Este artículo describe la cuantificación de hemocitómetros y micrografías de migración/invasión a través de dos nuevos complementos de código abierto de ImageJ: Cell Concentration Calculator y migration assay Counter. Además, describe los protocolos de adquisición y calibración de imágenes, así como analiza en detalle los requisitos de entrada de los complementos.
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Artículo de método
Automatizado de cuantificación y análisis de los procedimientos de recuento de células usando ImageJ Plugins
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Resumen
Resumen
El Instituto Nacional de Salud de ImageJ es una suite de software de libre acceso de gran alcance, el procesamiento de imágenes. ImageJ tiene algoritmos de análisis de partículas integrales que se pueden utilizar con eficacia para contar diversas partículas biológicas. Al contar un gran número de muestras de células, el hemocitómetro presenta un cuello de botella en cuanto a tiempo. Del mismo modo, contando membranas a partir de ensayos de migración / invasión con la célula Contador ImageJ plugin, aunque precisa, es la mano de obra intensiva excepcionalmente, subjetiva, y la mala fama por causar dolor en la muñeca. Para hacer frente a esta necesidad, hemos desarrollado dos plugins dentro de ImageJ con la única tarea de hemocitómetro automático (o volumen conocido) y el recuento de células de migración / invasión. Ambos plugins se basan en la capacidad de adquirir micrografías de alta calidad con el fondo mínimo. Son fáciles de usar y optimizado para el conteo rápido y análisis de muestras de gran tamaño con herramientas de análisis incorporadas para ayudar a la calibración de los recuentos. Al combinar el principio básicos de contador de células con un análisis automatizado algoritmo de recuento y post-conteo, esto aumenta en gran medida la facilidad con la que los ensayos de migración pueden ser procesados sin pérdida de precisión.
Introducción
En el recuento de células in vitro es una importante técnica básica en una amplia gama de experimentos de cultivo de tejidos. Determinar con precisión el número de células en un cultivo es esencial para la reproducibilidad experimental y 1,2 normalización. El recuento de células se puede realizar manualmente usando un hemocitómetro, así como el uso de una variedad de métodos automatizados, cada uno con sus propias ventajas y desventajas 3,4,5. La mayoría de los métodos automatizados para el recuento de células pertenecen a una de dos clases, los que utilizan el principio de Coulter o citometría de flujo. Contador Coulter toman ventaja de las células resistencia eléctrica para determinar el número y tamaño de las células. Ellos son rápidos, precisos y más barato que los citómetros de flujo. Sin embargo, rara vez se utilizan sólo para el recuento de células debido a su costo considerable en comparación con el conteo manual 3. Citómetros de flujo, por otro lado, son caros pero tienen muchas aplicaciones tales como el recuento de células, el análisis de la forma de las células, structure y la célula de medida interna Marcadores de 4,5. Las máquinas que utilizan cualquiera de estos dos principios están disponibles de muchos fabricantes. Conteo manual es asequible, pero consume tiempo y sujeto a un sesgo, mientras que los métodos automatizados vienen con una fracción del tiempo necesario para que el recuento manual, pero el uso de máquinas costosas 6.
Otros procedimientos de cultivo celular común están en ensayos de motilidad de las células in vitro, a saber, la migración celular y la invasión 7. ensayos de migración y la invasión se utilizan comúnmente para investigar la motilidad celular y la invasión en respuesta a una respuesta quimiotáctica. Además, se utilizan ampliamente para estudiar el desarrollo embrionario, la diferenciación, la respuesta inflamatoria, y la metástasis de múltiples tipos de células 7-11. Las células que han migrado o invadido través de la membrana porosa de un ensayo de migración se pueden cuantificar de dos maneras diferentes. En primer lugar, mediante la tinción de las células con un colorante fluorescente, la disociación from de la membrana, y la cuantificación utilizando un lector fluorescente 12. Una limitación de este método de cuantificación es que ningún registro puede ser retenido de las membranas y no hay posibilidad de un mayor análisis 13. El segundo método de cuantificación es para emigrado / células para ser fijados y teñidos con colorante fluorescente o más comúnmente, con colorantes citológicos como cristal violeta, colorante azul de toluidina o hematoxilina invadió; a continuación, las células se cuantificaron utilizando manualmente las imágenes microscópicas invertidas de estas membranas, que es una tarea que consume mucho tiempo 12,13.
