Análisis de la importación de proteínas en cloroplastos aislados de las plantas estresadas

Resumen

Aquí se describe un nuevo método para estudiar la importación de proteínas en cloroplastos aislados bajo estrés. El método es rápido y sencillo, y se puede aplicar para estudiar las consecuencias de diferentes condiciones de estrés para la importación de proteínas de cloroplastos, y los mecanismos de regulación correspondientes.

Resumen

Los cloroplastos son orgánulos con muchas funciones vitales en las plantas, que incluyen no sólo la fotosíntesis, pero otras numerosas funciones metabólicas y de señalización. Por otra parte, los cloroplastos son críticos para la respuesta de las plantas a diferentes estreses abióticos, tales como la salinidad y estrés osmótico. A cloroplasto puede contener hasta ~ 3.000 diferentes proteínas, algunas de las cuales son codificadas por su propio genoma. Sin embargo, la mayoría de las proteínas del cloroplasto están codificados en el núcleo y se sintetiza en el citosol, y estas proteínas necesitan ser importados en el cloroplasto través translocons en las membranas de la envoltura del cloroplasto. Estudios recientes han demostrado que la importación de proteínas de cloroplastos puede ser regulada de forma activa por el estrés. Para investigar bioquímicamente como la regulación de la importación de proteínas en condiciones de esfuerzo, hemos desarrollado el método descrito aquí como un procedimiento rápido y sencillo que se puede conseguir fácilmente en cualquier laboratorio. En este método, las plantas se cultivan en conditio normalesns y luego se exponen a condiciones de estrés en cultivo líquido. El material vegetal se recoge, y los cloroplastos son luego liberados por homogeneización. El homogenado crudo se separa por centrifugación en gradiente de densidad, lo que permite el aislamiento de los cloroplastos intactos. rendimiento del cloroplasto se evalúa mediante recuento, y la integridad del cloroplasto se examina bajo un microscopio. Para los ensayos de importación de proteínas, cloroplastos purificados se incubaron con ³⁵ S radiomarcado in vitro traducido proteínas precursoras, y los experimentos de tiempo-por supuesto se llevan a cabo para permitir comparaciones de las tasas de importación entre los genotipos bajo condiciones de estrés. Se presentan los datos generados usando este método, que muestran que la tasa de importación de proteínas a los cloroplastos de un mutante regulador se altera específicamente en condiciones de estrés osmótico.

Introducción

Los cloroplastos son muy abundantes orgánulos que existen en los tejidos verdes de las plantas. Son bien conocidos por su papel fundamental en la fotosíntesis, un proceso que utiliza energía de la luz para convertir el dióxido de carbono de azúcar y contribuir así a casi toda la vida en la tierra ^1. Además, los cloroplastos (y la familia más amplia de orgánulos relacionados llamados plástidos) desempeñan muchas otras funciones vitales en plantas, incluyendo la biosíntesis de aminoácidos, lípidos, pigmentos, y la detección de las señales ambientales tales como la gravedad y el desafío patógeno. La fotosíntesis genera especies reactivas del oxígeno (ROS) como subproductos, que en ciertas circunstancias tienen una función muy útil, pero si produce en exceso puede causar efectos perjudiciales o incluso letales. La sobreproducción de ROS está particularmente promovido por condiciones ambientales adversas, y por lo tanto los cloroplastos están estrechamente relacionadas con las respuestas al estrés abiótico, tales como la salinidad y estrés osmótico ^2.

chloroplasts tienen una estructura compleja. Cada cloroplasto está rodeado por una capa exterior de doble membrana llamada el sobre, que consta de membranas exterior e interior. Internamente, hay otro sistema de membrana llamada los tilacoides, donde las reacciones luminosas de la fotosíntesis tienen lugar. Entre los dos sistemas de membrana hay una llamada compartimento acuoso el estroma, que está implicado en la fijación de carbono. Un cloroplasto puede contener un máximo de ~ 3.000 proteínas diferentes, y la gran mayoría de estas proteínas se sintetizan en el citosol en forma de precursor y necesitan ser importados en el orgánulo través translocons proteínas dedicados en las membranas de la envoltura ^1. Curiosamente, trabajos recientes han indicado que la importación de proteínas del cloroplasto se regula de forma activa, y por lo tanto es capaz de ejercer un importante nivel de control sobre el proteoma del cloroplasto. Por ejemplo, se informó en 2015 de que la importación de proteínas puede responder al estrés abiótico a través de la regulación directa de la abundancia de THe translocon en la membrana envolvente exterior de los cloroplastos (TOC) por el sistema ubiquitina-proteasoma ^3.

