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Retroviral transducción de células T colaboradoras como un enfoque genético para estudiar mecanismos que controlan su diferenciación y función

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DOI:

10.3791/54698

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4 de noviembre de 2016

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1Department of Comparative Biomedical Sciences, The Royal Veterinary College, 2Institute of Physiology I, Cardiology & Vascular Medicine, Eberhard Karls University of Tuebingen, 3Department of Clinical Science and Services, The Royal Veterinary College

En este artículo

Resumen

Muchos sistemas experimentales se han utilizado para entender los mecanismos que regulan el desarrollo de células T y la función en una respuesta inmune. Aquí se describe un enfoque genético usando la transducción retroviral, que es económico, eficiente en tiempo, y lo más importante, muy informativos en la identificación de las vías de regulación.

Resumen

El desarrollo y la función de las células T auxiliares deben estar estrictamente regulados para inducir una respuesta inmunitaria adecuada que elimine patógenos específicos y al mismo tiempo evite la autoinmunidad. Se han utilizado muchos enfoques que involucran a diferentes organismos modelo para comprender los mecanismos que controlan el desarrollo y la función de las células T auxiliares. Sin embargo, los estudios con modelos de ratón han demostrado ser muy informativos debido a la disponibilidad de sistemas genéticos, celulares y bioquímicos. Un enfoque genético en ratones utilizado por muchos laboratorios implica la transducción retroviral de células T auxiliares primarias. Este es un enfoque poderoso debido a su relativa facilidad, lo que lo hace accesible a casi cualquier laboratorio con habilidades básicas en biología molecular e inmunología. Por lo tanto, se puede probar fácilmente la función de múltiples genes en formas salvajes o mutantes en las células T auxiliares para comprender su importancia y mecanismos de acción. Hemos optimizado este enfoque y describimos aquí los protocolos para la producción de retrovirus de alto título, el aislamiento de linfocitos T auxiliares murinos primarios y su transducción por retrovirus y la diferenciación hacia los diferentes subconjuntos auxiliares. Finalmente, el uso de este enfoque se describe en el descubrimiento de los mecanismos utilizados por los microARN (miARN) para regular las vías que controlan el desarrollo y la función de las células T auxiliares.

Introducción

La respuesta inmune debe estar altamente regulada para eliminar infecciones pero prevenir ataques al tejido propio que conducen a la autoinmunidad. Las células T colaboradoras desempeñan un papel esencial en la regulación de la respuesta inmunitaria, y se ha realizado un gran esfuerzo para comprender su desarrollo y función (ilustrado en varias revisiones recientes 1-3). Sin embargo, aún quedan muchas preguntas y se han utilizado muchos enfoques para estudiar los mecanismos que controlan el desarrollo y la función de las células T auxiliares. Estos han ido desde el uso de sistemas de cultivo celular in vitro hasta animales enteros. Los sistemas de cultivo celular, especialmente los que utilizan líneas celulares, ofrecen la ventaja de la facilidad de uso y la capacidad de generar una gran cantidad de material para realizar análisis bioquímicos sofisticados. Sin embargo, sufren de su capacidad limitada para reproducir las condiciones reales que ocurren en una respuesta inmune. Por el contrario, los experimentos con animales enteros ofrecen el beneficio de la relevancia, pero pueden sufrir dificultades en la manipulación y la capacidad de realizar controles precisos, además de sus grandes costos e implicaciones éticas. Sin embargo, la gran mayoría de los estudios de células T auxiliares en la actualidad todavía requieren el uso de experimentos con animales enteros con células T primarias debido a la incapacidad de las líneas celulares para duplicar los pasos exactos que ocurren en todo el animal. Por lo tanto, es esencial utilizar enfoques rentables que sean altamente informativos.

La genética es una herramienta poderosa para estudiar el desarrollo y la función de las células T auxiliares, sin embargo, los métodos tradicionales que involucran eliminaciones de genes o transgenes consumen mucho tiempo y son costosos, por lo que a menudo están fuera del alcance de los pequeños laboratorios. Sin embargo, la transducción retroviral ofrece un enfoque genético potente, rápido y rentable para estudiar los mecanismos de productos genéticos específicos. Por lo tanto, se usa comúnmente en artículos que estudian el desarrollo y la función de las células T auxiliares.

Hemos optimizado un procedimiento para la transducción retroviral de células T auxiliares. Utiliza el vector de expresión retroviral pMIG (virus de células madre murinas-sitio de entrada ribosómico interno-proteína fluorescente verde), en el que se puede clonar el gen de interés y, por lo tanto, expresarlo a partir de la repetición terminal larga (LTR) del retrovirus 4. Además, aguas abajo del gen de interés insertado hay una secuencia de entrada de ribosoma interno (IRES) seguida por el gen de la proteína fluorescente verde (GFP), por lo que las células transducidas pueden ser fácilmente seguidas por su expresión de GFP. El vector se derivó originalmente de los vectores del Virus de las Células Madre Murinas (MSCV), que contienen mutaciones en los sitios de unión de los represores en los LTR, lo que los hace resistentes al silenciamiento y, por lo tanto, da una alta expresión en muchos tipos de células, incluidas las células T auxiliares 5,6. La producción de retrovirus de alto título requiere un protocolo de transfección transitoria simple de células 293T de riñón embrionario humano (HEK) con el vector MIG y un vector de virus auxiliar que expresa los genes retrovirales GAG, Pol y Env. Para esto, el vector de virus auxiliar pCL-Eco 7 funciona bien en la producción de retrovirus incompetentes de replicación de alto título.