Para superar los inconvenientes de conteo de células manual, se desarrollaron dos contadores de células automatizadas fiables y precisos para la concentración de células y para el ensayo de migración. Estos algoritmos contador de células automatizado fueron desarrollados para ImageJ como un plugin usando lenguaje de programación Java de Oracle. ImageJ es una herramienta de procesamiento de imagen pública y ampliamente usada desarrollado por el Instituto Nacional del ciLTH (NIH) 14,15; por lo tanto, escribir estos plugins para ImageJ facilita una fácil integración en la comunidad biológica.
Automatización de recuento de células garantiza un alto rendimiento y reproducibilidad en comparación con el conteo manual. Aunque otro software y plugins disponibles se pueden utilizar para calcular la concentración de células a través de análisis de imágenes 5,16,17, Cell Concentración Calculadora Plugin es rápido y también puede manejar diluciones de células y tratamientos. Por otra parte, todos los resultados y cálculos de estos dos contadores se pueden guardar y exportar. Los dos plugins descritos en este documento están optimizados para el uso de un microscopio de contraste de fases de imágenes de células vivas y gran campo de visión (toda la captura de membrana) de imágenes para membranas de ensayo de migración a través del uso de un microscopio de disección. Los plugins son de libre acceso para descargar las instrucciones de instalación de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.
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Protocolo
Microscopio 1. El compuesto y la configuración de la cámara (Simulador de concentración de células)
- Aumentar el brillo de la bombilla al completo con la perilla de ajuste de luz, cambiar a la lente del objetivo 4X, y los filtros de contraste de fase se seleccionan aseguran.
NOTA: Cualquier microscopio de contraste de fase invertida para el cultivo de tejidos con un fondo oscuro, por ejemplo, de contraste de fase PHP, pueden ser utilizados siguiendo los procedimientos del microscopio y la cámara estándar. - Dentro del software del microscopio, establecer los ajustes de captura de imagen a los valores predeterminados.
NOTA: Consulte el manual del usuario del microscopio para encontrar la ubicación de estos ajustes.- Set 'brillo', 'contraste', y 'saturación' al 100% y 'gamma' y 'ganancia' a 1,0.
NOTA: En función del software, 'brillo' y el 'contraste' pueden por defecto a un valor de 0% en lugar del 100%. - imágenes dispuesto a ser capturados en blanco y negro usando la más alta resolución available (1.600 x 1.200 píxeles (px) o mayores).
NOTA: Un "saturación" de 0% es suficiente si un ajuste blanco y negro no está disponible.
- Set 'brillo', 'contraste', y 'saturación' al 100% y 'gamma' y 'ganancia' a 1,0.
- Colocar un hemocitómetro estándar sobre la platina del microscopio y capturar una imagen como se representa en la (Figura 1A); esta es la "imagen de calibración de volumen '. Ajustar los tiempos de exposición según sea necesario.
Calibración Volumen 2. Imagen
- ImageJ abierto y en el menú de plugins, iniciar la Calculadora de concentración de células (CCC) plugin, por ejemplo, "Calculadora Concentración teléfono ', Complementos> Analizador>.
- Si el panel del lado derecho 'imagen de volumen de calibración' no es visible, haga clic en "Calibrar" para mostrarlo.
- En ImageJ, abra la "imagen de calibración volumen" en el paso 1.3 ( "Archivo"> "Abrir") y en el CCC clic en el botón 'Get dimensión de la imagen'.
NOTA: Esto llenará en tanto y anchura de imagencuadros de texto Altura con la resolución de la imagen en píxeles de forma automática. - En ImageJ, seleccione la "Herramienta de Línea Recta 'junto a las herramientas de selección y dibujar una línea recta a través de toda la longitud del hemocitómetro primario (P) -square demostrado en la (Figura 1B) haciendo clic y arrastrando el cursor.