El uso de los cloroplastos y purificados sintetizados in vitro proteínas precursoras, la importación de proteínas puede ser reconstituido in vitro ^4,5. Por lo tanto, los métodos in vitro pueden utilizarse para evaluar las tasas de importación en las diferentes plantas mutantes ^6, que ha sido un enfoque crítico para el análisis de componentes putativos de la maquinaria de importación de proteínas y para descubrir los mecanismos que subyacen a la importación de proteínas y su regulación. Además, los cloroplastos pueden ser procesados con un fraccionamiento adicional o la digestión de la proteasa, después de la importación in vitro, lo que puede facilitar estudios sobre la localización sub-organoides y la topología de proteínas de cloroplastos ^7,8.

Para el estudio de la regulación de la importación de proteínas por el estrés, hemos modificado nuestro método de aislamiento de cloroplastos rutina como describiremosaquí. Es importante destacar que los cloroplastos se aislaron de plantas que habían sido cultivados en el estándar de Murashige y Skoog (MS) medio de agar durante 8 días y luego transferidas a un medio MS líquido suplementado con factor de estrés, proporcionando un tratamiento de estrés relativamente corto controlada. El rendimiento y la competencia de los cloroplastos aislados de tales plantas tratadas por estrés son compatibles con el de aguas abajo en un ensayo de importación de proteínas in vitro ^3. Además del protocolo de aislamiento de cloroplastos, presentamos nuestro método de rutina para la importación de proteínas in vitro, lo cual ha demostrado ser robusta y es ampliamente utilizado ^3,9-12.

Protocolo

1. Crecimiento de las plantas de Arabidopsis y el Tratamiento del estrés

1. Preparar 1 L de Murashige y Skoog (MS) mediante la adición de 4,3 g de MS Basal Sal mezcla, 10 g de sacarosa, 0,5 g de 2- (N-morfolino) etano sulfónico (MES) a agua desionizada hasta 1 L, y ajustar el pH a 5,7 con hidróxido de potasio (KOH). Añadir 6 g de fitoagar y autoclave durante 20 minutos a 120 ° C.
   1. Antes de la solidificación, se vierte el medio en placas de Petri redondas (diámetro 9 cm, altura 1,5 cm, con 20 a 25 ml de medio MS por placa). Dejar que las placas se sequen durante ~ 1 h en una campana de flujo laminar antes de cerrar los párpados.
2. Coloque semillas de Arabidopsis thaliana en un tubo de ensayo 1,5 ml para la esterilización de la superficie mediante la adición de 1 ml de etanol al 70% (v / v) que contiene 0,02% (v / v) de Triton X-100 y continua agitación durante 5 a 10 min. Para cada genotipo / condición, se preparan 10 placas de Petri cada uno con ~ 100 - 150 plantas de semillero.
3. Espere unos 10 s hasta que las semillas se depositan en elparte inferior del tubo, y luego se descarta el sobrenadante mediante pipeteo. Añadir 1 ml de etanol al 100%, y agitar el tubo de nuevo durante 10 minutos.
4. Preparar la campana de flujo laminar, mientras que las semillas están esterilizando. Tome una hoja de papel de filtro por muestra, doblar por la mitad para facilitar la siembra, y sumergirlo en etanol al 100% en la campana. Espere hasta que se seque por completo. Tenga en cuenta que el etanol 100% se utiliza ya que se evapora más rápidamente que 70% de etanol.
5. La transferencia de las semillas sobre el papel de filtro con la pipeta 1 ml usando una punta de pipeta de corte ~ 5 mm del extremo fino. Deje que se seque, que debería tener alrededor de 10 - 15 min.
6. Sembrar ~ 100 - 150 semillas esterilizadas de manera uniforme sobre cada placa Petri medio MS, y sellar cada placa con cinta quirúrgica.
7. Almacenar las placas boca abajo a 4 ° C por 2 - 4 d fomentar y sincronizar la germinación. semillas de edad pueden necesitar permanecer más tiempo (hasta una semana) a 4 ° C.
8. La transferencia de las placas a una cámara de cultivo de tejidos vegetales y dejarlos boca arriba.Cultivar las plantas de 8 d bajo un ciclo de día largo (16 h 100 mol · m ^{- 2} · s ^{- 1} luz, 8 h de oscuridad) a 20 ° C.
9. Para el tratamiento de estrés, cuando las plantas son 8 d de edad, en la campana de flujo, transferirlos desde el medio de agar, raspando suavemente con la mano con guantes de etanol-esterilizado, en un matraz esterilizado de medio MS líquido que contiene el factor de estrés (por ejemplo, , 200 mM de manitol). Evitar realizar sobre un medio de agar. Cubrir la boca matraz con papel esterilizado y permitir que las plantas para crecer en las mismas condiciones que en el paso 1.8 para una 2 d adicionales en un agitador orbital con agitación suave (~ 100 rpm).