Aquí se describen estos protocolos para la producción retroviral y la transducción de linfocitos T murinos primarios, además de algunos de nuestros resultados utilizando este enfoque para estudiar la regulación de miARN de la expresión génica que controla la diferenciación de linfocitos T auxiliares. Los miRNAs son pequeños ARN de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud que regulan postranscripcionalmente la expresión génica dirigiéndose a secuencias homólogas en los ARN mensajeros que codifican proteínas y suprimen la traducción e inducen Inestabilidad del mensaje 8,9. Los miARN desempeñan un papel fundamental en la regulación génica del desarrollo. Son esenciales en las etapas más tempranas del desarrollo, ya que los embriones que no pueden producir miRNAs mueren en una etapa muy temprana 10. Además, los miRNAs son importantes más adelante en el desarrollo de muchos tejidos. Se cree que funcionan afinando la expresión de los genes necesarios para los programas de desarrollo 1. En los linfocitos T colaboradores, los miARN desempeñan múltiples funciones y son necesarios para el desarrollo de los linfocitos T reguladores (Treg) 11-14. Utilizamos la transducción retroviral como medio para diseccionar los mecanismos de regulación de miRNA de la diferenciación de Treg 15. A través de estos estudios, se determinaron importantes miRNAs individuales por sobreexpresión mediada por retrovirales. Posteriormente, se identificaron genes relevantes regulados por estos miRNAs para comprender las vías moleculares reguladas por miRNAs en la diferenciación de células T auxiliares.

Protocolo

Todo el trabajo realizado ratón en estos protocolos se llevó a cabo de acuerdo con los Procedimientos Animales Científicas Ley, Reino Unido en virtud del animal Licencia del Proyecto 70/6965.

1. Producción retroviral

Antes de proseguir obtener todas las aprobaciones requeridas para la producción de organismos modificados genéticamente y el uso de los retrovirus en células de mamífero.

  1. El crecimiento de células HEK 293T
    1. Se cultivan las células HEK 293T en 10 cm placas de cultivo de tejido en medio HEK 293T (de Dulbecco Modificado de Eagle Medium (DMEM) con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 unidades / ml de penicilina 0,1 mg / ml de estreptomicina, y 2 mM L-glutamina) . Para los pasos celulares general, las células divididas 1:10 cuando alcanzan la confluencia retirando medio y pipeteando las células de la placa con medio fresco HEK 293T.
      NOTA: Las celdas deben llegar a la confluencia en 2-3 días. Las células HEK 293T se unen débilmente a la placa de modo tripsinización no es necesario.
    2. 24 horas antes de la transfección, dividir un conflueplaca nt de las células 1:10 a una placa de 10 cm (una placa por transfección) para que el día siguiente, las células son ~ 50% de confluencia.
  2. La transfección por el calcio de precipitación con fosfato
    1. Aproximadamente 1 h antes de la transfección, eliminar medio de las células y añadir cuidadosamente 9 ml de medio de HEK 293T fresco para evitar que las células se separe de la placa.
    2. Preparar 2x Hepes Buffered Saline (2x HBS) y una solución fresca 2,5 M CaCl 2 como se describe en la Tabla 1. Descongelar las existencias de ADN. Para las transfecciones más eficientes usar el ADN plásmido calidad de preparación.
    3. En un fondo redondo de 6 ml o 15 ml tubo cónico de añadir 5 g de ADN retroviral (pMIG) 4, 5 g de ADN de virus auxiliar (PCL-Eco) 7, y H2O a 420 l. Añadir 80 l de 2,5 M CaCl 2 con lo que el volumen final a 500 l.
      Nota: Esto, junto con la siguiente etapa (adición de 2x HBS) se puede hacer en un banco normal, siempre y cuando ster en generalse utiliza la técnica de ile.
    4. Añadir lentamente 500 l de 2x HBS gota a gota a la mezcla de ADN anterior mientras que suavemente vórtex de modo que la solución es continuamente mezclado y el CaPO4 precipita en cristales de tamaño uniforme.
    5. Transferencia a una campana de cultivo de tejido y se añade lentamente la mezcla de ADN CaPO4 (1 ml) gota a gota a los 9 ml de medio de cobertura de las células mientras que constantemente y suavemente remolinos de la placa. Una vez más, tenga cuidado de no separar las células de la placa. Colocar las células de nuevo en la incubadora.
      NOTA: En este punto el precipitado CaPO4 será fácilmente visible bajo el microscopio como pequeños cristales sobre el tamaño de las bacterias. Estos son vistos con facilidad después de 30-60 minutos cuando los cristales han tenido la oportunidad de asentarse en el fondo de la placa.
  3. Colección de virus en los sobrenadantes de cultivo.
    1. Al día siguiente (en cualquier lugar 12-24 horas después de la transfección) eliminar el medio y alimentar las células con 10 mlde medio de células HEK 293T fresco una vez más teniendo cuidado de no desalojar las células de la placa.
      NOTA: Este diluye las sustancias inhibidoras de linfocitos que las células HEK 293T secretan en el medio durante la transfección.
    2. En la tarde del segundo día (~ 24 horas después de la transfección) células con 3,5 ml de medio de células HEK 293T fresca alimentar. Tenga cuidado de que la placa se coloca exactamente al mismo nivel en la incubadora de modo que un lado no se quede seco.
    3. Recoger medio ~ 12 horas más tarde (se almacena a 4 ° C) y se alimentan con 3,5 ml de medio de células HEK 293T fresco. Repita la colección 2 más veces en aproximadamente 12 hr intervalos de modo que se recaba unos 10 ml de medio. Esta es la madre de virus.
    4. Girar fuera cualesquiera células HEK 293T residuales y los restos celulares por centrifugación a 600 xg durante 5 min. Alternativamente, filtrar utilizando una baja unión a proteínas, filtro de jeringa de 0,45 micras. el virus se almacena a 4 ° C, y para obtener mejores títulos, utilizan dentro de un día o dos, ya que el título disminuirá lentamente a 4 ° C. No frEeze, ya que esto disminuye significativamente el título.