- Presione la tecla "M" para mostrar la ventana de resultados con las mediciones de línea recta. Escriba el valor de la columna de longitud en el cuadro de texto 'P-cuadrado Longitud' en CCC (Figura 1B).
- Haga clic en el botón 'Calcular imagen de volumen' a la salida del volumen de la imagen en el cuadro de texto imagen de volumen. Alternativamente, si el volumen de la imagen ya se sabe, escriba el volumen en nL en el cuadro de texto imagen de volumen.
- Haga clic en el botón "Guardar".
NOTA: El plug-in está calibrada.
La calibración de la cámara 3. Exposición
- Después de la recolección de células paracontando a través de hemocitómetro, carga de 10 l de células en una cámara del hemocitómetro y colocarlo en la platina del microscopio.
- Usando la misma configuración desde el paso 1.2, ajustar el tiempo de exposición para que las líneas de fondo de la hemocitómetro desaparecen.
- Ajuste el enfoque de modo que el interior de las células es más oscuro que la membrana celular, lo que indica enfoque dentro de la sección transversal central de la célula y no los polos.
- Ajustar aún más la exposición de manera que las células no están sobreexpuestas y se asemejan a los que se representan en la (Figura 1C).
NOTA: Las líneas del hemocitómetro ligeramente visible son aceptables. Se recomienda guardar o registrar estos ajustes para mantener la precisión y reproducibilidad.
4. Adquisición de imágenes
- Para cada muestra de células, carga de 10 l en ambas cámaras del hemocitómetro para aumentar la potencia de la inferencia estadística 2. Coloque el hemocitómetro en la platina del microscopiopara formación de imágenes.
NOTA: La resolución y magnificación de cada imagen deben ser los mismos la "imagen de calibración de volumen 'como. El plug-in cuenta todas las imágenes de cualquier carpeta seleccionada; mantener las imágenes que se cuentan juntas en la misma carpeta.- Si una función de nombre de archivo incremento automático está disponible, encenderlo y asegúrese de que cada imagen no se muestra después de la captura para aumentar el rendimiento.
NOTA: guardar y cerrar cada imagen se ralentizará drásticamente el proceso manualmente. Consulte el manual del usuario del microscopio para obtener información sobre la disponibilidad de una función de incremento automático. - Capturar al menos tres imágenes que no se solapan de la región central de la hemocitómetro Aunque se recomienda más (5-10) para aumentar la precisión.
NOTA: Evitar tanto las zonas superior e inferior de las cámaras como las células tienden a aumentar la densidad en ambos lugares. Tome el mismo número de imágenes para cada cámara. Esto es necesario para el buen funcionamiento del plugin durante el recuento.
- Si una función de nombre de archivo incremento automático está disponible, encenderlo y asegúrese de que cada imagen no se muestra después de la captura para aumentar el rendimiento.
5. Contar Imagen y diluciones
- En CCC, haga clic en "contar las células 'y observar el cuadro de diálogo Elegir directorio. Seleccione una carpeta para ser contado.
- Observe el cuadro de entrada de número de la muestra después de seleccionar una carpeta. Introduce el número de imágenes tomadas por la cámara, es decir, 4.1.2, y haga clic en "Aceptar". El plug-in ahora contará todos los JPG, TIFF y PNG en la carpeta seleccionada en orden alfabético.
NOTA: Al hacer clic en el botón "Visor de muestras de 'abrirá la ventana Visor de muestras de mostrar información sobre las muestras contadas. concentración de la muestra es la concentración promedio de todas las imágenes tomadas por la cámara. Las muestras con concentraciones sin unidades se pueden añadir a esta lista, como la adición de un medicamento o tratamiento molécula pequeña.- Recuento de las muestras de células si las concentraciones varían de forma significativa en el recuento de las mismas muestras (sección 4).
