referencia de la celda electroquímica.
      Nota: El reactor electroquímico utilizado puede variar ampliamente, como todos los electrodos caben dentro. Una consideración es que el electrodo de referencia debe estar lo más cerca posible al electrodo de trabajo los límites prácticos del reactor. Aquí, utilizamos un reactor de cámara única con la referencia electrodo ~ 2-3 cm de los electrodos de trabajo. También, el electrodo del contador debe ser mayor que el electrodo de trabajo para asegurar que no es limitante en el sistema.
   2. Si trabaja con un cultivo puro, esterilizar el reactor con el contraelectrodo dentro. Esterilizar el electrodo de referencia remojando en cloro por 10 minutos y agua desionizada estéril para 10 minutos esterilización la IDA por inmersión en lejía para 5 s seguido de agua desionizada estéril para 10 s antes de la inserción en el reactor.
   3. Llenar la celda electroquímica con medio estéril adecuado para el crecimiento de biopelícula. Para g. sulfurreducens^17,18, usar agua dulce medio excluyendo fumarato. Para biocathode MCL,⁹ uso medio de agua de mar artificial. ⁹
   4. Conecte los electrodos a un bipotenciostato. Conecte un electrodo de IDA al trabajo plomo 1, el otro electrodo de IDA al trabajo plomo 2, el electrodo de referencia a la iniciativa de referencia y el electrodo contra el mostrador.
2. Pruebas electroquímicas de ida.
   Nota: El principal objetivo de esta prueba es para asegurarse de que los dos electrodos están aislados eléctricamente. Todas las técnicas electroquímicas están disponibles en el software utilizado para controlar el bipotenciostato.
   1. Realizar pruebas de conductividad de control (antes de crecimiento del biofilm) para garantizar el correcto funcionamiento de IDA con un bipotenciostato.
      1. Medida del potencial de circuito abierto de cada electrodo durante 1 minuto.
         Nota: En algunos instrumentos, circuito abierto potencial debe lograrse con el programa de colección de caracterización y ajuste la corriente a 0 mA.
      2. Medida del potencial de circuito abierto de electrodo 2 desempeño de voltametría cíclica sobre el electrodo 1 entre + 0,2 V a +0.6 V (contra ella) a 20 mV/s.
         Nota: Otros límites y tarifas de exploración para el CV pueden utilizar si se desea. Sin embargo, evitar potenciales que se traducirá en la generación de hidrógeno o el oxígeno.
      3. Verificar que el potencial de circuito abierto medido al electrodo 2 no reflejan el potencial de electrodo 1 durante el CV mediante el software de potenciostato.
         Nota: El potencial de circuito abierto del electrodo 2 de puede cambiar, pero debe ser independiente del potencial de electrodo 1.
      4. Repita los pasos 2.2.1.1 por 2.2.1.3 excepto el control del potencial de electrodo 2 y medir el potencial de circuito abierto del electrodo 1.
   2. Establecer el potencial de los electrodos de trabajo en el potencial de crecimiento deseado del biofilm electroactivos pertinentes utilizando el software de bipotenciostato. Por ejemplo, utilizar + 0,5 V (contra ella) de Geobacter sulfurreducens o +0.31 V (contra ella) para biocathode MCL.
3. Crecimiento relevantes electroactivos biofilm
   1. Inocular el reactor electroquímico de un cultura/enriquecimiento común de los microorganismos electroquímicamente activos deseados usando técnicas microbiológicas asépticas estándar. Para las pruebas estándar, inocular en una 1:20 relación (inóculo al volumen del reactor) de un OD₆₀₀ = 0,5 cultura.
   2. Establecer la agitación en el reactor el nivel deseado (~ 200 rpm) y la incubadora / baño de agua a la temperatura deseada en base a las condiciones de crecimiento del biofilm de interés. Para g. sulfurreducens, utilice 30 ° C para un crecimiento óptimo.
   3. Incubar el sistema basado en necesidades específicas de los microorganismos de interés hasta que el biofilm puentes la brecha que separa los dos electrodos. Para inmóvil g. sulfurreducens biofilm, incubar ~ 7-10 días. Para biocathode MCL, incubar ~ 7 días. En cada caso, controlar la temperatura a 30 ° C.

3. electroquímicos experimentos bloquea

1. Seleccione los parámetros experimentales que se utilizará para determinar la dependencia del potencial de la corriente para las mediciones bloquea.
   1. Determinar el rango de potenciales de puerta que se aplicará a la AIF para obtener la corriente conducida (I_SD) versus la curva (E_G) puerta para el sistema.
      Nota: El rango de potenciales de puerta examinado debe cubrir todos los potenciales con actividad redox posible. Si no hay información sobre el sistema de interés disponible, una gama amplia de potencial debe ser usado (-0.55 a +0.6 V contra ella). Un enfoque de ensayo y error puede utilizarse para ajustar la gama basada en el sistema bajo estudio. Puerta de potencial se define como:
      
      donde E_D es el potencial del electrodo de descarga y E_S es el potencial del electrodo de fuente. La gama de potenciales de puerta utilizado está limitada por los requisitos y limitaciones del sistema específico de interés. ¹⁸
      Nota: Fuente y dren potenciales que dará lugar a la evolución del oxígeno y el hidrógeno deben evitarse ya que estos procesos pueden dañar el biofilm.
   2. Determinar el voltaje drenaje fuente (V_SD) que se utilizará como la fuerza impulsora para el transporte de electrones a través de la película de la fuente al drenaje. Desagüe de la fuente de voltaje se define como:
      