2. Realización de una proteína precursora de Transcripción in vitro / Traducción

Nota: Este protocolo supone el uso de Arabidopsis fotosistema I subunidad precursor D (pPsaD) como la plantilla / preproteína, pero el método es compatible con los demás.

1. Clonar la secuencia codificante (CDS) de pPsaD en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector pBluescript II SK (o cualquier otro vector similar con un promotor T7 aguas arriba) ^13. Se purifica el plásmido (pBSK-pPsaD) utilizando un kit de aislamiento de ADN y verificar la secuencia mediante secuenciación de ADN.
   NOTA: Todos estos pasos emplean técnicas de clonación molecular convencionales.
2. Determinar la concentración de ADN de plásmido pBSK-pPsaD usando un espectrofotómetro ajustado a medir la absorbancia a 260 nm. Diluir el plásmido a una concentración final de 10 ng / mL.
3. Ejecutar un l PCR 20 (para 35 ciclos) usando el plásmido diluido como molde. Preparar la reacción de la siguiente manera: 2 l 10 x tampón de polimerasa, 2 l dNTPs 2 mM, 1 l 5 mM M13 cebador directo (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 '), 1 l cebador inverso M13 5 mM (5 '-CAG GAA ACA TCG ATG ACC-3'), 1 l diluido pBSK- pPsaD plásmido, 1 U de Taq polimerasa, y agua destilada para obtener el volumen total de reacción hasta20 l. Utilice un programa de PCR estándar, como sigue: 95 ° C, 5 min; 35 ciclos de [95 ° C, 30 seg; 56 ° C, 30 seg; 72 ° C, 30 seg); y 72 ° C, 5 min.
4. Ejecutar 5 l de producto de PCR en un 1% (w / v) en gel de agarosa en tampón TAE (Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM de ácido acético, EDTA 1 mM) para verificar la amplificación correcta del cDNA, y cuantificar la pertinente banda respecto a los estándares para confirmar la concentración. Guardar el resto del producto a -20 ° C para otras aplicaciones.
5. Preparar una reacción de 50 l usando un sistema de reticulocitos de conejo lisado basado libre de células de transcripción / traducción compatible con el ADN de PCR, como sigue: 40 l de lisado de reticulocitos del sistema de transcripción / traducción, 2,5 l radiomarcado ^[35 S] metionina, 11 Ci / mL (actividad específica:> 1000 Ci / mmol), agua destilada de 2,5 l estéril, y 5 l producto pPsaD PCR (100 - 800 ng).
   Precaución: Use guantes, ropa de laboratorio y vidrio de seguridadses al manejar material radiactivo. Monitorear y descontaminar la superficie de trabajo y equipo. Disponer de todos los residuos radiactivos en un contenedor de residuos autorizado.
6. Incubar la reacción durante 90 min en un baño de agua C 30 °. Detener la reacción mediante la colocación de la muestra en hielo.
7. Eliminar 1 l de la reacción en forma de una muestra de ensayo (el mismo volumen también puede servir como un control de entrada para el paso 5.7) para la verificación en la electroforesis estándar dodecil de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), seguido de autorradiografía, fluorografía o formación de imágenes de fósforo. Un buen resultado se indica mediante la observación de una banda distinta y fuerte que corresponde al peso molecular de pPsaD (~ 23 kD). Almacenar el resto de la reacción a -80 ° C para otras aplicaciones.