NOTA: Para el cálculo de diluciones para todo tcontaba-muestras, CCC utiliza automáticamente la fórmula C 1 V 1 = C 2 V 2.
- Recuento de las muestras de células si las concentraciones varían de forma significativa en el recuento de las mismas muestras (sección 4).
- Usa el escenario de la siembra de 15.000 células por 200 l en 30 pocillos de una placa de 96 pocillos + 1 extra:
- Establecer el cuadro de texto a la derecha de la etiqueta C2 a 15.000 y el volumen de texto concentración a 200, el cambio de la unidad de cuadro combinado junto a 'l'.
NOTA: El plugin en última instancia, calcular la concentración en células / ml. - Asegúrese de que el cuadro combinado volumen ha seleccionado V2 (volumen final) y en el cuadro de texto a la derecha entrar en 6200 (200 l x (30 + 1)), la selección de 'l' en el cuadro combinado unidad de volumen.
- Establecer el cuadro de texto a la derecha de la etiqueta C2 a 15.000 y el volumen de texto concentración a 200, el cambio de la unidad de cuadro combinado junto a 'l'.
- Haga clic en "Calcular dilución" para añadir la dilución introducido en ese momento al cuadro de lista inferior izquierda.
NOTA: Para cada dilución añadido, será resuelto por cada muestra y se muestra en el diagrama de árbol a la derecha. Haga doble clic en cada entrada se expanda. - Al hacer clic en tél botón "Guardar" debajo del botón 'Visor de muestras de' escribir en el archivo todos los datos de la muestra y diluciones.
- NOTA: Estos datos se pueden recuperar en cualquier momento haciendo clic en "Load" y seleccionar el archivo guardado.
6. migración y la invasión (Contador)
- Realizar los ensayos de migración e invasión utilizando el método de la cámara de Boyden estándar 7-9.
- Después las células han emigrado / invadido, retirar con cuidado los medios de comunicación dentro de la inserción por inversión y golpeando suavemente. Wick de distancia de cualquier medio exceso adheridos a la parte inferior de la membrana por tocar el borde de una toalla de papel.
NOTA: No toque la propia membrana a la toalla, esto puede desprender las células adheridas. - Fijar y teñir las células como informó 7-9 en una placa de 24 pocillos establecido con cada fila que contiene ~ 500 l de una solución diferente, por ejemplo, fijador, Tinte 1, 2 de la mancha, y agua doblemente destilada (ddH2O). Llene una segunda placa con PBS 1x tO colocar los insertos en antes de cortar.
- Lavar los insertos colocándolos en pozos llenos de ddH 2 O y llenar el inserto con ddH 2 O. Escurrir el agua antes de hisopado distancia células por inversión.
- Use un aplicador de algodón limpio para eliminar las células-un emigrado / un-invadido desde la parte superior de la membrana con cuidado de no dañar la membrana. Sea cuidadoso alrededor de los bordes de la membrana.
- Cortar la membrana utilizando una navaja o un bisturí y cuidadosamente transferir la membrana (lado de abajo hacia arriba) en un portaobjetos de vidrio limpio.
- Añadir una pequeña gota de solución de montaje por debajo y en la parte superior de la membrana y cubrir con una hoja de cubierta delgada.
NOTA: Evitar que queden atrapadas burbujas dentro de la solución de montaje para preservar la exactitud de los recuentos.
7. La disección de Alcance y Configuración de la cámara
- Encienda la fuente de luz del microscopio y la cámara.
NOTA: Consulte el manual de usuario del microscopio para obtener instrucciones detalladas. - Ingeniohin de software, configuración de captura de imágenes del microscopio establecidos a los valores por defecto.
NOTA: Si existe una función de promedio, se recomienda un valor de cuatro. Este es un buen compromiso entre el grado de promediado y de adquisición de imágenes tiempo. Del mismo modo, un pequeño grado de afilado puede aumentar la fidelidad de la imagen.- Set 'brillo', 'contraste', y 'saturación' al 100% y 'gamma' y 'ganancia' a 1,0.
