Artículo de método

La detección de la actividad endocrina en Uso de Agua comercialmente disponibles In Vitro Transactivación bioensayos

DOI:

10.3791/54725

⸱

4 de diciembre de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Southern California Coastal Water Research Project Authority, 2Department of Physiological Sciences, University of Florida

En este artículo

Resumen

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Se adaptó un protocolo para detectar la actividad endocrina en extractos orgánicos de muestras de agua, incluidos los efluentes de aguas residuales tratadas y el agua superficial (receptora), utilizando bioensayos de transactivación in vitro disponibles comercialmente para detener la división ("congelar y descongelar").

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En los bioensayos de transactivación in vitro han mostrado prometedor como herramientas de supervisión de la calidad del agua, sin embargo, su adopción y aplicación generalizada se ha visto obstaculizada debido en parte a la falta de métodos estandarizados y la disponibilidad de la tecnología robusta, fácil de usar. En este estudio, se emplearon, líneas celulares de división a detener disponibles en el mercado para la detección cuantitativa de la actividad endocrina de los productos químicos presentes en las muestras de agua de interés para los profesionales de la calidad del medio ambiente. Un protocolo único, estandarizado que incluía aseguramiento de calidad / control de calidad (QA / QC) comprueba si se ha desarrollado para la actividad de estrógeno y receptor de glucocorticoides (GR y ER, respectivamente) utilizando un ensayo de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia basado en células (FRET). Las muestras de los efluentes tratados municipal de aguas residuales y agua de superficie de sistemas de agua dulce en California (EE.UU.), se extrajeron mediante extracción en fase sólida y se analizó la actividad endocrina utilizando el proto estandarizadacolumna. Antecedentes y dosis-respuesta para los productos químicos de referencia de punto final específico cumplen las directrices de AC / CC que se consideren necesarias para la medición fiable. La respuesta de detección bioensayo para las muestras de agua de la superficie no era en gran parte detectable. Por el contrario, las muestras de efluentes de plantas de tratamiento secundario tuvieron la mayor actividad medible, con concentraciones equivalentes de bioensayo estimado (EQB) de hasta 392 ng de dexametasona / L para GR y 17 ng de 17β-estradiol / L para el ER. La respuesta bioensayo para una muestra de efluente terciario fue menor que el medido para los efluentes secundarios, lo que indica un residual inferior de endocrinos químicos activos después del tratamiento avanzado. Este protocolo mostró que en los bioensayos de transactivación in vitro que utilizan comercialmente disponible, la división celular detenido de "kits", se puede adaptar para la detección de la actividad endocrina en agua.

Introducción

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El monitoreo actual calidad del agua se basa en la capacidad de medir con exactitud y precisión la presencia de contaminantes químicos como sustituto de la exposición a la fauna y los seres humanos. Sin embargo, esta vigilancia química por sustancia y paradigma de la evaluación no pueden seguir el ritmo del universo químico en constante cambio al que nos enfrentamos. A medida que aprendemos más sobre el destino y los efectos de los productos químicos sintéticos y naturales, continuamos la búsqueda de herramientas de medición que espera abordar los impactos biológicos, y que al mismo tiempo son inmunes a los cambios en la producción de sustancias químicas, el uso y la entrada del medio ambiente. Estas herramientas son especialmente relevantes para la comprensión de si las sustancias químicas desconocidas o nuevas, y productos de transformación, merecen nuestra atención. Por otra parte, mezclas complejas de productos químicos presentes en el agua están mal dirigidas por vigilancia química individual. Por lo tanto, nos encontramos ante el reto de la modernización de la caja de herramientas de monitoreo existente para abordar mejor estas cuestiones en las aguas superficiales del that recibir descarga de efluentes de aguas residuales tratadas y aguas de escorrentía / pluviales urbanos.

En los últimos años, las técnicas de bioanálisis se han mostrado prometedoras como herramientas de detección para la evaluación de la calidad del agua. En particular, los bioensayos, in'vitro que responden a las sustancias químicas que actúan por medio conocido, los modos específicos de acción 1,2 son de gran interés para la comunidad vigilancia del medio ambiente 3. Numerosas investigaciones han empleado en bioensayos in vitro para cuantificar la actividad endocrina del consumo de alcohol, la superficie y las aguas residuales 4 -6. Por otra parte, una serie de bioensayos objetivo sucesos iniciadores moleculares (por ejemplo, la activación del receptor), que puedan estar relacionadas con efectos nocivos a través de la vía resultado adverso analiza 7,8.

La evolución de bioscreening para la evaluación de la calidad del agua ha sido relativamente rápida, con cientos de diferentes puntos finales en bioensayos in vitro de haber sido evaluados por suutilidad de 9,10. En la actualidad, sólo un puñado de bioensayos se ha demostrado para lograr una buena precisión de la medida (dentro de los laboratorios) al tiempo que demuestra la capacidad de diferenciar entre las calidades de agua 5,6. Para los efluentes de aguas residuales tratadas, en particular, la aparición de los estrógenos y esteroides glucocorticoides ha sido exitosamente representaron para usar en ensayos de transactivación in vitro 11,12. bioensayos Sin embargo, la mayoría de los estudios hasta la fecha han empleado cuyas líneas celulares son de propiedad (y por lo tanto no están ampliamente disponibles), requieren de atención continua y la manipulación, o ambos. Como resultado, la capacidad de estandarizar protocolos, realizar ejercicios de calibración entre laboratorios, y en última instancia para transferir esta tecnología de detección para los recursos de agua de la comunidad sigue siendo impedida.

