Detección de Trypanosoma brucei Variant glicoproteína de superficie de conmutación por Magnetic Activated Cell Sorting y Citometría de Flujo

Resumen

Los tripanosomas africanos cultivados in vitro experimentan variación antigénica a una tasa baja, de modo que las poblaciones están formadas por parásitos que expresan un tipo de glicoproteína de superficie (VSG) variante dominante y una pequeña población de variantes "conmutadas". Este protocolo describe un método rápido para detectar y cuantificar estas poblaciones.

Resumen

Trypanosoma brucei, un parásito protozoario que causa tripanosomiasis africana humana y animal (conocida como enfermedad del sueño y nagana, respectivamente) circula entre un vector tse-tsé y un huésped mamífero. Evade el sistema inmunitario del huésped de los mamíferos cambiando periódicamente la glicoproteína de superficie densa y variante (VSG) que cubre su superficie. La detección de la variación antigénica en Trypanosoma brucei puede ser engorrosa y laboriosa. Aquí, presentamos un método para cuantificar el número de parásitos que se han "cambiado" para expresar un nuevo VSG en una población dada. Los parásitos se tiñen primero con un anticuerpo contra el VSG inicial y luego se tiñen con un anticuerpo secundario unido a una perla magnética. A continuación, los parásitos que expresan la VSG inicial se separan del resto de la población haciendo pasar los parásitos por una columna unida a un imán. Los parásitos que expresan el VSG dominante de inicio se retienen en la columna, mientras que el flujo contiene parásitos que expresan un nuevo VSG, así como algunos contaminantes que expresan el VSG de inicio. Esta población de flujo se tiñe de nuevo con un anticuerpo marcado con fluorescencia contra el VSG inicial para marcar contaminantes, y yoduro de propidio (PI), que marca las células muertas. Un número conocido de perlas de recuento absolutas que son visibles por citometría de flujo se agregan a la población de flujo continuo. La relación entre las perlas y el número de células recogidas se puede utilizar para extrapolar el número de células de toda la muestra. La citometría de flujo se utiliza para cuantificar la población de conmutadores mediante el recuento del número de células PI negativas que no se tiñen positivamente para el VSG inicial y dominante. A continuación, se puede calcular la proporción de conmutadores en la población utilizando los datos de citometría de flujo.

Introducción

El parásito protozoario Trypanosoma brucei, es un agente causal de las enfermedades que afectan a los seres humanos (a través de brucei gambiense y Trypanosoma rhodesiense Trypanosoma brucei) y animales (a través de Trypanosoma brucei brucei) en toda el África subsahariana. Se transmite al huésped de mamífero a través de la saliva de la mosca tsé-tsé vector. Tanto humanos como la tripanosomiasis africana animales causan una carga económica grave en las regiones endémicas, y pocos fármacos están disponibles o en desarrollo para tratar cualquiera de las enfermedades. La comprensión de los mecanismos de evasión inmune es crítico para el desarrollo de fármacos para la tripanosomiasis. La variación antigénica de la densa, la variante glicoproteína de superficie (VSG) la capa que cubre el parásito es uno de los principales medios por los cuales T. brucei evade la respuesta de anticuerpos de los mamíferos. Existen aproximadamente 2000 variantes del gen VSG en el genoma tripanosoma, pero sólo uno se transcribe en un momento dado de una de ~ 15 expressitios de Sión. 'Cambio' de la VSG expresada puede ocurrir ya sea mediante la copia de un gen VSG en el sitio de expresión activa, o por la activación transcripcional de un sitio de expresión previamente silenciosa (revisado en ^1).

Aunque mucho trabajo se ha dedicado a la comprensión de la variación antigénica en T. brucei, los factores que influyen en la frecuencia de conmutación son aún poco conocidos. Los estudios realizados hasta la fecha se han visto obstaculizados por el hecho de que mientras que la conmutación se produce estocásticamente in vitro, frecuencias de conmutación son muy bajos, del orden de 1 a unos 10 ⁶ células ^2. Esto hace que sea difícil de medir si un determinado factor aumenta o disminuye la frecuencia de conmutación, ya que el cambio es difícil de detectar en el primer lugar. Antes de 2009, los métodos para el aislamiento de los conmutadores en una población dada eran muy largo y laborioso. Estas células pases a través de tripanosomas ratones inmunizados contra la VSG dominante y luego, la cosecha incluidosun día más tarde ^3, o contar cientos de células por inmunofluorescencia ^4,5. Otra estrategia se basa en la selección para la resistencia a los medicamentos para aislar conmutadores ^6. Debido a que los tripanosomas africanos cultivadas in vitro se hacen típicamente de una gran población que expresa una variante importante, y una población mucho más pequeña de conmutadores que expresan variantes alternativas, nos referimos a la variante importante en todo este documento como la VSG dominante, de partida. Al hacerlo, que de ninguna manera deseamos dar a entender que esta importante variante tiene una mayor aptitud que otras variantes en la población.

