Este artículo describe la cuantificación de hemocitómetros y micrografías de migración/invasión a través de dos nuevos complementos de código abierto de ImageJ: Cell Concentration Calculator y migration assay Counter. Además, describe los protocolos de adquisición y calibración de imágenes, así como analiza en detalle los requisitos de entrada de los complementos.
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Artículo de método
Automatizado de cuantificación y análisis de los procedimientos de recuento de células usando ImageJ Plugins
En este artículo
Resumen
Resumen
El Instituto Nacional de Salud de ImageJ es una suite de software de libre acceso de gran alcance, el procesamiento de imágenes. ImageJ tiene algoritmos de análisis de partículas integrales que se pueden utilizar con eficacia para contar diversas partículas biológicas. Al contar un gran número de muestras de células, el hemocitómetro presenta un cuello de botella en cuanto a tiempo. Del mismo modo, contando membranas a partir de ensayos de migración / invasión con la célula Contador ImageJ plugin, aunque precisa, es la mano de obra intensiva excepcionalmente, subjetiva, y la mala fama por causar dolor en la muñeca. Para hacer frente a esta necesidad, hemos desarrollado dos plugins dentro de ImageJ con la única tarea de hemocitómetro automático (o volumen conocido) y el recuento de células de migración / invasión. Ambos plugins se basan en la capacidad de adquirir micrografías de alta calidad con el fondo mínimo. Son fáciles de usar y optimizado para el conteo rápido y análisis de muestras de gran tamaño con herramientas de análisis incorporadas para ayudar a la calibración de los recuentos. Al combinar el principio básicos de contador de células con un análisis automatizado algoritmo de recuento y post-conteo, esto aumenta en gran medida la facilidad con la que los ensayos de migración pueden ser procesados sin pérdida de precisión.
Introducción
En el recuento de células in vitro es una importante técnica básica en una amplia gama de experimentos de cultivo de tejidos. Determinar con precisión el número de células en un cultivo es esencial para la reproducibilidad experimental y 1,2 normalización. El recuento de células se puede realizar manualmente usando un hemocitómetro, así como el uso de una variedad de métodos automatizados, cada uno con sus propias ventajas y desventajas 3,4,5. La mayoría de los métodos automatizados para el recuento de células pertenecen a una de dos clases, los que utilizan el principio de Coulter o citometría de flujo. Contador Coulter toman ....
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Protocolo
Microscopio 1. El compuesto y la configuración de la cámara (Simulador de concentración de células)
- Aumentar el brillo de la bombilla al completo con la perilla de ajuste de luz, cambiar a la lente del objetivo 4X, y los filtros de contraste de fase se seleccionan aseguran.
NOTA: Cualquier microscopio de contraste de fase invertida para el cultivo de tejidos con un fondo oscuro, por ejemplo, de contraste de fase PHP, pueden ser utilizados siguiendo los procedimientos del microscopio y la cámara estándar. - Dentro del software del microscopio, establecer los ajustes de captura de imagen a los valores predeterminados.
NOTA: Con....
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Resultados
Calculadora Concentración celular
La Figura 1 presenta el proceso general de calibración CCC y adquisición de imágenes contable. Figura 1A y 1B representan la imagen de calibración P-cuadrado y cálculo de la longitud P-cuadrado en píxeles. CCC determina la concentración de células en un volumen dado mediante la fórmula:
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Discusión
Los pasos críticos, solución de problemas y limitaciones
La propia naturaleza de los métodos de cálculo automatizados, específicamente los de análisis de partículas, requiere la capacidad matemática para definir estas partículas. En consecuencia, tanto la exactitud de la calculadora de la concentración de células y el contador de ensayo de migración depende mayormente en la fidelidad de la imagen, es decir, cómo de cerca la imagen capturada se asemeja a la membrana de célula o muestra de ensayo.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud para PC (OR 142730 y OR 89931). Nos gustaría agradecer a Jelena Brkic por su idea inicial del análisis de partículas binarias en ImageJ.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| HyClone Medios líquidos clásicos: RPMI 1640 - con L-glutamina | Fisher Scientific | SH3002702 | medios de cultivo celular |
| Suero bovian fetal (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Suministro de medios |
| Línea celular de trofoblastos HTR8/SVneo | Las células se obtuvieron del Dr. Charles Graham (Queen' s University, Kingston, Canadá)El | software está diseñado para trabajar con cualquier línea celular. | |
| Tripsina | GIBCO BRL | 27250-018 | Preparada al 0,20% (p/v) en 10 µ M EDTA 1x PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Placas de cultivo celular de 10 cm | SARSTEDT | 833902 | Cualquier placa tratada con cultivo de tejidos será adecuada |
| Inserciones de membrana de poliéster Transwell - 8.0 y micro; m Tamaño de poro | Costar 3422 pedido a Fisher Scientific 7200150 | para placas de 24 pocillos; Tamaño de poro: 8.0 y micro; m; 6,5 mm de diámetro; 0,33 cm2 área de crecimiento | |
| HARLECO Tinciones y reactivos para hematología, EMD Millipore - Soluciones 1, 2 y 3 | EMD Millipore y pedidos de VWR | 65044A, B y El | juego de tinción C Hemacolor consta de tres botellas de polietileno de 500 ml (16,9 oz) e incluye un fijador de metanol (Solución 1), una tinción de eosina o ácido (Solución 2) y una tinte básica o azul de metileno (Solución 3) |
| Aplicador con punta de algodón | Puritan Medical | 806-WC | |
| Hojas de afeitar industriales de un solo filo | VWR | 55411 - 055 | Grosor: 0,30 mm (0,012") |
| Portaobjetos de microscopio - Prelimpios/lisos | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimensiones: 25 mm x 75 mm x 1,0 mm |
| Cubreobjetos Fisherbrand - Rectángulos n.º 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Grosor: 0,13 a 0,17 mm; Tamaño: 50 mm x 22 mm |
| Fisher Chemical Permount Montaje Medio | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Microscopio de disección estereoscópica Leica | Microsystems | El microscopio está equipado con una cámara microscópica Leica modelo MC170 HD y el software de la cámara es Leica App. Suite (LAS E2) Versión 3.1.1 [Compilación: 490]. Partes del microscopio: LED3000 Modelo de iluminación de luz puntual: MEB126, Leica M80 Modelo de portador óptico M80, objetivo acromático 1.0X, WD=90 mm Modelo: MOB306 & Acromático objetivo 0.32X, WD=303 mm Modelo: MOB315, Video Objective 0.5X Modelo: MTU-293 | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0,100 mm Profundidad - 0,0025 mm2 | |
| Microscopio de luz invertida Olympus | Corporation CKX41SF | El microsope está equipado con Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & el software de la cámara es Infinity analyze Version 6.5.2 | |
| Cabina de flujo laminar 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Modelo: 1375 | Cualquier cabina de flujo laminar para trabajos de cultivo celular será adecuada |
| Incubadora de cultivos | celulares Thermo Scientific | Modelo: 370 | Cualquier incubadora de cultivo celular será adecuada - Las células se cultivaron en un ambiente humidificado, 5% CO2, 37 ° C |
| ImageJ | NIH | Versión 1.50e | Versión mínima requerida |
| Java Runtime Environment Oracle | Versión 1.8.0_66 | Versión mínima requerida |
Referencias
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752(2008).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016).
- Graham, M. D.
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Reimpresiones y permisos