3. Aislamiento de cloroplastos

1. Preparar las siguientes soluciones madre:
   1. Preparar el aislamiento de cloroplastos Buffer (CIB, 2x): 0,6 M de sorbitol, cloruro de magnesio 10 mM(MgCl _2), etileno glicol 10 mM tetraacético (EGTA), 10 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), bicarbonato de sodio 20 mM (NaHCO _3), 40 mM ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanosulfónico (HEPES) ; ajustar el pH a 8,0 con KOH. Preparar 2 l de 2x CIB, hacer alícuotas y conservarse a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo, oa 4 ° C para el almacenamiento a corto plazo. Para hacer 1x CIB, se diluye la CIB 2x 1: 1 con agua destilada; esto puede ser preparado recientemente en el día del experimento aislamiento cloroplasto.
   2. Preparar _HEPES-MgSO4 tampón Sorbitol (HMS, 1x): HEPES 50 mM, 3 mM de sulfato de magnesio _(MgSO4), 0,3 M de sorbitol; ajustar el pH a 8,0 con hidróxido de sodio (NaOH). Preparar 400 ml de tampón, hacer alícuotas y conservarse a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo, oa 4 ° C para el almacenamiento a corto plazo.
2. Llevar a cabo todos los procedimientos siguientes en el cuarto frío o en hielo. Pre-enfriar todas las soluciones, dispositivos, equipos, y los rotores antes del ptarting.
3. Preparar un gradiente de densidad continuo mediante la mezcla de 13 ml de Percoll, 13 ml de tampón 2x ​​CIB, y 5 mg de glutatión en un tubo de centrífuga de 50 ml, y centrifugando la mezcla a 43.000 xg durante 30 min (freno off) a 4 ° C. Después de la centrifugación, el tubo de manejar con cuidado para no perturbar el gradiente y mantener en hielo para su uso posterior.
4. Transferir 100 ml de 1x CIB por genotipo / condición a un vaso de 1 litro.
   1. Retire las plantas de semillero del medio líquido inclinando ellos en un tamiz, y transferirlos a otro vaso de precipitados que contiene CIB-; a continuación, enjuagar el tejido con el CIB para eliminar cualquier medio líquido residual antes de reemplazarlo con 100 ml de CIB fresco.
5. Para la homogeneización, utilizar un total de 100 ml de 1x CIB por muestra en cinco rondas consecutivas de homogeneización, cada ronda utilizando 20 ml de CIB frescas presentes en un vaso de 50 ml.
   1. Para la primera ronda de la homogeneización, se transfiere el tejido de la planta en el vaso de precipitados 50 ml con la mano, permitiendo que eltampón de retención anterior se escurra entre los dedos. Trate de usar la mayor parte del tejido en la primera ronda, pero asegúrese de que está inmerso con tampón; si esto no es posible, introducir el tejido remanente no utilizado en la segunda ronda.
6. Coloque la sonda del homogeneizador de tejidos en el tejido y homogeneizar con dos pulsos de 1 - 2 s cada uno. Filtrar el homogenato a través de dos capas de tela de filtración en un ml tubo 250 de la centrifugadora por compresión suave. Conservar el filtrado, y transferir el tejido de nuevo a la 50 ml vaso de precipitados.
7. Colocar una segunda alícuota de 20 ml CIB en el vaso de precipitados de 50 ml, añadir cualquier tejido remanente no utilizado en la primera ronda de homogeneización, y repita los pasos de homogeneización y de filtración. Por lo tanto, repita los pasos 3.5 y 3.6 hasta que todo el 100 ml de CIB se ha agotado (es decir, 5 partes alícuotas de 20 ml), y se combinan los filtrados resultantes.
8. Centrifugar el homogeneizado agrupado a 1000 × g durante 5 min (freno) a 4 ° C, y se vierte fuerael sobrenadante inmediatamente después de la terminación de la centrifugación, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Resuspender el precipitado en el sobrenadante residual que queda en el tubo agitando suavemente el tubo en hielo. No volver a suspender vigorosamente con la pipeta o vortex.
9. transferir suavemente el homogeneizado en la parte superior de la gradiente de densidad continuo preparado de antemano, usando una pipeta Pasteur para aplicarlo a través de la pared del tubo de recepción. No perturbar el gradiente. Centrífuga en un rotor oscilante-cubo en 7.800 × g durante 10 minutos (freno desactivado) a 4 ° C.
   NOTA: Dos bandas verdes se pueden ver en el gradiente después de la centrifugación: la banda inferior contiene cloroplastos intactos, y la banda superior contiene cloroplastos rotos.
10. Desechar la banda superior con la pipeta, y luego transferir la banda inferior con una pipeta Pasteur en un tubo de centrífuga de 50 ml fresco, manteniendo un volumen de hasta 8 ml por gradiente.
11. Añadir ~ 25 ml de 1x HMS tampón en el tubo e invertir el tubo dos veces to lavar el Percoll de los cloroplastos. Se coloca el tubo de nuevo en el rotor oscilante-cubo y se centrifuga a 1000 × g durante 5 min (freno) a 4 ° C.
12. Retirar el sobrenadante y resuspender cuidadosamente el sedimento de cloroplasto en los HMS residual que queda en el tubo agitando suavemente el tubo en hielo. Añadir un adicional de 100 - 300 l de HMS si es necesario (en función del tamaño de la pastilla y el recuento en la Sección 4), pero trata de no diluir la muestra demasiado.
    1. Mantenga los cloroplastos en hielo. Cada vez antes de que los cloroplastos se utilizan para aplicaciones posteriores, agitar el tubo para resuspender ellos. Siempre use una punta de pipeta de corte (con un poro ampliada) para transferir los cloroplastos.

