Automatizado de cuantificación y análisis de los procedimientos de recuento de células usando ImageJ Plugins

Summary

Este artículo describe la cuantificación de hemocitómetros y micrografías de migración/invasión a través de dos nuevos complementos de código abierto de ImageJ: Cell Concentration Calculator y migration assay Counter. Además, describe los protocolos de adquisición y calibración de imágenes, así como analiza en detalle los requisitos de entrada de los complementos.

Abstract

El Instituto Nacional de Salud de ImageJ es una suite de software de libre acceso de gran alcance, el procesamiento de imágenes. ImageJ tiene algoritmos de análisis de partículas integrales que se pueden utilizar con eficacia para contar diversas partículas biológicas. Al contar un gran número de muestras de células, el hemocitómetro presenta un cuello de botella en cuanto a tiempo. Del mismo modo, contando membranas a partir de ensayos de migración / invasión con la célula Contador ImageJ plugin, aunque precisa, es la mano de obra intensiva excepcionalmente, subjetiva, y la mala fama por causar dolor en la muñeca. Para hacer frente a esta necesidad, hemos desarrollado dos plugins dentro de ImageJ con la única tarea de hemocitómetro automático (o volumen conocido) y el recuento de células de migración / invasión. Ambos plugins se basan en la capacidad de adquirir micrografías de alta calidad con el fondo mínimo. Son fáciles de usar y optimizado para el conteo rápido y análisis de muestras de gran tamaño con herramientas de análisis incorporadas para ayudar a la calibración de los recuentos. Al combinar el principio básicos de contador de células con un análisis automatizado algoritmo de recuento y post-conteo, esto aumenta en gran medida la facilidad con la que los ensayos de migración pueden ser procesados ​​sin pérdida de precisión.

Introduction

En el recuento de células in vitro es una importante técnica básica en una amplia gama de experimentos de cultivo de tejidos. Determinar con precisión el número de células en un cultivo es esencial para la reproducibilidad experimental y ^1,2 normalización. El recuento de células se puede realizar manualmente usando un hemocitómetro, así como el uso de una variedad de métodos automatizados, cada uno con sus propias ventajas y desventajas ^3,4,5. La mayoría de los métodos automatizados para el recuento de células pertenecen a una de dos clases, los que utilizan el principio de Coulter o citometría de flujo. Contador Coulter toman ....

Protocol

Microscopio 1. El compuesto y la configuración de la cámara (Simulador de concentración de células)

1. Aumentar el brillo de la bombilla al completo con la perilla de ajuste de luz, cambiar a la lente del objetivo 4X, y los filtros de contraste de fase se seleccionan aseguran.
   NOTA: Cualquier microscopio de contraste de fase invertida para el cultivo de tejidos con un fondo oscuro, por ejemplo, de contraste de fase PHP, pueden ser utilizados siguiendo los procedimientos del microscopio y la cámara estándar.
2. Dentro del software del microscopio, establecer los ajustes de captura de imagen a los valores predeterminados.
   NOTA: Con....

Results

Calculadora Concentración celular

La Figura 1 presenta el proceso general de calibración CCC y adquisición de imágenes contable. Figura 1A y 1B representan la imagen de calibración P-cuadrado y cálculo de la longitud P-cuadrado en píxeles. CCC determina la concentración de células en un volumen dado mediante la fórmula:

Discussion

Los pasos críticos, solución de problemas y limitaciones

La propia naturaleza de los métodos de cálculo automatizados, específicamente los de análisis de partículas, requiere la capacidad matemática para definir estas partículas. En consecuencia, tanto la exactitud de la calculadora de la concentración de células y el contador de ensayo de migración depende mayormente en la fidelidad de la imagen, es decir, cómo de cerca la imagen capturada se asemeja a la membrana de célula o muestra de ensayo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Medios líquidos clásicos: RPMI 1640 - con L-glutamina	Fisher Scientific	SH3002702	medios de cultivo celular
Suero bovian fetal (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Suministro de medios
Línea celular de trofoblastos HTR8/SVneo	Las células se obtuvieron del Dr. Charles Graham (Queen' s University, Kingston, Canadá)El		software está diseñado para trabajar con cualquier línea celular.
Tripsina	GIBCO BRL	27250-018	Preparada al 0,20% (p/v) en 10 µ M EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Placas de cultivo celular de 10 cm	SARSTEDT	833902	Cualquier placa tratada con cultivo de tejidos será adecuada
Inserciones de membrana de poliéster Transwell - 8.0  y micro; m Tamaño de poro	Costar 3422 pedido a Fisher Scientific 7200150		para placas de 24 pocillos; Tamaño de poro: 8.0 y micro; m; 6,5 mm de diámetro; 0,33 cm2 área de crecimiento
HARLECO Tinciones y reactivos para hematología, EMD Millipore - Soluciones 1, 2 y 3	EMD Millipore y pedidos de VWR	65044A, B y El	juego de tinción C Hemacolor consta de tres botellas de polietileno de 500 ml (16,9 oz) e incluye un fijador de metanol (Solución 1), una tinción de eosina o ácido (Solución 2) y una tinte básica o azul de metileno (Solución 3)
Aplicador con punta de algodón	Puritan Medical	806-WC
Hojas de afeitar industriales de un solo filo	VWR	55411 - 055	Grosor: 0,30 mm (0,012")
Portaobjetos de microscopio - Prelimpios/lisos	Fisher Scientific	12550A3	Dimensiones: 25 mm x 75 mm x 1,0 mm
Cubreobjetos Fisherbrand - Rectángulos n.º 1	Fisher Scientific	12-545E	Grosor: 0,13 a 0,17 mm; Tamaño: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Montaje Medio	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Microscopio de disección estereoscópica Leica	Microsystems		El microscopio está equipado con una cámara microscópica Leica modelo MC170 HD y el software de la cámara es Leica App. Suite (LAS E2) Versión 3.1.1 [Compilación: 490]. Partes del microscopio:  LED3000 Modelo de iluminación de luz puntual: MEB126, Leica M80 Modelo de portador óptico M80, objetivo acromático 1.0X, WD=90  mm Modelo: MOB306 & Acromático objetivo 0.32X, WD=303  mm Modelo: MOB315, Video Objective 0.5X Modelo: MTU-293
Hemacytometer	Assistant Germany		0,100 mm Profundidad - 0,0025 mm2
Microscopio de luz invertida Olympus	Corporation CKX41SF		El microsope está equipado con Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & el software de la cámara es Infinity analyze Version 6.5.2
Cabina de flujo laminar 1300 Series A2	Thermo Scientific	Modelo: 1375	Cualquier cabina de flujo laminar para trabajos de cultivo celular será adecuada
Incubadora de cultivos	celulares Thermo Scientific	Modelo: 370	Cualquier incubadora de cultivo celular será adecuada - Las células se cultivaron en un ambiente humidificado, 5% CO2, 37 ° C
ImageJ	NIH	Versión 1.50e	Versión mínima requerida
Java Runtime Environment Oracle		Versión 1.8.0_66	Versión mínima requerida