Aquí se describe un método que se puede medir de manera fiable el número de tripanosomas que expresa un VSG no dominante en una población dada en 3-4 horas. Este método es particularmente útil para cuando se quiere determinar si una manipulación genética dado o tratamiento con fármacos aumenta el número de células de conmutación en una población. En lugar de liberar a la población de células que expresan el dominante, a partir VSG través de las drogas o por medios inmunológicos, estas células son eliminadas por primera recubrimiento con perlas magnéticas acopladas al anticuerpo contra la VSG dominante y luego aislarlos en una columna magnética. La población de conmutación se recoge entonces en el flujo a través y se tiñó otra vez con un anticuerpo marcado anti-VSG fluoróforo para identificar contaminantes. La cuantificación se logra mediante la adición de un número definido de contar bolas absolutas para cada muestra de manera que la relación de perlas a células se puede determinar y se usa para cuantificar el número de conmutadores en la población ^7.

Protocolo

NOTA: Durante todo el procedimiento, es necesario para mantener las células en hielo. medios fríos también deben utilizarse en todas partes.

La recolección de la muestra 1.

1. Crecer Lister 427 tripanosomas cepa del torrente sanguíneo a una densidad de 0,5 - 1 millones / ml. Lo mejor es comenzar culturas con un pequeño número de parásitos. Centrifugar 50 x 10 ⁶ células / muestra durante 10 minutos a 1.500 x g. Asegúrese de dejar 1 x 10 ⁶ células en cultivo para su uso posterior como controles de anticuerpos positivos y negativos.
   NOTA: Este protocolo también se puede utilizar en tripanosomas aisladas a partir de sangre de animales (véase la discusión para los detalles).
2. Pipeta o verter fuera la mayor parte del sobrenadante (dejar alrededor de 750 l). Transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
3. Girar las células a 4 ° C durante 4 min a 5.200 xg en una microcentrífuga y eliminar el sobrenadante.

2. El etiquetado Magnética

1. Resuspender las células en 150 l de medio de cultivo (HMI-9 wiTH suero por ejemplo) + anticuerpo anti-VSG primario a la dilución apropiada.
   NOTA: El anticuerpo anti-VSG está hecho en casa y se utiliza en una dilución de 1:50. Es importante usar un anticuerpo primario anti-VSG que no está marcado con un fluoróforo.
2. células Vortex utilizando un vórtice adaptador-60 a una velocidad de 6-8 en una habitación fría a 4 ° C durante 10 min. Se lava con 800 - 1.000 l fría HMI-9 con suero.
3. Giran a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y aspirar el sobrenadante. Se lava con 1 ml de HMI-9 con suero y girar como antes. Aspirar el sobrenadante. sedimento se vuelve a suspender en 100 l de HMI-9 con suero.
4. Añadir 110 l de células activadas por la clasificación magnética microperlas (MSC). Utilice anti-ratón, anti-conejo, o perlas anti-biotina como apropiado para el anticuerpo anti-VSG primaria. Mezclar bien. células de vórtice en una habitación fría a 4 ° C durante 10 min.
5. Mientras que las células se vórtex, configurar una columna de separación / muestra magnético activado en un imán separación. Asegúrese de tener una rereceptáculo (se utiliza un tubo de centrífuga de 15 ml) en la columna para recoger el flujo continuo. La instalación del equipo en una habitación fría.
6. Añadir 2 ml de HMI-9 con suero a la columna de primera. Después de cebar lugar un tubo de centrífuga de 15 ml en la columna para recoger flujo a través de cada muestra.
7. Después de los 10 minutos de incubación en el paso 2.4, añadir 800-1.000 l fría HMI-9 con suero. Giran a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y retirar el sobrenadante para eliminar el anticuerpo no unido. Lavar con 1 ml de HMI-9 con suero y repetición dejando 100 l del sobrenadante.
8. Flick el tubo de centrífuga vigorosamente e inspeccione visualmente el tubo para asegurarse de que el sedimento se resuspendió completamente. Añadir 1 ml de HMI-9 con suero y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que las células se volvieron a suspender bien.