2. Aislamiento de T primarias Naïve células CD4 +

  1. Aislamiento de células de leucocitos
    1. La eutanasia a los ratones por dislocación cervical, asfixia con CO2, u otro protocolo humana adecuada a las normas de manejo de animales de la institución.
    2. Diseccionar los ratones recién sacrificados y quitar el bazo y los ganglios linfáticos deseada 15. Coloque los órganos en los pocillos de una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos que contenía medio R10 (medio RPMI con calor al 10% de FBS inactivado, 100 unidades / ml de penicilina, 0,1 mg / ml de estreptomicina, 2 mM L-glutamina y 0,1% β-mercaptoetanol) . Use una campana de cultivo celular para la disección de los ratones y todas las manipulaciones posteriores para minimizar la posibilidad de contaminación en los cultivos.
      NOTA: Mantenga el medio R10 fría y llevar a cabo todas las etapas de purificación aguas abajo a 4 ° C.
    3. Coloque un cultivo de células colador de 70 micras en un 50 ml tubo cónico que contenía aproximadamente 5 ml de medio R10. Utilice uno de los colador bazo y los ganglios linfáticos de hasta tres ratones.
    4. Añadir el bazo y los ganglios linfáticos con el filtro de células y macerar utilizando el extremo de un émbolo de la jeringa 5 ml. Enjuague con 1-2 ml de medio R10.
    5. Transferir las células a un tubo cónico de 15 ml y llevar el volumen hasta 14 ml con R10. Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante mediante el vertido de apagado con un movimiento limpio para evitar alterar el sedimento celular.
    6. Añadir 2 ml de (4 ° C) de glóbulos rojos tampón de lisis frío (Tabla 1) a cada tubo. mezclar suavemente durante 3,5 minutos, manteniendo el tubo en hielo.
      NOTA: El tiempo de lisis de glóbulos rojos es fundamental para evitar la muerte de los linfocitos. Por lo tanto, tendrá que ser optimizado el tiempo exacto de cada lote de tampón de lisis de glóbulos rojos.
    7. Añadir ≈12-13 ml de medio R10. Inmediatamente centrífuga y desechar el sobrenadante como en el paso 2.1.5. Llevar a cabo las etapas de lavado 2x más ingeniomedio h R10 para eliminar cualquier tampón de lisis celular rojo residual de las células y evitar la muerte de los linfocitos.
    8. Recuento de células en un hemocitómetro diluyendo 1:20 en azul de tripano para determinar el rendimiento de células viables. Esperar aproximadamente 8-10 x 10 7 células por ratón.
  2. Aislamiento de células T CD4 + usando perlas magnéticas Kit quitar CD8 +, CD11b +, CD16 / 32 +, CD45R +, MHC de clase II + y Ter-119 + células.
    1. Alícuota de 8-10 x 10 7 células de la etapa 2.1.8 por 15 ml de tubo cónico y centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Verter el sobrenadante con un movimiento limpio para evitar alterar el sedimento celular. Resuspender las células en cada tubo en 100 l de FBS inactivado por calor a continuación, añadir 100 l de mezcla de anticuerpo del kit. Incubar durante 30 min a 4 ° C con agitación suave en un rodillo.
    2. Mientras que las células anteriores están incubando, preparar las perlas.
      1. Perlas de resuspender en el vial por agitación durante> 30 sec entonces Transferir 1 ml de perlas por 8-10 x 10 7 células preparadas a un tubo cónico de 15 ml. Añadir 2 ml de medio R10 por ml de perlas y mezclar suavemente.
      2. Colocar el tubo en el imán durante 1 min entonces descartar el sobrenadante. Retire el tubo de las perlas de imán y resuspender en 4 ml de medio R10. Esta cantidad de granos es suficiente para dos rondas de incubación.
    3. Lavar las células al final de la incubación del anticuerpo (Paso 2.2.1) por adición de 10 ml de medio R10 por tubo. Mezclar suavemente y con turbulencia de las células tubulares y centrifugar a 600 g durante 5 min a 4 ° C. Verter el sobrenadante con un movimiento limpio para evitar alterar el sedimento celular. Resuspender las células en 1 ml de medio R10.
    4. Añadir 2 ml de las perlas lavadas de la etapa 2.2.2.2 (½ de la cantidad preparado para cada tubo) a cada tubo de las células tratadas con anticuerpo y se incuba durante 30 min a 4 ° C con agitación suave en un roller.
    5. Volver a suspender la mezcla de células-grano con la pipeta suavemente 5 veces con una pipeta que contiene una abertura de punta estrecha. Evitar la formación de espuma. Colocar el tubo en el imán granos por 2 min a continuación, transferir el sobrenadante que contiene las celdas seleccionadas negativamente a un nuevo tubo. Mantener estas células, ya que son la población CD4 +.
    6. Repita la selección negativa una vez más. Girar las células de la etapa 2.2.5 a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Verter el sobrenadante como en el paso 2.2.3 y resuspender en 1 ml de medio R10. Sigue los pasos 2.2.4 y 2.2.5 de nuevo. Después de la selección final de cuentas magnéticas, contar las células para determinar la recuperación (rendimientos típicos son 15-20 x 10 6 células por 10 8 leucocitos).
  3. Aislamiento de células T vírgenes CD4 + (CD25 - CD62L y alta) el uso de columnas de separación celular
    1. Centrifugar las células T CD4 + a 600 xg durante 5 min a 4 ° C y se vuelve a suspender en 150-200 l deMedio R10 por 10 8 células. Añadir 2 l de anticuerpo monoclonal CD25 Stock biotinilado (clon 7D4). Incubar durante 30 min a 4 ° C con agitación suave en un rodillo.