4. Análisis del rendimiento y integridad de los cloroplastos

1. Añadir 5 l de cloroplastos aislados a 495 l de tampón de 1x HMS en un tubo de 1,5 ml, y después mezclar suavemente invirtiendo el tubo para obtener una dilución 1: 100.
2. Place una cubierta de vidrio en la parte superior de la cámara de recuento del hemocitómetro. Lentamente pipeta ~ 40 - 60 l de la suspensión de cloroplastos se diluye en el espacio entre el vidrio de cubierta y la cámara de recuento. Utilizando un microscopio de contraste de fases con un objetivo de 10X o 20X, cloroplastos intactos miran redonda y brillante y están rodeadas por un halo de luz.
   NOTA: Bajo el microscopio, hay una zona de conteo de 1 mm ² con 25 cuadrados grandes, cada uno con 16 pequeños cuadrados en el centro de la cámara de recuento.
3. Contar el número de cloroplastos en 10 cuadrados grandes. El número de cloroplastos por gran plaza debe ser en promedio entre 10 y 30. Si es demasiado o demasiado pocos cloroplastos están presentes, ajustar el factor de dilución (paso 4.1 anterior) en consecuencia, y repita el procedimiento.
4. Calcular el número de cloroplastos por ml (concentración) como sigue: n (el número medio de cloroplastos por gran cuadrado calculado en el paso 4.3) x 25 (número total de cuadrados grandes) × 100 (el factor de dilución) x 10 ⁴ (factor de escala para expresar datos por 1 ml, ya que el volumen por encima de los 25 cuadrados es 0,1 mm ^3).
5. Calcular el rendimiento real de los cloroplastos multiplicando la concentración por el volumen de la suspensión de cloroplastos obtenido en la etapa 3.12. Normalmente, más de 50 × 10 ⁶ cloroplastos se pueden obtener.

5. cloroplasto importación de proteínas

1. Preparar las siguientes soluciones madre:
   1. Preparar tampón 10x HMS: 500 mM de HEPES, 30 mM de _MgSO4, y sorbitol 3,0 M; ajustar el pH a 8,0 con NaOH. Preparar 50 ml de este tampón, alícuota y se almacena a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo y a 4 ° C para el almacenamiento a corto plazo.
   2. Preparar importación tampón de detención: EDTA 50 mM disuelto en tampón 1x HMS. Preparar 50 ml de este tampón, alícuota y se almacena a -20 ° C.
   3. Preparar 2x tampón de proteína de carga: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v / v) de glicerol, 2% (w/ V) SDS, 0,005% (w / v) de azul de bromofenol. Hacer 50 ml y se almacena a 4 ° C. Justo antes de su uso, añadir 100 l de 1 M de 1,4-ditiotreitol (DTT) a 900 l de tampón.
2. Para ejecutar un transcurso de tiempo de 3 puntos de tiempo, preparar 3 tubos que contienen cada una alícuota de 130 l de tampón de parada de importación, y dejarlos en el hielo. Preparar una reacción de importación de 450 l en un tubo de 2 ml (por genotipo / condición). Descongelar todos los ingredientes justo antes del uso.
   1. Por una reacción de importación, por lo general utilizar 10 × 10 ⁶ cloroplastos en un volumen l; por ejemplo, si la concentración del cloroplasto es 2,5 × 10 ⁸ / ml, utilizar 40 l de suspensión de cloroplastos. Tres puntos de tiempo necesitarán 3 × A l (es decir, 120 l en nuestro ejemplo).
   2. Mezclar los componentes de las reacciones en hielo en el siguiente orden: agua destilada (para hacer el volumen total de 600 l), tampón B l 10x HMS (donde B = [600-3 × A] / 10; es decir, 48 en nuestro ejemplo), 12 lÁcido 1 M glucónico (sal de potasio), 6 l 1 M NaHCO _3, 6 l 20% (w / v) de BSA, 30 l de adenosina 100 mM 5'-trifosfato de sal de magnesio (MgATP), 24 l de metionina 250 mM (no radiomarcado ), y 30 l precursor de la proteína. Inmediatamente antes de iniciar la reacción de importación, añadir 3 × A l de cloroplastos y mezcle golpeando suavemente el tubo.
3. Incubar el tubo de reacción a 25 ° C en un baño de agua a 100 mol · m ^{- 2} · s ^{- 1} luz. De vez en cuando chasquear los tubos para volver a suspender los cloroplastos.
4. Para llevar a cabo un transcurso de tiempo, retirar 130 alícuotas de la reacción en los puntos de tiempo requeridos dentro del rango lineal de importación, que para pPsaD es hasta ~ 12 min (4, 8 y 12 min puntos temporales son adecuados en este caso). El período de intervalo lineal puede variar para diferentes proteínas ^14. Por lo tanto, se sugiere para probar cada preproteína individual antes para optimizar tSeñala tiempo.
5. Inmediatamente después de la retirada, traslado cada alícuota de 130 l a un tubo de tampón de detención importación enfriado con hielo, mezclar golpeando suavemente el tubo y retener todos los tubos en hielo hasta que el tiempo de curso se ha completado.
6. Centrifugar las muestras durante 30 s a 12.000 xg en una microcentrífuga, desechar el sobrenadante con la pipeta, y volver a suspender las bolitas en 15 l de 2x tampón de carga de proteínas mediante agitación.
7. Analizar todas las muestras y además el control de entrada pPsaD (que contiene pPsaD equivalente al 10% de la cantidad añadida a cada reacción de importación, desde el paso 2.7) por la norma SDS-PAGE y autorradiografía, fluorografía o formación de imágenes de fósforo ^15. Utilice el software de análisis de imágenes para cuantificar y analizar los resultados. Para proporcionar una indicación de la eficiencia de importación, la cantidad de proteína importada en diferentes genotipos / condiciones se puede evaluar mediante la medición de la radiactividad asociada con cada banda madura.