      Nota: El voltaje drenaje fuente debe ser suficientemente pequeño para que me_SD escala linealmente con V_SD. ¹⁷
   3. Elija una frecuencia de barrido (v) en el cual E_G se cambia linealmente con el tiempo que sea independiente de mi_SD para que el sistema se puede aproximar que en estado estacionario para cada puerta potencial.
      Nota: Una velocidad de lectura de menos de 0.002 V/s se utiliza a menudo para los sistemas biológicos. ^{29 , 30}
   4. Configurar el software de bipotenciostato para realizar las mediciones bloquea (es decir, barrer la puerta potencial) sobre el rango seleccionado, en el voltaje drenaje fuente seleccionado y en la frecuencia de barrido deseada partiendo de las consideraciones anteriores.
      Nota: para medidas bloquea anteriores usando g. sulfurreducens,^17,19 E_G = -0.55 V a 0,6 V (contra ella), V_SD = 0,01 V o 0,1 V, v = 0.001 s V. Para Biocathode MCL, E_G = 0,25 V a 0.7 V (contra ella), V_SD = 0.002 V, v = 0,0002 s V.
      1. Además, realizar una medición de línea de base con V_SD = 0.000 V (es decir, un CV en cada electrodo individual simultánea) en la misma v elegida en el paso 3.1.3.
   5. Realizar mediciones bloquea usando las condiciones en 3.1.4 bajo tanto volumen de ventas (con donante del electrón soluble o aceptador de presente) y las condiciones de no rotación (sin donante del electrón soluble o aceptador).
      Nota: Condiciones de volumen de ventas no son ventajosas porque las mediciones no son oscurecidas por la oxidación o reducción de compuestos solubles para el metabolismo celular, aunque deben obtenerse resultados similares, independientemente de que la condición se usa después de restar las corrientes de fondo (detalladas de 3.1.8).
      1. Lograr condiciones de facturación utilizando el mismo medio de reactor utilizado para crecimiento bacteriano en el electrodo. Este medio contiene a un donante de electrones soluble, como el acetato de g. sulfurreducens,¹⁷ o aceptante, tal como oxígeno para Biocathode MCL.
      2. Lograr condiciones de facturación no haciendo el mismo medio de reactor usado para crecimiento bacteriano en el electrodo, excepto omita el donante del electrón soluble o aceptador. Después de asegurarse que el potenciostato está apagado, quite el medio asépticamente y añadir en medio fresco sin el donante del electrón para sistemas anódicos o aceptador para sistemas catódicos. Alternativamente, se puede configurar un sistema de flujo continuo para reemplazar poco a poco el medio con el medio deseado de condiciones nonturnover.
         Nota: Si el oxígeno es el aceptor de electrones soluble (en cuanto a biocathode MCL), sparge del sistema con una mezcla de ~ 15% CO₂ y 85% N₂ (o una mezcla de gases que mantiene el pH correcto en el medio).
   6. Después de la terminación de las medidas bloquea, utilice el software de potenciostato para establecer el potencial de cada electrodo en el crecimiento potencial para permitir que el sistema volver a estabilizar (usando los mismos valores como en 2.2.2).
   7. Si se cumplen todas las condiciones descritas anteriormente (_SD es independiente de v y escala linealmente con V_SD), convertir los valores de_SD a conductividad usando las siguientes ecuaciones como se describió anteriormente³¹
      