    2. Lavar las células por adición de 10 ml de tampón de columna de separación de células (Tabla 1). Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar la mayor cantidad posible sobrenadante y estimar el volumen de buffer / células restantes. Resuspender a un volumen final de aproximadamente 90 l por cada 10 7 células.
    3. Añadir 20 l de perlas de estreptavidina por 10 7 células y mezclar con gestos suaves. Incubar durante 15 minutos a 4 ° C.
    4. Mientras que las células están incubando, preparar las columnas de separación celular medio (EM) para el enfoque manual. Cada columna MS retiene 10 7 células, y puesto que las células CD25 + por lo general representan aproximadamente el 10% del total de células CD4 +, utilice la columna 1 por cada 10 8 células T CD4 +. Añadir 500 l de tampón de la columna de separación de células a la columnay dejar que fluya a través. Repite 2 veces más.
    5. Al final de la incubación de células / perlas, lavar las células por adición de 10 ml de tampón de columna de separación celular y centrifugación a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender las células en 500 l de tampón de la columna de separación de células por cada 10 8 células, pero todavía utilizar 500 l si hay menos células.
    6. Aplicar 500 l de suspensión de células / perlas a la columna y se recoge el flujo a través. Pasar este sobre la columna 1 hora más y se recoge el flujo a través una vez más. Lavar la columna 3 veces con 500 l de tampón de la columna de separación de células, añadiendo cada flujo a través de estos enjuagues para las células recogidas. Estos son los CD25 - células. Contar las células para determinar el rendimiento.
    7. Si se desean células T reguladoras (células CD25 +), aislar de la siguiente manera.
      1. Retirar la columna del separador y mantenerla por encima de un tubo de toma de atención universal abierta para mantener la esterilidad. pipeta rápidamente 500 l de tampón de separación de células en la colUMN y firmemente enjuagar la fracción positiva, usando el émbolo suministrado con la columna.
      2. Repetir el procedimiento de lavado 2 veces más. Pasar la fracción positiva a través de una columna de separación de células frescas MS y desechar este flujo continuo. Firmemente eliminar las células positivas tres veces, como antes y centrifugar las células a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Las células resuspender en 1 ml de medio R10 y contar para determinar el rendimiento.
    8. Para obtener CD25 - células de alta T CD62L, centrifugar el CD25 - células T aisladas anteriormente en la etapa 2.3.6 a 600 xg durante 5 min a 4 ° y resuspender en 150 a 200 l de medio R10 por 10 7 células. Añadir 5 l de anticuerpo monoclonal biotinilado CD62L Stock (clon MEL-14) y se incuba durante 30 min a 4 ° C con agitación suave en un rodillo como antes.
    9. Realizar lavado, estreptavidina grano de unión, y la preparación de la columna de separación de células como se ha descrito para el protocolo de aislamiento de Treg (2.3.7). Este uso del tiempola columna de la gran separación de células (LS), que tiene una capacidad de 10 8 células.
      1. Dado que las células T de alta CD62L normalmente representan alrededor del 60-70% de las células CD25 -, utilizar la columna de separación de células LS 1 por cada 10 8 células. Agregar la mezcla de células / perlas a la columna de separación de células LS como se describe en el paso 2.3.6 - esta vez de desechar el flujo final a través de la columna y se enjuaga. Recoger las células T de alta CD62L como se describe en el paso 2.3.7 para la recolección de células CD25 +.
      2. centrifugar las células a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Las células Volver a suspender en 1 ml de R10 y cuentan para determinar el rendimiento. Diluir hasta 0,75-1 X10 6 células por ml en medio R10.
  4. Analizar pureza de las células mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
    1. estrategia de tinción FACS
      1. Para las células antes y después de todas las etapas de aislamiento, la mancha con la CD4-FITC, CD8a-PerCP-Cy5.5 (células T citotóxicas y auxiliares), y MHCII-PE (MHC de clase II de células que expresan).
      2. Para las células pre y post aislamiento CD25, tinción con CD4-FITC y CD25-PE (Tregs frente a otras células T auxiliares).
      3. Para las células pre y mancha el aislamiento posterior CD62L con CD4-FITC, PE-CD62L y CD44-APC (ingenuo frente a las células de memoria y efectoras T helper).
    2. Para cada lugar de análisis 10 5 células en un pocillo de una placa de pocillos de fondo en U 96. Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Se retira el medio y se lavan las células una vez con 200 l de DPBS. Centrifugadora que el anterior y se vierte fuera DPBS.
    3. Añadir 50 l de DPBS por pocillo y 0,5 l de cada anticuerpo (como se indica en 2.4.1) y se incuba a TA durante 30 min en la oscuridad para evitar la decoloración de la etiqueta fluorescente.
    4. Lavar las células 2x con DPBS como en 2.4.2 y analizan de inmediato en un citómetro de flujo a través de protocolos y directrices específicas para el instrumento a la mano.
      NOTA: Después de la etapa de aislamiento definitivo de una buena preparación, el 90-95% de las células seser CD4 + CD25 - células T de alta CD62L.