Resultados

Un ejemplo de proteína del cloroplasto experimento de importación con 3 puntos de tiempo se muestra en la Figura 1. PSAD es un componente ~ 18 kD del fotosistema I expuesto al estroma, con una forma precursora de ~ 23 kD ^16. Psad fue seleccionado aquí para el ensayo de importación de proteínas in vitro debido a que sus niveles de estado estacionario se encuentra elevado en el mutante SP1, en relación con WT, bajo condiciones de estrés, lo que sugiere un cambio en la eficiencia de las importaciones en el mutante ^3. El mutante sp1 lleva un defecto en un importante regulador de la maquinaria de importación del cloroplasto proteína - la proteína SP1 ^3. Para cloroplastos aislados de plantas cultivadas en condiciones normales, no había diferencia evidente en la importación pSAD entre sp1 y WT (datos no mostrados) ^3. Sin embargo, usando los métodos descritos aquí para evaluar la importación pSAD en cloroplastos aislados de osmóticamenteplantas estresadas, se detectó una diferencia clara. Si bien se observó la acumulación de la forma de proteína madura de una manera dependiente del tiempo con ambos genotipos, la tasa de importación fue significativamente menor para los cloroplastos WT que para los cloroplastos SP1 (Figura 1), lo cual es consistente con nuestros resultados previos ^3, y revela un papel importante para la proteína SP1 en la regulación de la importación del cloroplasto de pSAD bajo condiciones de estrés.

Figura 1. Una proteína de importación efectuadas mediante el uso del ensayo Los cloroplastos aislados de las plantas que crecen bajo condiciones de estrés osmótico. Los cloroplastos se aislaron de un WT 10 días de edad (Col-0) y unos mutantes de Arabidopsis SP1 plantas cultivadas bajo condiciones de estrés (manitol 200 mM) durante 2 d. Importación (A) de proteínas se llevó a cabo utilizando ^[35 S] Methionine marcado pPsaD y se deja proceder durante 4, 8 y 12 min antes del análisis por SDS-PAGE y formación de imágenes de fósforo. Se analizó en paralelo, el control de entrada 10% pPsaD comprende traducido in vitro de proteínas (IVT). El precursor (pre) y maduro (mat) formas de pPsaD se indican, mientras que en el medio hay dos bandas que probablemente corresponden a productos de traducción truncadas o proteolizada porque su intensidad no cambió durante el transcurso de tiempo (*). (B) Para comparar las tasas de importación en los cloroplastos de las plantas WT y SP1 cultivadas bajo condiciones de estrés, se cuantificó la intensidad de cada banda correspondiente a la proteína madura importada en A. Todos los datos se expresan como porcentaje de la cantidad de proteína importada en los cloroplastos de las plantas WT después de 12 minutos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Recientemente, hemos mostrado que cloroplasto importación de proteínas se puede regular de forma activa por el estrés, que es fundamental para la función del cloroplasto y la planta de la supervivencia ^3. En ese estudio, para controlar dicha regulación, modificamos nuestro aislamiento de cloroplastos y en los procedimientos de ensayo in vitro de importación con el fin de permitir la evaluación de la capacidad de importación de plantas cultivadas bajo condiciones de estrés. Los resultados indicaron un papel importante en la regulación de SP1 importación de proteínas del cloroplasto.