NOTA: En función del software, 'brillo' y el 'contraste' pueden por defecto a un valor de 0% en lugar del 100%. - Ajuste pantalla (en tiempo real) y la resolución de captura a sus valores máximos (1.600 x 1.200 píxeles y 2.592 x 1.944 píxeles, respectivamente).
NOTA: Resolución de la pantalla se puede ajustar según sea necesario, si la frecuencia de actualización es demasiado lento. Las resoluciones más bajas harán que sea más difícil de enfocar con precisión, pero aumentará la frecuencia de actualización.
- Set 'brillo', 'contraste', y 'saturación' al 100% y 'gamma' y 'ganancia' a 1,0.
- Para la etapa del alcance de disección, utilice un sólido blanco background; un fondo negro o vidrio es insuficiente.
- Utilice la fuente de luz de la etapa anterior, preferiblemente de dos luces LED flexibles a la derecha ya la izquierda del escenario.
NOTA: A continuación etapa fuente de luz se iluminará los poros dentro de la membrana de ensayo de migración que puede influir negativamente en la precisión de los recuentos posteriores. - Colocar un portaobjetos de membrana de ensayo de migración completado en el escenario. Mirando la imagen en tiempo real mostrado por el software en, ajustar la ampliación con la perilla de ajuste de zoom de modo que los bordes de una sola membrana son sólo dentro del campo de visión de la cámara.
NOTA: Colocar el portaobjetos en una placa de vidrio overtop el fondo del escenario blanco hace que sea más fácil de maniobrar la corredera para la imagen. - Ajustar las posiciones de luz de origen (7.6.1) y tiempos de exposición para reproducir lo más estrechamente posible la imagen ideal representada en la Figura 2A. Dependiendo de la luminosidad, los tiempos de exposición de 5-60 ms deberían ser suficientes.
NOTA:El objetivo es producir una imagen con tan poco color de fondo como sea posible y una membrana uniformemente iluminado sin reducir la fidelidad de la imagen, es decir, la exposición excesiva que conduce a una pérdida de células visibles.- Coloque las fuentes de luz de izquierda y derecha en un ángulo bajo en relación a la diapositiva. Esto ayudará a eliminar las manchas de fondo y las aberraciones cromáticas. Trate de mantener cada fuente de luz directamente opuesta a la otra.
NOTA: Si bien la maniobra cada fuente de luz en la posición, poner la otra fuera. Esto ayuda a centrar el área de la iluminación sobre la membrana en sí más fácilmente y con precisión.
- Coloque las fuentes de luz de izquierda y derecha en un ángulo bajo en relación a la diapositiva. Esto ayudará a eliminar las manchas de fondo y las aberraciones cromáticas. Trate de mantener cada fuente de luz directamente opuesta a la otra.
- Retire la corredera y el balance de blancos de la imagen usando un solo clic de botón en el software del microscopio.
NOTA: El microscopio está calibrada. Guardar tantas configuraciones como sea posible para su uso futuro y tomar nota de las posiciones de la fuente de luz y la intensidad.
8. Adquisición de imágenes y Flatfield
- Dentro del software, configurarla ubicación de la carpeta de captura y captura de una imagen por membrana. Nombre las imágenes siguiendo el modelo general de: Nombre - ###, por ejemplo, control - 001.tif, control - 002.tif, Fármaco de ensayo - 001.tif, y así sucesivamente.
NOTA: Para obtener los mejores resultados de imagen, guardar el tipo de archivo de imagen como TIFF con respecto a otros formatos con pérdida, como JPEG.
NOTA: Las imágenes no siguen el modelo general se seguirán contando, pero no estarán sujetos a la agrupación automatizada y fildeo plana.- Si se desea corrección flatfield, para cada diapositiva encontrar un área vacía y tomar una imagen en blanco después de la convención de nombres: Nombre - en blanco.
NOTA: Un espacio en blanco es un área en la diapositiva que contiene la membrana y representa la iluminación de fondo. - Inmediatamente antes de la proyección de imagen, aplanar cada membrana mediante la aplicación de presión sobre el cubreobjetos y eliminar tantas burbujas atrapadas como sea posible.