3. retroviral transducción de células T CD4 + activadas y su diferenciación en T específicas del ayudante subconjuntos

  1. La transducción retroviral
    NOTA: la integración retroviral y la expresión de genes requiere la división celular. Por lo tanto, las células T deben ser activados O / N.
    1. Mientras que el aislamiento de las células T ingenuas, recubrir una placa de cultivo tisular de 24 pocillos con anticuerpos anti-CD28 diluido en DPBS anti-CD3 y. Añadir 250 l por pocillo. Utilizar contra anti-CD3 de 1 g / ml. Utilice anti-CD28 a 2 g / ml, si en última instancia, pueden diferenciar células bajo Th0, Th1, Th2 y iTregs condiciones. Utilice anti-CD28 a los 10 g / ml para las condiciones Th9 y Th17. Incubar ~ 2 horas a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos.
    2. Justo antes de cultivar las células, eliminar la solución de anticuerpo y lavar la placa con ~ 250 l de DPBS por pocillo para eliminar unbound anticuerpo. Tenga cuidado de no dejar que la placa se seque por lo que procesar un máximo de 6 pocillos a la vez. Eliminar DPBS lavar y añadir 1 ml de células T CD4 + vírgenes en medio R10 en 0,75-1 x 10 6 células por ml. Activar las células S / N (14-16 h).
    3. Al día siguiente, centrifugar las células en la placa a 900 xg durante 5 min a 30 ° C para fijar las células al fondo de los pocillos.
    4. Recoger y guardar el medio con cuidado de no desplazar a las células, y reemplazar con 1 ml de sobrenadante del cultivo del virus preparada a partir del protocolo de producción de virus. No permita que las células se secan tan procesar un máximo de 4 pocillos a la vez.
      1. A cada pocillo añadir 1 l de 8 mg / ml de polibreno y 10 l de HEPES 1 M pH 7,5 para ayudar a la absorción de virus y prevenir la alcalinización significativo en el CO ambiente 2 durante el después de la centrifugación. centrifugar las células en placas a 900 x g durante 90 minutos a 30 ° C.
  2. La diferenciación de las células en especíFIC subconjuntos
    1. Retirar con cuidado el sobrenadante de cultivo de virus y reemplazar con 1 ml del medio recogidos anteriormente en la etapa 3.1.4, ya que contiene IL-2 y otros factores de crecimiento de células T. Añadir los reactivos indicados en la Tabla 2 y la cultura células durante 3-4 días para diferenciar las células en subconjuntos específicos.
  3. Análisis de las células
    1. Para la tinción intracelular de citoquinas, tratar las células con 1 g / ml cada uno de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e ionomicina durante 4 hr. Durante las últimas 2 horas de estimulación, añadir al menos 1 mg / ml de brefeldina A.
    2. Resuspender las células de la parte inferior de cada pocillo pipeteando arriba y abajo varias veces. Transferir aproximadamente 10 5 células a una placa de fondo en U 96 (generalmente 100 l desde el 1 ml de cultivo de células Th) para la fijación y tinción.
    3. Para la tinción de GFP, fijar las células con 100 l de paraformaldehído al 2% a temperatura ambiente durante 5 minutos exactamente, como un tiempo de incubación más largo será blanquear la GFP unand interferir con la tinción de Foxp3. Lavar las células mediante la adición de 100 l de DPBS a cada pocillo y se centrifuga a 600 xg, a 22 ° C durante 5 min. Se retira el sobrenadante.
      Precaución: El paraformaldehído es tóxico. Manejarlo en una campana extractora con la piel y los ojos.
    4. Fijar las células otra vez utilizando 100 l de tampón 1x fijación realizada desde el equipo de tinción Foxp3 (1 volumen de tampón de fijación a 3 volúmenes de diluyente). Se incuban las células durante 45 min a TA o, alternativamente, incubar a 4 ° C durante 16 hr.
    5. Después de la fijación, permeabilizar las células mediante la adición de 100 l de tampón de permeabilización de la misma kit. Incubar a temperatura ambiente durante 30-45 min y centrifugar a 600 xg, a 22 ° C durante 5 min.
    6. Para la tinción de anticuerpos, eliminar el tampón de fijación / permeabilización y añadir 50 l de tampón de permeabilización fresco. Añadir el anticuerpo requerido diluido en tampón de permeabilización a 0,5 l por 50 l de tampón por muestra. Incubar durante 30-45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad para evitar la decoloración de la gripeorescent etiqueta.
    7. Añadir 150 l de tampón de permeabilización y se centrifuga a 600 xg, a 22 ° C durante 5 min. Desechar el tampón de permeabilización y añadir 200 l de DPBS. El análisis en un citómetro de flujo a través de protocolos y directrices específicas para el instrumento a la mano.
      NOTA: Asegúrese de incluir controles adecuados para la tinción de citoquinas tales como la tinción con anticuerpos de control de isotipo, el análisis de las células no activadas o Th0 activados, etc.