3. Separación Magnética

1. Asegúrese de que las columnas están preparados como se describe anteriormente. Aplicar las células a la columna. Suma de flujo continuo con las células que expresan el VS no dominanteG. 1 ml de medio + tripanosomas típicamente se lleva a 6 - 7 min a fluir a través de la columna.
2. Lavar 2 veces con 1 ml de HMI-9 con suero y recoger de flujo continuo en el mismo tubo como en el paso 3.1.
3. flujo a través Divide (3 ml) en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
   NOTA: Estas se pueden combinar más tarde o medio se pueden utilizar para aislar el ARN, etc.
4. Retirar la columna del imán. Añadir 3 ml de HMI-9 con suero a la columna y hundir la columna en un tubo de centrífuga de 15 ml para obtener células que expresan la partida, dominante VSG. Eliminar 300 l de material eluido para su posterior análisis. Mantener estas células en hielo.
5. Para su uso como un positivo y un control negativo, una duración aproximada de 1 millón de células del cultivo a partir de células de control cada vez mayor a 37 ° C (los que no se espera que cambie con frecuencia) y pipeta de ellos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   NOTA: Las células de control positivo se tiñeron con anticuerpo marcado con fluoróforo en el paso 4.1. Negativo células de control remaen sin teñir en el resto del protocolo.
6. muestras de giro de flujo continuo y positivo muestra de control de anticuerpos a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y eliminar el sobrenadante.
   NOTA: Otra alícuota 300 l de células eluidas se puede utilizar como un control positivo para la tinción de anti-VSG.

4. La tinción para identificar los contaminantes y de Conmutación

1. muestras de flujo a través de Resuspender las células de control positivo y en 100 l de HMI-9 con suero +, anticuerpo primario, marcada con fluoróforo anti-VSG a la dilución apropiada.
   NOTA: El anticuerpo anti-VSG marcado está hecho en casa y se utiliza en una dilución de 1: 1000. El fluoróforo marcado, anti-VSG puede ser de la misma fuente que el anticuerpo no marcado en la separación MACS step.There debe ser de 3 ml de muestra de flujo a través de dos tubos de microcentrífuga siguientes paso 3.5.
2. Para analizar todo el flujo de paso por citometría de flujo, se combinan las bolitas en los dos tubos de microcentrífuga mientras que re-susen espera de las muestras en 100 l de HMI-9 con el anticuerpo anti-VSG + suero. Mezclar bien.
3. células de vórtice en una habitación fría a 4 ° C durante 10 min. Añadir 800 - 1000 l fría HMI-9 con suero. muestras de giro a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y eliminar el sobrenadante para eliminar el anticuerpo no unido.
4. Lavar las células con 1 ml de HMI-9 con suero. muestras de giro a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y eliminar el sobrenadante. Durante este último giro, centrifugar las muestras eluidas-desde el paso 3.4 y la muestra de control negativo.
5. Volver a suspender todo el filtrado y muestras eluidas en: 148,5 l HMI-9 con suero, 25 l contar bolas absoluto y 1,5 l solución yoduro de propidio (175 l en total) tinción. Volver a suspender las muestras de control positivas y negativas de anticuerpos en 175 l HMI-9 con suero. Asegúrese de registrar el número de contar bolas absolutos / 25 l para el lote particular usado.
6. Ejecutar todas las muestras a través de un citómetro de flujo y recoger datos. Las células muertas manchar como PI ^{+. Los contaminantes se tiñen como PI - VSG +. Sensores, se tiñen como PI - VSG - 8.}
7. Calcular las frecuencias de conmutación utilizando citometría de flujo de datos.
   NOTA: Para obtener instrucciones sobre cómo calcular las frecuencias de conmutación, por favor consulte el archivo suplementario Citometría de Flujo Calculations.docx y en la Tabla 1.

Resultados

El método aquí descrito se utilizó para demostrar que las roturas de doble hebra dentro del sitio de expresión VSG aumentado el número de conmutadores en una población ^8. Aquí, mostramos los resultados representativos de una población de tripanosomas que han sido inducidos de manera similar para generar una rotura de doble cadena en el lugar de expresión. Comparamos estos tripanosomas a aquellos que no han sido inducidos para generar una rotura de doble cadena. La figu...

Discusión

Con respecto a la técnica experimental, el componente más crítico del protocolo es mantener todas las muestras frío. Los tripanosomas internalizan muy rápidamente anticuerpo unido a su superficie ^9, pero este proceso es dependiente de la motilidad, y no influye en el ensayo, siempre y cuando las células se mantienen a 4 ° C. Todas las muestras deben mantenerse siempre en hielo, y pipeteo debe hacerse rápidamente para minimizar la exposición al ambiente de laboratorio C 25 °. Fría HMI-9 con suero debe estar di...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
anticuerpo anti-VSG no marcado	n/a	n/a	anticuerpo VSG se fabrica internamente
anticuerpo anti-VSG marcado con fluoróforo	n/a	n/a	El anticuerpo VSG se fabrica internamente
Medios HMI-9	n/a	n/a	HMI-9 se fabrica
internamente Yoduro de propidio	BD Pharmingen	556463
CountBrillantes perlas de conteo absolutas	Thermofisher Columnas Scientific	C36950
LD	Miltenyi Biotech	130-042-901
Imán MACS	Miltenyi Biotech	130-042-303
Separador magnético MACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
adaptador de vórtice-60	ThermoFisher científico	AM10014
citómetro de flujo	Coulter	n/a
software de análisis para citómetros de flujo	FloJo	n/a