- Si se desea corrección flatfield, para cada diapositiva encontrar un área vacía y tomar una imagen en blanco después de la convención de nombres: Nombre - en blanco.
- En ImageJ, ir a Plugins y abrir el plugin TC; por ejemplo, los plugins> Análisis> & #39, Transwell Contador '.
- Dentro de TC, haga clic en el botón 'Flatfield' y observar el cuadro de diálogo Elegir directorio. Seleccione la carpeta donde se guardan las imágenes de membrana.
NOTA: Sólo las imágenes guardadas con la plantilla general anterior será automáticamente flatfield corrige y graba en una nueva carpeta llamada Flatfield dentro de la carpeta elegida. Véase la Figura 2B para un ejemplo de una imagen flatfield corregido.
9. Valores de configuración
- Abra una imagen de membrana de ensayo de migración en ImageJ ( "Archivo"> "Abrir") y seleccione Imagen> Ajustar> 'Umbral de color ...'. Observe la ventana Umbral de color para ajustar los colores que se filtra fuera de la imagen.
- En la parte inferior de la ventana, establezca el método de umbral para 'Shanbhag', color Umbral de 'White', y el espacio de color a "RGB" (rojo azul verde); Fondo oscuro desmarque de ser seleccionado.
- Ajustar la parte superiordeslizadores haciendo clic y arrastrando los marcadores a 0 y los deslizadores inferiores a 255 (dejan los deslizadores inferiores a 255). Asegúrese de que la imagen es completamente blanca.
- Ajuste los deslizadores top verde y rojo hasta que sólo los núcleos son visibles.
NOTA: Los ajustes seleccionados variarán por completo de la mancha celular utilizada. Véase la figura 2C. - En el plugin de TC, los valores de entrada de los mejores deslizadores RGB en los cuadros de texto 'RGB umbral "los ajustes de configuración asociados. Haga clic en el botón "Añadir / Modificar 'y sobrescribir la configuración.
- Deja el tamaño del rango inferior y superior en los valores 1 - Infinity.
- En el panel Ajustes de configuración, haga clic en "Guardar" para escribir la configuración en el disco duro.
10. Contar las imágenes y calibración
- Abra el complemento de TC (8,2) y haga clic en "Count carpeta 'y observar el cuadro de diálogo Elegir directorio. Seleccione la carpeta que se contaba unand esperar a que termine.
- Cada muestra de contado-se añade automáticamente a la tabla principal. columnas clave son 'conde', 'calidad', y 'Calibre?'.
NOTA: El conde no calibrado es el número de partículas por membrana dentro del área que se muestra en la columna «rango de la zona '.
NOTA: La calidad varía de aproximadamente -0,8 a 1,7; Q ≥ 0,5 es aceptable.- Observar una marca de verificación en el 'Calibrar?' columna si una imagen se encuentra en posición de calibración en base a su parecido con las métricas ideales.
NOTA: Tanto la calidad y calibración pueden sugerir que los valores actuales son posiblemente insuficiente. Si después adecuada 'color Umbral "y" tamaño oscila' han sido seleccionados y calibración todavía se sugiere, la inspección del original y se contaron las imágenes deben ser el determinante final de un conteo válido.
- Observar una marca de verificación en el 'Calibrar?' columna si una imagen se encuentra en posición de calibración en base a su parecido con las métricas ideales.
- Seleccionar todas las muestras en la Tabla Marcado para la calibración.
- Haz clic derecho en tél tabla y seleccione Recuento> 'El tamaño sugerido'. Esto vuelve a contar las imágenes con una superficie de partícula mínimo sugerido.
- Haga clic derecho de nuevo y seleccione "Mostrar gráfico". Observar el gráfico de dispersión de frecuencia de las áreas de partículas. Una imagen ideal tendrá un gráfico que se asemeja a una distribución a largo cola derecha normal, es decir, la curva de campana. Vea la Figura 3B.