Resultados

El éxito de este sistema experimental requiere poblaciones altamente puras de células T y de las preparaciones de retrovirus de alto título. Los resultados representativos se muestran aquí como ejemplos de experimentos exitosos. La figura 1 muestra la pureza típica de las poblaciones de pre y seleccionado enviar-en cada etapa del protocolo de aislamiento de células helper T naïve. Figura 2 y 3 ilustran el análisis de la producción de retrovirus a través de la expresión de GFP en las células HEK 293T transfectadas (Figura 2) y las células T transducidas (Figura 3). Las eficacias de transfección de las células HEK 293T pueden variar significativamente con diferentes construcciones retrovirales, pero esto a menudo no se correlaciona con el nivel de producción observado retrovirus con el número de células T + GFP. Además, el número de células GFP + T puede variar dependiendo de las condiciones de polarización. Además, el mnivel de expresión de GFP ean y el gen insertado puede variar en función del número de copias de virus integrado, el efecto del sitio de integración en la transcripción, y los mecanismos de regulación post-transcripcional que afectan a la transcripción viral.

Por último, la figura 4 muestra algunos resultados típicos que hemos observado con la diferenciación de células T ayudantes cuando el miARN miR-15b / 16 se sobreexpresa. Estos resultados muestran algunas de las variables que puede ocurrir dentro de un experimento individual efectos tan verdaderos deben justificarse mediante un análisis estadístico de múltiples experimentos repetidos utilizando diferentes preparaciones de células T auxiliares. En estos experimentos las respuestas Th2 pueden ser difíciles de observar en la línea C57BL / 6 se utiliza aquí, ya que son propensos a las respuestas Th1. Asimismo, IL-9 tinción puede ser difícil de detectar por encima del fondo. Por lo tanto, es imperativo que hacer controles de isotipo y establecer una compensación adecuada para garantizar la correcta gating de expresión de citoquinas. En nuestros resultados hemos encontrado que miR-15b / 16 aumenta la inducción iTreg mediante la inhibición de la vía de señalización a través de la supresión de la expresión de la Rictor componentes y mTOR 15 mTOR. miR-15b / 16 veces puede influir Th0, Th1, y la diferenciación Th17 en experimentos individuales, pero no hay ningún efecto significativo cuando se examinó en varios experimentos repetidos. En contraste miR-15b / 16 sobreexpresión no suprimir significativamente la diferenciación Th9 (véase la referencia 18).

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Figura 1. pureza típica de las células T colaboradoras en cada etapa de aislamiento. Citometría de flujo Representante resultados de los antígenos indicados se muestran desde la puerta de células vivas designadas en la dispersión frontal (FSC) y parcelas de dispersión lateral (SSC). Selección negativa (A) pre y post-CD4. perfiles de expresión de CD4,CD8a, y MHCII se muestran. Estos ilustran el enriquecimiento de células T auxiliares y la pérdida de las células T citotóxicas y de MHC de clase II de las células que expresan. Una buena purificación debe resultar en ~ células T CD4 + 90% en esta etapa. (B) Selección de CD25. A la izquierda están los perfiles de expresión de CD4, CD8a, y MHCII, ya la derecha son la expresión de CD4 y CD25 perfiles de pre y selección posterior. En este punto> 95% de CD25 células seleccionadas negativamente debe ser CD4 + CD25 -. (C) CD62L selección. CD4, CD8a, y MHCII perfiles de expresión se muestran a la izquierda. A la derecha de los perfiles de expresión de CD62L y CD44 se comunican para las celdas seleccionadas pre y post-CD62L junto con CD4 y CD62L perfil de expresión de células de correos seleccionado. Después de la selección CD62L se eliminan virtualmente todas las células de memoria (CD44 +) dejando una población altamente enriquecida de células T colaboradoras ingenuas que contiene 10-15% de células efectoras (CD62L baja). Para todosperfiles de FACS, configuraciones equivalentes y escalas de un parámetro específico se mantuvieron a lo largo. Los números representan el porcentaje de células dentro de una población cerrada. La ligera disminución en el tamaño de las células después de la selección inicial es presumiblemente debido a la tensión mecánica durante el protocolo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. Análisis de células HEK 293T transfectadas de retrovirus. Expresión de GFP se muestra en las células HEK 293T que eran o no transfectadas o transfectadas y se analizaron después de la recogida de los sobrenadantes de cultivo virales. análisis de GFP se realiza en células vivas de la puerta en el FSC y SSC trama en el primer panel. Los números representan el porcentaje de células GFP + dentro de la región acotada. t típicaeficiencias ransfection oscilan entre 30-90%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. Análisis de células T auxiliares de retrovirus transducidas. Expresión de GFP se muestra en las células T helper-retrovirales transducidas después de la diferenciación en Th0, Th1, Th2, Th9, Th17, y las condiciones de polarización Treg durante tres días. El análisis fue cerrada en células vivas y activos indicados en el panel de FSC / SSC. Las eficacias de transducción pueden variar entre 10-75% dependiendo de la construcción y de las condiciones de polarización. Del mismo modo, la intensidad media de fluorescencia de la expresión de GFP puede variar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. Efecto de miR-15b / 16 sobreexpresión de ayudante de diferenciación de células T en diferentes condiciones de polarización. Perfiles de citoquinas representativos se muestran en la GFP + población de células a partir de la figura 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Tabla 1:. Los tampones utilizados en estos protocolos Haga clic aquí para descargar la tabla como una hoja de cálculo de Excel.

