Caracterización de complejos de proteínas de múltiples subunidades de MxA humano Usando no desnaturalizante en gel de poliacrilamida-electroforesis

Summary

Este artículo describe un protocolo simple y rápido para evaluar el estado oligomérico de la proteína GTPasa MxA similar a la dinamina a partir de lisados de células humanas utilizando una combinación de PAGE no desnaturalizante con análisis de Western blot.

Abstract

La formación de complejos oligoméricos es un requisito previo crucial para la estructura y función adecuadas de muchas proteínas. La proteína efectora antiviral MxA inducida por interferón ejerce una amplia actividad antiviral contra muchos virus. MxA es una GTPasa similar a la dinamina y tiene la capacidad de formar estructuras oligoméricas de orden superior. Sin embargo, si la oligomerización de MxA es necesaria para su actividad antiviral es un tema de debate. Describimos aquí un protocolo sencillo para evaluar el estado oligomérico de MxA expresado endógena o ectópicamente en la fracción citoplasmática de líneas celulares humanas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante (PAGE) en combinación con análisis de Western blot. Un paso crítico del protocolo es la elección de detergentes para evitar la agregación y/o precipitación de proteínas particularmente asociadas con membranas celulares como MxA, sin interferir con su actividad enzimática. Otro aspecto crucial del protocolo es la protección irreversible de los grupos tiol libres de los residuos de cisteína mediante yodoacetamida para evitar interacciones artificiales de la proteína. Este protocolo es adecuado para una evaluación sencilla del estado oligomérico de MxA y, además, permite una correlación directa de la actividad antiviral de los mutantes de la interfaz MxA con sus respectivos estados oligoméricos.

Introduction

La estructura cuaternaria de una proteína juega un papel crucial en muchos procesos celulares. Vías de señalización, la expresión del gen de la enzima, y la activación / desactivación de todos se basan en el correcto montaje de complejos de proteínas ^1-4. Este proceso también conocido como homo- o hetero-oligomerización se debe a covalente irreversible o interacciones proteína-proteína electrostáticas e hidrofóbicas reversibles. La oligomerización no sólo diversifica los diferentes procesos celulares sin aumentar el tamaño del genoma, sino que también proporciona una estrategia para las proteínas para construir complejos estables que son más resistentes a ....

Protocol

NOTA: Este protocolo se basa en el protocolo de PAGE no desnaturalizante publicado previamente ^12. En ese estudio, el estado oligomérico de la proteína MxA se evaluó mediante cualquiera de las células Vero que sobreexpresan MxA o células A549 IFN-alfa estimulada que expresan endógeno MxA. El protocolo se describe a continuación se puede utilizar para analizar el estado oligomérico de cualquier proteína, además de MxA. Sin embargo, puede ser necesaria una mayor optimización.

1. Preparación de la célula lisado de PAGE no desnaturalizante

NOTA: Para analizar el estado oligomérico de la proteína MxA human....

Results

Usando PAGE no desnaturalizante, se analizó el estado oligomérico de la naturaleza humana tipo MxA, los mutantes de interfaz dimérica MxA (R640A) y MxA (L617D), así como el mutante interfaz monomérica MxA (M527D) a partir de lisados celulares ^12. Las células se lisaron en un tampón que contiene 1% octilfenoxipolietoxietanol (NP-40) y yodoacetamida para asegurar la solubilización de proteínas y la protección de los grupos tiol libres (véase la figura 1). Como se ha descrito antes, la sal y peq.......

Discussion

Aquí se describe un método sencillo que permite la rápida determinación del estado oligomérico de proteínas expresadas en células de mamífero por PAGE no desnaturalizante seguido de análisis de transferencia de Western. La principal ventaja de este enfoque es que el estado oligomérico de una proteína dada se puede determinar a partir de lisados ​​de células enteras sin purificación de la proteína anterior. Esto puede ser importante para las proteínas que oligomerizar o ejercen su función en asociación con factores auxil.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Unidades de diálisis Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,5 ml	Thermo Fisher Scientific	69570	Preequilibrio en tampón de diálisis (si se desea eliminar el glicerol) Puede ser de fabricación propia según Fiala et al. 2011
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Geles de proteínas prefabricadas, 10 pocillos,Bio-Rad		456-1083	Pre-ejecución en tampón en funcionamiento para ajustar el sistema de tampón
cOmplete, Mini, sin EDTA	Roche	11836170001	utilizar 1 comprimido por 50 ml
PBS, pH 7,4  frasco de 500 ml Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S solución	Sigma-Aldrich	P7170	TÓXICO use guantes y proteja los ojos
NativeMark Unstained Protein Standard  50 µ l	Invitrogen	N/P 57030	carga 5 y micro; l/pozo
A549 células	ATCC ATCC	CCL185	Crecer en medio de crecimiento (ver Tabla 1)
Células Vero	ATCC ATCC	CCC81	Crecer en medio de crecimiento (ver Tabla 1)
anticuerpo anti-Mx1	Novus Biologicals	H00004599_D01P	Uso en una dilución de 1:1.000
ECL Anti-IgG anti-conejo, rábano picante Anticuerpo entero ligado a la peroxidasa (de burro)	GE-Healthcare	NA934V	Úselo en una dilución 1:10.000
0.5% Trypsin-EDTA (1x)              Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
Yodoacetamida    5 g	Sigma-Aldrich	I-6125	culata  100 mM
Bromphenolblue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies	Thermo Fisher Scientific	41966-029
Pen  Estreptococo 100 x        100 ml                            life technologies	Thermo Fisher Scientific	15140 - 130
Glutamax 100x Caldo, 100 ml        life technologies	Thermo Fisher Scientific	350500-038
Suero fetal bovino, dializado, EE. UU. Origen 500 ml Gibco Lote:42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Papel de filtro de celulosa	Bio-Rad	1703965
membrana de transferencia de PVDF	GE-Healthcare 10600022
Tris(hidroximetil)aminometano	Biosolve	0020092391BS
fluoruro de sodio (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cOmplete, Mini, sin EDTA	Roche
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS 10% solución	Amresco	N907
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glycine	Biosolve	0007132391BS
ortovanadato sódico (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
Glicerol	Sigma Aldrich	G7757
β-Glicerofosfato	Sigma Aldrich	G9422
Leche en polvo	Migros/Suiza
Metanol	Millipore	1.06009
cloruro de sodio (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
cloruro de magnesio (MgCl2)	Amresco	288
Sulfato de dodecilo de sodio (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
hidróxido de sodio (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045