Los protocolos descritos en este documento facilitan la investigación conveniente de las respuestas bacterianas al etileno mediante la utilización de ácido 2-cloroetilfosfónico (CEPA). El etileno se produce in situ a través de la descomposición de CEPA en un medio acuoso de crecimiento bacteriano, eludiendo el requisito de gas etileno puro.
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Artículo de método
Utilizando el compuesto que libera etileno, ácido 2-cloroetilfosfónico, como una herramienta para estudiar la respuesta de etileno en bacterias
En este artículo
Resumen
Resumen
El etileno (C2H4) es una fitohormona gaseosa que interviene en numerosos aspectos del desarrollo de las plantas, desempeñando un papel dominante en la senescencia y la maduración de los frutos. El etileno exógeno aplicado durante el desarrollo temprano de la planta desencadena el fenotipo de triple respuesta; un hipocótilo más corto y grueso con un gancho apical exagerado. A pesar de la íntima relación entre las plantas y las bacterias, el efecto del etileno exógeno sobre las bacterias se ha pasado por alto en gran medida. Esto se debe en parte a la dificultad de controlar el etileno gaseoso dentro del laboratorio sin equipo especializado. El ácido 2-cloroetilfosfónico (CEPA) es un compuesto que se descompone en etileno, cloro y fosfato en una proporción molar de 1:1:1:1 cuando se disuelve en un medio acuoso de pH 3,5 o superior. En este trabajo describimos el uso de CEPA para producir etileno in situ para la investigación de la respuesta al etileno en bacterias utilizando como organismo modelo la bacteria productora de celulosa Komagataeibacter xylinus, asociada a la fruta. Los protocolos descritos en este documento incluyen tanto la verificación de la producción de etileno a partir de CEPA a través del ensayo de triple respuesta de Arabidopsis thaliana como los efectos del etileno exógeno sobre la producción de celulosa de K. xylinus, las propiedades de la película y la morfología colonial. Estos protocolos se pueden adaptar para examinar el efecto del etileno en otros microbios utilizando medios de crecimiento apropiados y análisis de fenotipos. El uso de CEPA proporciona a los investigadores una alternativa simple y eficiente al gas etileno puro para la determinación rutinaria de la respuesta bacteriana al etileno.
Introducción
El etileno olefina (C 2 H 4) fue descubierto por primera vez como una hormona vegetal en 1901 cuando se observó que las plántulas de guisante, cultivadas en un laboratorio que utiliza lámparas de gas de carbón, exhiben una morfología anormal en la que los vástagos (hipocotilos) eran más cortas, más gruesas y dobladas hacia los lados en comparación con las plantas de semillero de guisantes normales; un fenotipo más adelante llamado el 1,2 respuesta triple. Estudios posteriores demostraron que el etileno es una fitohormona vital que regula numerosos procesos de desarrollo tales como el crecimiento, la respuesta al estrés, la maduración ....
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Protocolo
1. Productos químicos
- Preparar una solución de CEPA 500 mM (144,49 g / mol), y una solución que consiste en tanto NaCl 500 mM (58,44 g / mol) y 500 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O (137,99 g / mol) en acidificada (pH 2.5) agua ultra-pura o HCl 0,1 N. Mezclar utilizando un vórtice hasta que las soluciones son claras.
- En serie diluir (10x) las soluciones 500 mM en el mismo disolvente para obtener 5 mM y 50 mM de existencias.
- Preparar una solución de 10 mM de 1-aminocyclopropane ácido carboxílico (ACC; 101,1 g / mol) en agua ultra-pura.
- Filtro-esterilizar las soluciones madre y almacenar alícuotas a -20 ° C.....
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Resultados
Una configuración de placa esquemática para la verificación de la liberación de etileno de CEPA en medio SH (pH 7) mediante el ensayo de triple respuesta se muestra en la Figura 1A - C. Un diagrama de flujo que ilustra el protocolo de película se muestra en la Figura 2. Dark-adulto A. thaliana plántulas exhiben el fenotipo de triple respuesta (hipocotilo corto y más grueso con un gancho apical exagerada) en presencia de ACC y en.......
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Discusión
Los métodos descritos aquí describen la producción in situ de etileno a partir de CEPA para el estudio de la respuesta de etileno bacteriana usando el organismo modelo, K. xylinus. Este método es muy útil como etileno puede ser producido por complementar cualquier medio acuoso que tiene un pH mayor que 3,5 10,11 con CEPA negando la necesidad de gas de etileno puro o equipo de laboratorio especializado. Este método no se limita a estudiar los efectos del etileno CEPA derivados de bacterias, p.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Dr. Dario Bonetta por proporcionar semillas de Arabidopsis thaliana y por la asistencia técnica en relación con el ensayo de triple respuesta, así como a Simone Quaranta por su ayuda con FT-IR. Este trabajo fue apoyado por una Beca de Descubrimiento del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC-DG) para JLS, una Beca de Posgrado de Ontario (OGS) para RVA y una Beca de Posgrado Reina Isabel II en Ciencia y Tecnología (QEII-GSST) para AJV.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido carboxílico 1-aminociclopropano (ACC) | Sigma | A3903 | Precursor biosintético del etileno en plantas |
| Placa de Petri de 4 sectores | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | Para pruebas de triple respuesta |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | Para solidificar el medio |
| Cámara Canon Rebel T1i DLSR Canon | 3818B004 | Para imágenes de películas | |
| Celulasa de Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Solución acuosa |
| Ácido cítrico | BioShop | CIT002.500 | Para medio SH |
| Lejía comercial | Life Brand 57800861874 | Lejía para la esterilización de semillas | |
| HCl concentrado | BioShop | HCL666.500 | Ácido clorhídrico para el ajuste del pH |
| Microscopio digital USB | Enchufable | N/A | Para fotos de colonias |
| Etefón (≥ 96%; Ácido 2-cloroetilfosfónico) | Sigma | C0143 | Compuesto liberador de etileno |
| Glucosa | BioBasic | GB0219 | Para medio SH |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Alfaproteobacteria productora de celulosa bacteriana |
| Tubo de microcentrífuga | LifeGene | LMCT1.7B | Tubo de microcentrífuga de 1,7 ml |
| Murashige y Skoog (MS) basal medio | Sigma | M5519 | Medio de crecimiento de Arabidopsis thaliana |
| Na2HPO4· 7H2O | BioShop | SPD579.500 | Fosfato de sodio, heptahidratado dibásico para medio SH |
| NaCl | BioBasic SOD001.1 | Cloruro de sodio para solución salina y de control | |
| NaH2PO4· H2O | BioShop | SPM306.500 | Fosfato de sodio, monobásico monohidrato para solución de control |
| NaOH | BioShop SHY700.500 | Hidróxido de sodio para el ajuste del pH Película de | |
| parafina | Parafilm | PM996 | Para el sellado de placas y matraces |
| Peptona (bacteriológica) | BioShop | PEP403.1 | Para medio SH |
| Cámara de recuento Petroff-Hausser | Hausser scientific | 3900 | Cámara de recuento de células bacterianas |
| Filtro de esterilización de polietersulfona 0,2 y micro; m | VWR | 28145-501 | Para esterilizar celulasa |
| Sacarosa | BioShop | SUC600.1 | Sacarosa para medio MS |
| Extracto de levadura | BioBasic | G0961 | Para medio SH |
Referencias
- Guzmán, P., Ecker, J. R. Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).
- Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. History of research on the plant hormone ethylene. J. Plant Growth Regul....
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Reimpresiones y permisos