Ayudantecondiciones de polarización de las células T
Th0 anti-IL-4 5 mg / ml
anti-IFN-γ 5 mg / ml
Th1 recombinante-IL-12 20 ng / ml
anti-IL-4 5 mg / ml
Th2 IL-4 recombinante 40 ng / ml
anti-IFN-γ 5 mg / ml
Th9 TGF-β recombinante 2,5 ng / ml
IL-4 recombinante 40 ng / ml
anti-IFN-γ 10 mg / ml
Th17 TGF-β recombinante 2,5 ng / ml
IL-6 recombinante 50 ng / ml
anti-IFN-γ 5 mg / ml
anti-IL-4 5 mg / ml
anti-IL-2 5 mg / ml
Tregs TGF-β recombinante 2,5 ng / ml
IL-2 recombinante 5 ng / ml

Tabla 2: T colaboradoras subconjunto de células condiciones de polarización.

Discusión

Retrovirales sobreexpresión de los genes mediada es una forma poderosa para analizar la función de las células T auxiliares, ya que su desarrollo y la función es a menudo determinado por el nivel de expresión de los reguladores clave. Sin embargo, se requiere una interpretación cautelosa de los resultados, ya que los niveles de expresión significativamente superiores a los del gen endógeno pueden introducir muchos artefactos. Por lo tanto, esta técnica se debe combinar con otros para comprobar la relevancia de la función. Por ejemplo, la sobreexpresión debe complementarse con una expresión reducida mediante siRNAs gen knockouts o si está disponible. Con miRNAs, complementamos experimentos de sobreexpresión con los de bloqueo usando virus que sobreexpresan miRNA artificial orientada a sitios que actuaban como inhibidores competitivos para un miARN 15. células transducidas retrovirales también se pueden utilizar en ensayos bioquímicos que implican ARN y análisis de proteínas. Sin embargo, una limitación importante de estos experimentos es la eficiencia de transducción de resulting en una población mixta de células transducidas y no transducidas. Por lo tanto, estos ensayos lo más probable es requerir la clasificación de la GFP + población. Finalmente, en ensayos in vitro de la diferenciación se deben combinar con los experimentos in vivo, y una forma esto se puede lograr es mediante la transferencia adoptiva de las células T transducidas en ratones y después de su diferenciación y su efecto sobre la respuesta inmune.

Una de las limitaciones principales de este sistema es el tamaño del genoma de ARN que puede ser empaquetado en la cápside retroviral. En nuestra experiencia, el tamaño máximo de inserción para el sistema MIG retroviral que da buena producción de virus es 3-3,5 kb. Por lo tanto, los genes de mayor tamaño no pueden ser analizados con este sistema, ya que dan pobres títulos de virus. Sin embargo, la mayoría de los genes son más pequeños que este tamaño por lo que este sistema es útil para una amplia variedad de estudios de genes.

Con la transducción retroviral, varias alternativas dentro de estos protocose han utilizado ls. Muchos investigadores han utilizado líneas celulares de empaquetamiento que expresan de forma estable los genes retrovirales (para el Ejemplo de Referencia 16). Sin embargo, se han obtenido los títulos más altos utilizando células HEK 293T estándar con la co-transfección del vector del virus auxiliar PCL-Eco. Aislamiento de células T auxiliares naïve también se puede lograr a través de clasificación de células en lugar de el protocolo de la columna de talón y la separación celular magnética, pero esto requiere el acceso a un clasificador de células, y los costes de tiempo de tipo son típicamente más altos que los reactivos de talón. Por último, hay variaciones en condiciones de activación que se utilizan para diferenciar las células T auxiliares en los diferentes subconjuntos. Por ejemplo, la estimulación de TCR de las células durante demasiado tiempo antes de la exposición a condiciones de inducción de Treg puede inhibir su inducción 16. Esto puede ser un problema porque la expresión retroviral requiere la división celular inducida por la estimulación de las células. Sin embargo, hemos encontrado que la inducción de Treg eficiente el uso de este protocolo con S / N activación antes de la transducción retroviral.