Convencionales en ensayos in vitro de importación utilizan plantas cultivadas en MS estándar medio de agar ^6,17,18. En el caso del mutante sp1 se describe aquí, tales ensayos convencionales no revelaron diferencias en la proteína de importación en relación con el WT ^3. Sin embargo, el papel de SP1 en la regulación de la importación de proteínas se revela claramente cuando la importación de proteínas se evaluó en condiciones de estrés utilizando los métodos descritos en el presente documento (Figura 1). Si bien may no sea posible comparar directamente los datos de importación a partir del ensayo condiciones de estrés con los obtenidos a partir de ensayos convencionales (como los métodos emplean las plantas que crecen en cultivo líquido y en medio de agar, respectivamente), las comparaciones entre las condiciones de estrés y no estrés son viables siempre y cuando las plantas son adultos en el mismo medio de cultivo líquido, con o sin factores de estrés.

En comparación con el tratamiento de estrés en un medio de agar, un cultivo líquido es más conveniente para el tratamiento de la gran cantidad de plantas necesarias para los ensayos de importación en vitro. Además, facilita la aplicación uniforme del factor estresante a todas las plantas, que es particularmente importante para los tratamientos de estrés a corto plazo. El método que aquí se presenta se ha aplicado para estudiar el estrés osmótico mediante tratamiento manitol, pero podría ser fácilmente adaptado a una amplia gama de otros tipos de estrés; por ejemplo, estrés salino a corto plazo y el estrés oxidativo, para el que los factores de estrés correspondientes podrían be aplicado de manera similar a través de un medio MS líquido. Para otros tipos de estrés, se sugiere el grado de estrés se ha optimizado primera; excesivamente severos tratamientos pueden tener efectos adversos sobre el rendimiento y / o la competencia de importaciones de los orgánulos aislados.

Hay varios pasos importantes dentro del protocolo al que se debe prestar especial atención, como se detalla a continuación.

La concentración de agar óptima para el medio MS puede diferir (0,6 hasta 0,9%, w / v) según el fabricante. Por lo tanto, se recomienda para optimizar empíricamente la concentración de agar antes de comenzar los experimentos. El medio no debe ser tan blandos que se pega al tejido en la etapa de recolección (paso 1.9), tampoco debe ser tan fuerte que inhibe el desarrollo radicular de la planta. La concentración de sacarosa también se puede ajustar de acuerdo con las plantas utilizadas. Cuando se trabaja con mutantes particularmente enfermos, medio MS suplementado con 2 - 3% (w / v) de sacarosa puede ayudar a las plantas a crecer mejor. cuando la aplicaciónmentira tratamientos de estrés, que no es bueno para transferir las plantas muy antiguas al medio líquido (por ejemplo,> 14 días de edad). Esto se debe a las raíces más desarrolladas de las plantas más viejas son más fácilmente dañadas durante la transferencia.

Con respecto al sistema de transcripción / traducción, hay 2 sistemas principales: los basados ​​en germen de trigo, y los basados ​​en reticulocitos de conejo. Estos kits pueden utilizar diferentes plantillas, tales como plásmidos linealizados, plásmidos no linealizada, o productos de la PCR. Los kits también son específicos para los promotores T3, T7, y SP6. Tenga en cuenta que el kit se recomienda aquí sólo es adecuado para su uso con productos de PCR y el promotor T7. Sin embargo, por razones desconocidas, algunos preproteínas radiomarcados hechas con este sistema podrían no funcionar de manera eficiente en el ensayo de importación; en tales casos, se puede considerar probar un sistema de extracto de germen de trigo o de un sistema de lisado de reticulocitos significado para plantillas de plásmidos. También se puede mejorar el resultado de la transcripción / traducción reacción mediante la modificación de las condiciones de reacción de acuerdo con el manual del fabricante.

Es importante comenzar el aislamiento de cloroplastos temprano en la mañana (o temprano en el ciclo de luz de la cámara de crecimiento) con el fin de evitar la acumulación de almidón en el interior de los cloroplastos debido a la fotosíntesis, lo que puede dificultar el aislamiento de orgánulos intactos. El procedimiento de aislamiento del cloroplasto tiene que hacerse rápidamente y sin retrasos innecesarios, y los cloroplastos aislados siempre se debe mantener frío. Esto es para mitigar la observación de que los cloroplastos aislados perderá gradualmente su viabilidad, que no es bueno. Si se utiliza CIB recién descongelado o tampón HMS, asegúrese de mezclar el tampón antes de usar para obtener una solución homogénea. Las condiciones óptimas para la homogeneización del material vegetal se han establecido empíricamente, y se puede variar si se utiliza un homogeneizador de tejidos diferente.