- Ajustar el rango de tamaño inferior, si es necesario, mediante la selección de la muestra, hacer clic derecho y seleccionar Recuento> 'Los ajustes manuales. Observar el diálogo de configuración manual. Introduzca los ajustes deseados y haga clic en número de relatar la imagen con la nueva configuración.
- Para ajustar el recuento manual, seleccionar las muestras, haciendo clic derecho en la tabla y seleccione 'Abrir imagen con recuento'. Observar la imagen original con marcadores rojos que representan cada una de las partículas contadas por el plugin.
NOTA: Recuento> 'Mostrar contó imagen binaria' puede ser útil para comprobar qué tan bien iNDIVIDUALES células están siendo resueltas por el umbral de color.- Para agregar una cuenta, mantenga 'Ctrl' y click izquierdo. Observar un marcador en la posición del cursor, que se añadirá a las muestras de recuento total. Para eliminar un marcador, haga clic en la imagen. El plug-in se eliminará el marcador más cercano al cursor.
- Para eliminar un grupo de marcadores, utilice una herramienta de selección en ImageJ para seleccionar una región de interés (ROI). Mientras mantiene "Ctrl", haga clic derecho en la imagen y se eliminarán todos los marcadores dentro de la ROI. Observe el número de células en la columna 'conde'.
11. Guardar / Abrir Resultados y exportar a CSV
- En TC, vaya a la barra de menús y haga clic en "Archivo"> "Guardar como resultado '. Observe el cuadro de diálogo Guardar resultados. Elegir un nombre y un destino y haga clic en "Guardar".
- Use "Archivo"> "Abrir los resultados 'para cargar un archivo que contiene todos los datos que se muestran en la tabla principal, including la trama.
NOTA: El archivo de resultados guarda los directorios de las imágenes se guardan en Si las imágenes originales se mueven después de guardar, la "imagen abierta con recuentos '' Abrir imagen original 'y las funciones fallarán.. - Para restablecer el directorio de imágenes, seleccionar las muestras, haga clic derecho en la tabla y seleccione 'directorio de imágenes de Reset'. Observe el cuadro de diálogo Elegir directorio. Seleccione la nueva carpeta y si existen las imágenes, los directorios se reiniciarán. Vuelva a guardar el archivo de resultados.
- Use "Archivo"> "Abrir los resultados 'para cargar un archivo que contiene todos los datos que se muestran en la tabla principal, including la trama.
- Para guardar un archivo de valores separados por comas (CSV), en la barra de menú vaya a "Archivo"> "Exportar a .csv '. Esto produce un archivo con muestras organizadas en grupos estadísticos con la media del recuento y de error estándar de la media; su trazado se ha diseñado para la representación gráfica rápida en los programas de gráficos comunes.
NOTA: Los grupos estadísticos se basan en los grupos creados dentro de TC.- Si las muestras siguen el modelo general de nomenclatura, seleccionar las muestras para ser grouped, haga clic derecho y seleccione 'agrupación automática'. Esto agrega muestras con el mismo "nombre" a un mismo grupo. Usando el ejemplo de control - 1, control - 2, Tratamiento - 1, Tratamiento - 2: ambos controles se agregan al grupo "Control" y los tratamientos de 'tratamiento'.
- Añadir muestras manualmente a los grupos haciendo doble clic celular y escribiendo de la muestra "Grupo" en el nombre del grupo. Seleccione las muestras que han de añadirse a este grupo, clic derecho y seleccionar "Añadir al grupo '.