Dentro de estos protocolos, la aplicación exitosa requiere de varios factores. preparaciones de retrovirus con alta titulación necesitan transfección eficiente de las células HEK 293T ADN tan alta calidad y precisión preparado 2x HBS son importantes. Además, la densidad celular de las células HEK 293T necesita ser aproximadamente 50% en el punto de transfección debido a la buena expresión del ADN transfectado requiere que las células están creciendo activamente, y esto se inhibe si las células son demasiado escasa o densa. Las células en la densidad óptima durante la transfección deben llegar a la confluencia en algún momento durante las etapas de recolección de virus, pero seguirán produciendo reservas de virus de alto título hasta el final de la última colección. Diferenciación eficiente de las células T auxiliares requiere buena calidad celular para asegurar que las células aisladas son a la pureza se ilustra en la Figura 1. Del mismo modo, la calidad de las células depende de la fr ratonesom que se aislaron. Para estos estudios, hemos utilizado de 6-8 semanas de edad C57BL / 6 ratones. Los ratones más viejos pueden tener células menos ingenuas, y otras cepas pueden diferir en su diferenciación. Por ejemplo, los ratones BALB / c son más propensos a las respuestas Th2 que C57BL / 6 ratones 17 de manera que se ha indicado anteriormente, C57BL / 6 células T pueden ser difíciles de inducir una respuesta Th2. Además, cualquiera de las condiciones de diferenciación pueden variar ligeramente de un laboratorio a otro, y el efecto de la sobreexpresión del gen sólo se pondrá de manifiesto en condiciones subóptimas por lo concentraciones de citoquinas en las diversas condiciones de polarización pueden necesitar ser valorada. Finalmente, los efectos del gen sobreexpresado o las condiciones de polarización en la proliferación celular pueden influir en la eficacia de transducción así efectos de medición del gen de interés pueden requerir la optimización de la sincronización y la concentración de reactivos de polarización. La optimización de todos estos factores debe conducir a resultados informativos con este sistema.

Divulgaciones

Los autores no tienen ningún interés contradictorio en la publicación de este trabajo.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una beca del Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC) (BB/H018573/1) y una beca de BD Biosciences.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
RPMISigmaR8758
DMEMSigmaD5671
Penicilina Solución de estreptomicinaSigmaP4333
L-GlutaminaSigmaG7513
β-mercaptoetanolSigmaM3148
DPBSSigmaD8537
VectorMIGAddgenePlásmido 9094
pCL-Eco vectorAddgenePlásmido 12371
Filtro de célulasBD Falcon352350
Cuentas magnéticas ratón CD4 kit de células Invitrogen (Dynabeads)11415D
Perlas de estreptavidina Miltenyi Biotech130-048-102
Columnas de separación celular MSMiltenyi Biotech130-042-201
LS Columnas de separación celularMiltenyi Biotech130-042-401
CD25 Biotenilado MAb BD Biosciences85059clon 7D4
CD62L Biotenilado MAb BD Biosciences553149clon MEL-14
Polybrene (bromuro de hexadimetrina)Sigma107689
Anti-CD3eBiosciences16-0031-85clon 145-2C11 
Anti-CD28eBiosciences16-0281-85clon 37.51 
Anti-IL-4BD Biosciences559062clon 11B11
Anti-IFN-gammaBD Biosciences559065clon XMG1.2
Anti-IL-2BD Biosciences554425clonJES6-5H4
IL-12 recombinante p70eBiosciences14-8121
IL-4 recombinanteBD Biosciences550067
TGF-beta recombinanteeBiosciences14-8342-62
IL-6 recombinanteeBiosciences14-8061
IL-2 recombinanteeBiosciences14-8021
PMA SigmaP8139
IonomicinaSigmaI0634
Brefeldin AeBiosciences00-4506
ParaformaldehídoSigma16005El paraformaldehído es tóxico, por lo que debe tener la precaución adecuada al manipularlo...
Juego de tampones de tinción Foxp3eBiosciences00-5523
Anti-CD4  FITCeBiosciences11-0041clon GK1.5 
Anti-CD8a perCP-cy5.5eBiosciences45-0081-80clon 53-6.7 
Anti-MHCII PEeBiosciences12-0920  clon HIS19
Anti-CD25 PEeBiosciences12-0251-82  clon PC61.5 
Anti-CD62L PEeBiosciences12-0621-82clon MEL-14 
Anti-CD44 APCeBiosciences17-0441clon IM7 
Anti-IFN-gamma FITC eBiosciences11-7311-81clon XMG1.2
Anti-IL-4 PEBD Biosciences554435clon 11B11
Anti-IL-9 PE o APCeBiosciences/Biolegend50-8091-82/514104clon RM9A4
Anti-IL-17a PEBD Biosciences559502clon TC11-18H10
Anti-Foxp3  APC o PEeBiosciences17-5773-82/12-5773-80 clon FJK-16s
NaClSigmaS7653
KClSigmaP9333
Na2HPO4-2H2OSigma71643
Dextrosa/GlucosaSigmaG7021
HEPES, ácido libreSigmaH3375
NH4ClSigmaA9434
EDTA disódicoSigma D2900000
KHCO3Sigma237205
  CaCl2 SigmaC5670

Referencias

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