La visualización de frecuencia Stromule con microscopía de fluorescencia

Summary

Se describen protocolos para investigar la dinámica de los estrómulos de cloroplastos, los túbulos llenos de estroma que se extienden desde la superficie de los cloroplastos.

Abstract

Los estrómulos, o "túbulos llenos de estroma", son extensiones estrechas y tubulares de la superficie del cloroplasto que se observan universalmente en las células vegetales, pero cuyas funciones siguen siendo misteriosas. Junto con la creciente atención sobre el papel de los cloroplastos en la coordinación de las respuestas de las plantas al estrés, el interés en los estrómulos y su relación con la dinámica de señalización de los cloroplastos ha aumentado en los últimos años, ayudado por los avances en microscopía de fluorescencia y fluoróforos de proteínas que permiten una visualización rápida y precisa de la dinámica de los estrómulos. Aquí, proporcionamos protocolos detallados para analizar la frecuencia de los estrómulos en los cloroplastos epidérmicos de Nicotiana benthamiana, un excelente sistema modelo para investigar la biología de los estrómulos de cloroplastos. También proporcionamos métodos para visualizar los estrómulos de cloroplastos in vitro mediante la extracción de cloroplastos de las hojas. Finalmente, describimos estrategias de muestreo y enfoques estadísticos para analizar las diferencias en las frecuencias de los estrómulos en respuesta a estímulos, como el estrés ambiental, los tratamientos químicos o el silenciamiento génico. Los investigadores pueden utilizar estos protocolos como punto de partida para desarrollar nuevos métodos de experimentos innovadores que exploren cómo y por qué los cloroplastos producen estrómulos.

Introduction

Los cloroplastos son orgánulos dinámicos en las células vegetales responsables de la fotosíntesis y de una serie de otros procesos metabólicos. Las vías de señalización del cloroplasto también ejercen una influencia significativa en la fisiología y el desarrollo de las plantas, coordinando las respuestas de las plantas al estrés ambiental, los patógenos e incluso la forma de las hojas^1-6. Recientemente, los biólogos se han interesado en un aspecto poco conocido de la estructura del cloroplasto: los estrómulos, túbulos muy delgados llenos de estroma que se extienden desde la superficie del cloroplasto⁷.

Las funciones bi....

Protocol

NOTA: Para este protocolo, se han centrado en el ensayo de la frecuencia stromule en la epidermis de N. deja benthamiana. Varias líneas transgénicas estables que se han generado que se puede utilizar para este propósito, incluyendo 35S _PRO: FNRtp: EGFP ¹³ y NRIP1: Cerulean ^6. Ambas líneas muestran la expresión robusta de fluoróforos en el estroma del cloroplasto de hojas cultivadas en una amplia gama de condiciones. Alternativamente, fluoróforos cloroplasto orientada se pueden expresar de forma transitoria en N. benthamiana utilizando Agrobacterium Transformaciones ^13. E....

Results

Este protocolo se utiliza para visualizar la frecuencia stromule en el día y por la noche en los cotiledones de joven N. plántulas benthamiana. Rebanadas de una pila z se fusionaron en una sola imagen (Figura 1A). Para los propósitos visuales, que la imagen fue entonces desaturado y se invierte de manera que el estroma aparece en negro (Figura 1B). Los cloroplastos se marcaron o bien como no tener stromules (asterisco verde) o .......

Discussion

Al investigar stromules, tres factores importantes deben ser considerados a lo largo de: (i) la manipulación del tejido de la planta deben mantenerse a un mínimo absoluto, (ii) el sistema experimental debe mantenerse constante, y (iii) las estrategias de muestreo debe ser planeada cuidadosamente para asegurar robusta, se analizan los datos reproducibles.

Stromules son muy dinámicas: se pueden extender y retraer rápidamente ante los ojos de un observador bajo el microscopio. Por otra parte, l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
Microscopio Confocal de Barrido Láser	Carl Zeiss Inc	Modelo: LSM710
Diacetato de carboxifluoresceína (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
Dimetilsulfóxido (DMSO)	EMD	MX1458-6
Batidora Waring	Waring	Modelo: 31BL92
Fiji	fiji.sc		Software de código abierto para el análisis de imágenes biológicas