Si los diferentes genotipos de plantas contienen similalos niveles de clorofila r, la cuantificación de la clorofila se pueden usar como una forma alternativa para normalizar las muestras antes de la realización de los ensayos de importación. La clorofila se puede determinar espectrofotométricamente después de la extracción de una muestra de los cloroplastos aislados en 80% (v / v) de acetona acuosa ^19,20. Sin embargo, si las tasas de importación de plantas con diferentes contenidos de clorofila (por ejemplo, los mutantes con fenotipos cloróticas) se van a comparar, contando para normalizar las muestras de cloroplastos en los ensayos de importación utilizar el número de cloroplastos. Es particularmente importante para volver a suspender los cloroplastos a fondo en el paso 3,11. resuspensión es insuficiente, puede dejar agregados de los cloroplastos, lo que hará que sea difícil para contar los números con precisión y por lo tanto va a dificultar la correcta carga en las reacciones de importación. Si la agregación severa se observa bajo el microscopio (por ejemplo, agregados con> 10 cloroplasto unidas entre sí), continuar agitando la muestra del cloroplasto en hielo hasta el aggregatES se eliminan. Es más fácil para volver a suspender los cloroplastos en un volumen más pequeño de tampón.

Es importante ser consciente de que las reacciones de importación de proteínas (Sección 5) deben llevarse a cabo con las debidas precauciones, debido a su naturaleza radiactiva. precauciones necesarias incluyen: el uso de guantes desechables, ropa de laboratorio y gafas de seguridad, el control y la descontaminación de la superficie de trabajo y equipo, y la eliminación de todos los residuos radiactivos en un contenedor de residuos autorizado. También hay que tener en cuenta que la presión osmótica correcta es fundamental para mantener la integridad de los cloroplastos durante las reacciones de importación, y esto se mantiene principalmente por la memoria intermedia de HMS. Debido a 10x HMS es viscoso, primero se debe calentar hasta la temperatura ambiente, y después se mezcla a fondo, y se aplica utilizando una punta de pipeta de corte para garantizar una medición de volúmenes precisos. En la reacción de importación, se añade metionina fría para inhibir la incorporación de metionina radiomarcada libre en relación chloroplproteínas ast través de la traducción organellar durante la etapa de incubación, mientras que BSA se utiliza para minimizar la proteólisis, actuando como un sustrato para proteasas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sal basal de Murashige y Skoog	Melford	M0221
phytoagar	Melford	P1003
2-(N-morfolino) etano sulfónico ácido (MES)	Melford	B2002
triton X-100	Fisher	BPE151-500
cinta quirúrgica (p. ej., Microporo, 3M)	3M	1530-1
papel de filtro	Fisher	FB59023
Percoll	Fisher	10607095
Ácido etilenglicol tetraacético (EGTA)	Sigma	E4378
ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Fisher	D/0700/53
ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico (HEPES)	Tela de filtración Melford	B2001
(Miracloth)	Calbiochem	475855
Tubo de centrífuga de 50 mL	Fisher	CFT-595-040M
Botella de centrífuga de 250 mL	Fisher	CFT-891-V
Polytron (e.g., Kinematica PT10-35)	Fisher	11010070
Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S)	Fisher	11030083
centrífuga (p. ej., Beckman Coulter Avanti JXN-26, para tubos de 50 y 250 mL)	Beckman Coulter	B34182
para 250  botellas de ml (p. ej., JLA-16.250)	Beckman Coulter	363930
para 50  Tubos de mL (p. ej., JA-25.50)	Beckman Coulter	363058
rotor de cangilón oscilante para tubos de 50 mL (p. ej., JS-13.1)	Beckman Coulter	346963
metionina [35S] radiomarcado	Perkin Elmer	NEG072002MC
sistema de traducción libre de células basado en lisado de reticulocitos de conejo (TNT T7 Quick kit para PCR DNA)	Microscopio de	L5540
(p. ej., Nikon Eclipse 80i)	Nikon	no disponible
(cámara Neubauer BS748 mejorada)	Hawksley Technology	AC1000	0,1 mm de profundidad, 1/400 mm2
cubreobjetos	VWR	16004-094	22 mm & veces; 22 mm, espesor 0,13-0,17 mm
1,5 mL tubos de microfuga	Sarstedt	72.690.001
2 mL tubos de microfuga	Starlab	S1620-2700
microfuga (p. ej., Eppendorf 5415D)	Eppendorf	no disponible
Espectrofotómetro Nanodrop 2000 o similar	Thermo Fisher	SPR-700-310L ácido
glucónico (sal de potasio)	Fisher	22932-2500
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma	A7906
MgATP	Sigma	A9187
metionina	Sigma	M6039
azul de bromofenol	Fisher	B/P620/44
glicerol	Fisher	G/0650/17
SDS	Fisher	S/5200/53
Tris Base	Melford	B2005
ditiotreitol (DTT)	Melford	MB1015
(e.g., Aida Image Analyzer)	Raytest	no disponible