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Resultados
Calculadora Concentración celular
La Figura 1 presenta el proceso general de calibración CCC y adquisición de imágenes contable. Figura 1A y 1B representan la imagen de calibración P-cuadrado y cálculo de la longitud P-cuadrado en píxeles. CCC determina la concentración de células en un volumen dado mediante la fórmula:
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Discusión
Los pasos críticos, solución de problemas y limitaciones
La propia naturaleza de los métodos de cálculo automatizados, específicamente los de análisis de partículas, requiere la capacidad matemática para definir estas partículas. En consecuencia, tanto la exactitud de la calculadora de la concentración de células y el contador de ensayo de migración depende mayormente en la fidelidad de la imagen, es decir, cómo de cerca la imagen capturada se asemeja a la membrana de célula o muestra de ensayo...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud para PC (OR 142730 y OR 89931). Nos gustaría agradecer a Jelena Brkic por su idea inicial del análisis de partículas binarias en ImageJ.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| HyClone Medios líquidos clásicos: RPMI 1640 - con L-glutamina | Fisher Scientific | SH3002702 | medios de cultivo celular |
| Suero bovian fetal (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Suministro de medios |
| Línea celular de trofoblastos HTR8/SVneo | Las células se obtuvieron del Dr. Charles Graham (Queen' s University, Kingston, Canadá)El | software está diseñado para trabajar con cualquier línea celular. | |
| Tripsina | GIBCO BRL | 27250-018 | Preparada al 0,20% (p/v) en 10 µ M EDTA 1x PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Placas de cultivo celular de 10 cm | SARSTEDT | 833902 | Cualquier placa tratada con cultivo de tejidos será adecuada |
| Inserciones de membrana de poliéster Transwell - 8.0 y micro; m Tamaño de poro | Costar 3422 pedido a Fisher Scientific 7200150 | para placas de 24 pocillos; Tamaño de poro: 8.0 y micro; m; 6,5 mm de diámetro; 0,33 cm2 área de crecimiento | |
| HARLECO Tinciones y reactivos para hematología, EMD Millipore - Soluciones 1, 2 y 3 | EMD Millipore y pedidos de VWR | 65044A, B y El | juego de tinción C Hemacolor consta de tres botellas de polietileno de 500 ml (16,9 oz) e incluye un fijador de metanol (Solución 1), una tinción de eosina o ácido (Solución 2) y una tinte básica o azul de metileno (Solución 3) |
| Aplicador con punta de algodón | Puritan Medical | 806-WC | |
| Hojas de afeitar industriales de un solo filo | VWR | 55411 - 055 | Grosor: 0,30 mm (0,012") |
| Portaobjetos de microscopio - Prelimpios/lisos | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimensiones: 25 mm x 75 mm x 1,0 mm |
| Cubreobjetos Fisherbrand - Rectángulos n.º 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Grosor: 0,13 a 0,17 mm; Tamaño: 50 mm x 22 mm |
| Fisher Chemical Permount Montaje Medio | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Microscopio de disección estereoscópica Leica | Microsystems | El microscopio está equipado con una cámara microscópica Leica modelo MC170 HD y el software de la cámara es Leica App. Suite (LAS E2) Versión 3.1.1 [Compilación: 490]. Partes del microscopio: LED3000 Modelo de iluminación de luz puntual: MEB126, Leica M80 Modelo de portador óptico M80, objetivo acromático 1.0X, WD=90 mm Modelo: MOB306 & Acromático objetivo 0.32X, WD=303 mm Modelo: MOB315, Video Objective 0.5X Modelo: MTU-293 | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0,100 mm Profundidad - 0,0025 mm2 | |
| Microscopio de luz invertida Olympus | Corporation CKX41SF | El microsope está equipado con Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & el software de la cámara es Infinity analyze Version 6.5.2 | |
| Cabina de flujo laminar 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Modelo: 1375 | Cualquier cabina de flujo laminar para trabajos de cultivo celular será adecuada |
| Incubadora de cultivos | celulares Thermo Scientific | Modelo: 370 | Cualquier incubadora de cultivo celular será adecuada - Las células se cultivaron en un ambiente humidificado, 5% CO2, 37 ° C |
| ImageJ | NIH | Versión 1.50e | Versión mínima requerida |
| Java Runtime Environment Oracle | Versión 1.8.0_66 | Versión mínima requerida |
Referencias
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- JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016).
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- Ormerod, M. G., Imrie, P. R. Flow cytometry. Animal Cell Culture. Walker, J. M., Pollard, J. W. , Humana Press. 543-558 (1990).
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