      
   8. donde G es la conductancia y S es un factor de escala que depende del sistema y factores en variables tales como tamaño de electrodo, tamaño de hueco y altura de biofilm. Para determinados sistemas, S puede determinarse de las ecuaciones previamente. ³¹ por otra parte, S se puede calcular numéricamente mediante un software de modelado, detallados anteriormente. ¹⁷
   9. Restar las corrientes de fondo para identificar la forma y la magnitud de la corriente conducida. O restar la corriente generada en V_SD = 0,00 V de la corriente generada en V_SD = 0,01 V o restar el drenaje actual de la fuente actual generado con una V_SD = 0,01 V. cualquier método quita fondo corrientes, dejando sólo la corriente realizada.
2. Medidas bloquea electroquímicas dependiente de la temperatura
   1. Determinar el rango de temperaturas de interés. Esta gama es altamente dependiente en el sistema bajo estudio, deben usarse las temperaturas sin embargo fisiológicamente relevantes.
      Nota: Estudios previos han utilizado una gama de temperatura de 10 ° C a 30 ° C para el estudio de transporte de electrones en condiciones fisiológicamente relevantes para microorganismos mesófilos. ¹⁷
   2. Obtener un baño de agua de recirculación o incubadora para regular la temperatura del reactor y un reactor de control para asegurar que el set point y la temperatura del medio es el mismo.
      1. Coloque un termómetro o termopar en un reactor de control donde sería la IDA.
   3. Hacer las medidas de_SD (ver 3.1.4) en el rango de temperaturas seleccionadas bajo volumen de ventas y nonturnover (descrito en el paso 3.1.5) condiciones utilizando el bipotenciostato siguiendo uno de los dos procedimientos que se describen a continuación.
      1. I generar_SD vs curvas de E_G , como se describió anteriormente (ver 3.1), para cada temperatura en el rango de temperatura de interés. Para los materiales exhiben conductividad de redox, como g. sulfurreducens y Biocathode MCL, la corriente máxima de cada temperatura se utiliza para determinar el_SD vs dependencia de T.
         Nota: Este método se utiliza para generar un completo I_SD vs E_G curva para cada temperatura, pero requiere más tiempo que la segunda opción.
      2. Alternativamente, ajuste y mantenga la IDA en la puerta de potencial que produce máximo realizado actual usando el bipotenciostato (obtenida en la_SD curva de_G vs E, paso 3.1.4) y registrar la corriente máxima realizada usando el bipotenciostato mientras la temperatura es un ciclo entre el rango de temperaturas seleccionado mediante los controles a bordo del baño María o incubadora.
         Nota: con la geometría del electrodo/reactor utilizada aquí, el que se permitieron estabilizar para por lo menos 20 minutos y un promedio estable_{SD SD} y T se utiliza para cada temperatura. Más o menos tiempo de estabilización puede ser necesario basado en el sistema específico. Este método es más rápido que el primero y causa menos estrés a la biopelícula. Sin embargo, no se generan curvas bloquea completas.
      3. Ciclo de la temperatura de un punto a otro y volver otra vez con los controles a bordo de la incubadora o baño de agua para determinar la reversibilidad de la reacción para asegurar que la temperatura de ciclismo no daña el biofilm.
   4. Restablecer la temperatura a la temperatura de crecimiento normal usando los controles a bordo de la incubadora o baño y permitir que el sistema se estabilice.
      Nota: Para un conductor de redox, el_SD versus datos 1/T puedo ser encajo con la expresión de velocidad de Arrhenius, que permite el cálculo de la energía de activación como sigue:
      
      
      donde E_una es la energía de activación para la transferencia de electrones entre cofactores redox adyacentes y k es la constante de Boltzmann.

Resultados

IDAs se atado con alambre, aisladas y probadas para asegurar que los dos electrodos estaban eléctricamente aislados entre sí (figura 1). Reactores se montado, inoculados con g. sulfurreducensy se incubaron hasta un biofilm tendido un puente sobre el boquete entre los electrodos. El biofilm de g. sulfurreducens se aprecia visualmente para cubrir la matriz. Otros biofilms pueden requerir el investigador hacer un bloquea medidas electroquímicas...

Discusión

Durante la instalación de la IDA, es fundamental para probar que la fuente y el dren no son pone en cortocircuito juntos antes medidas electroquímicas bloquea, ya que esto alterará el_SD vs curva de E_G y podría conducir a interpretaciones y resultados erróneos. También es fundamental para seleccionar V_SD y v tal que la corriente es linealmente dependiente en V_SD e independiente de v. Si este no es el caso, las ecuaciones descritas anteriormente no pueden ser utilizadas para calc...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
IDAs	CH Instruments	012125	Fabricado por ALS-Japan; vendido por CH Instruments
Alambre	Digikey	W7-ND
Epoxi de plata conductora	Ciencias de la microscopía electrónica	12670-EE
			Compuesto ignífugo Scotchast
15 mL tubo de centrífuga cónico	VWR	89004-368
Aguja de 21 g	VWR	BD-305165
Puntas de pipeta de 5 mL	VWR	82018-842
Pipeta de 5 ml	VWR	89079-976
Componentes del medio de agua dulce	Sigma Aldrich	Todos los productos químicos
Cloruro
Fosfato de sodio monobásico
Bicarbonato
Componentes del medio de agua de mar artificial	Sigma Aldrich	Todos los productos químicos
Cloruro de
Cloruro de magnesio hexahidratado
Sulfato de magnesio heptahidratado
Cloruro
Bicarbonato
Cloruro de calcio dihidratado
Cloruro
Fosfato de potasio dibásico
Ag/AgCl electrodo de referencia Basi		MF-2079
Contraelectrodo de varilla de grafito	Ciencias de la microscopía electrónica	70230
Baño de agua recirculante	Thermo Scientific	152-5256
Bipotenciostato	Instrumentos de pino	WD-20	http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user
Barras agitadoras	VWR	58947-114
G. sulfurreducens cultivo	ATCC	51573
Reactor encamisado	Pine Instruments	RRPG085