Al menos un proveedor de bioensayos in vitro examinados a través del programa de Estados Unidos ToxCast está disponible comercialmente en 13 fáciles de usar "congelación y descongelación4; formatos. Estas células "kits" de división-detenidos han demostrado ser robustos en la medición de la actividad de los productos químicos extraídos de agua que representan diferentes niveles de tratamiento 14. Aunque los protocolos de los proveedores están disponibles para detectar la bioactividad de los productos químicos individuales o mezclas, algunos de ellos requieren modificación antes de que se pueden aplicar a muestras de agua. Efluentes de aguas residuales tratadas 15, 16 escorrentía de aguas pluviales, aguas receptoras 17,18 y más recientemente reciclada 19,20 agua son los principales ejemplos de medios acuosos que son de interés para la comunidad de la calidad del agua.

En este estudio se presenta un protocolo único, estandarizado para medir la actividad endocrina en muestras de agua usando disponible en el mercado, la división-detenido en bioensayos de transactivación in vitro. Hemos demostrado la robustez del protocolo a través de una evaluación exhaustiva de fondo, la capacidad de respuesta de la dosis y la repetibilidad de la respuesta de two Los criterios de valoración de especial interés y estrógeno transactivación del receptor de glucocorticoides (GR y ER, respectivamente). El protocolo se aplicó a muestras de pantalla de efluentes de aguas residuales tratadas y aguas superficiales procedentes de sistemas de agua dulce en California.

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Protocolo

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1. Recoger y la Muestra de aguas de procesos (Modificado de Escher y otros. 9)

  1. Llenar un 1 L frasco de vidrio ámbar limpia que contiene 1 g de azida de sodio y ácido ascórbico 50 mg a la parte superior con la muestra de agua de interés. conserve la muestra a 4 ° C y proceso dentro de 72 horas.
    NOTA: La azida sódica es altamente tóxico y debe manejarse con precaución. Use equipo de protección (gafas / máscara, guantes, ropa) y pesar en una campana de humos que funcione correctamente. No use una espátula de metal para el pesaje.
  2. Pasar la muestra a través de un filtro de fibra de vidrio 1,6 M y luego a través de un cartucho de extracción en fase sólida preacondicionado (SPE) a una velocidad de flujo de 5 a 10 ml / min. Ajustar la presión de la bomba de vacío para controlar la velocidad de flujo.
  3. Vacuum secar el cartucho durante 15 min.
  4. Eluir el cartucho con 10 ml de metanol, seguido de 10 ml de acetona: hexano (1: 1, v / v).
  5. Concéntrese eluato a ~ 1 ml bajo una ligera corriente de nitrógeno de alta pureza. Solventeintercambio mediante la adición de 500 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO) y evaporando el extracto hasta 500 l.
  6. Transferir el extracto a un vial de vidrio ámbar muestreador automático. Almacenar a -20 ° C.

2. Preparar diluciones de la química específica Prueba de Referencia y el extracto de agua

  1. Preparar diluciones 9 para la curva de calibración.
    1. Hacer una solución madre de la sustancia de referencia específico de ensayo en 100% DMSO. La concentración final debe ser de 2 M 17β-estradiol para el ensayo de ER, y 100 mM de dexametasona para el ensayo de GR. Almacenar las soluciones madre a -20 ° C.
    2. Añadir 15 l de la de la sustancia de referencia apropiada a 285 l de medio de ensayo en un tubo estéril (tubo # 1). Mezclar la muestra con la pipeta hacia arriba y abajo.
    3. Añadir 200 l de una solución de 5% de DMSO en medio de ensayo en 8 tubos adicionales (tubos # 2-9).
    4. Transferir una alícuota de 100 l de tubo # 1 al tubo # 2 a la bañerae # 9 para llevar a cabo una serie de diluciones de 3 veces. Cada muestra diluida debe ser completamente mezclado con una pipeta antes de tomar una alícuota y agregarlo a la siguiente tubo.
  2. Preparar una muestra de control de disolvente mezclando 10 l de DMSO en 190 l de medio de ensayo.
  3. Preparar cuatro diluciones de cada extracto de agua.
    1. En el primer tubo, añadir 5 l de extracto de agua de 95 l de medio de ensayo y mezclar bien. Añadir 50 l de 5% de DMSO en medio de ensayo en otros tres tubos.
    2. Realizar una dilución de 2 veces mediante la transferencia de 50 l de solución de un tubo al siguiente.

3. Preparar la suspensión celular a Llevar a cabo el ensayo biológico, FRET

  1. Preparar el medio específico ensayo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. medio de ensayo debe ser almacenado a 4 ° C y se calentó a 37 ° C en un baño de agua antes de su uso.
  2. Tomar un vial de células de división-ER arrestado o GR fuera de la criogénica librezer y descongelar las células rápidamente colocando el vial en un 37 ° C baño de agua durante 2 minutos con agitación suave. Descontaminar el vial con 70% de etanol y colocarlo en una cabina de seguridad biológica de clase II.
  3. Abrir el vial usando técnicas asépticas y transferir las células en 10 ml de medio de ensayo.
  4. Centrifugar a 200 x g durante 5 min.
  5. Aspirar el sobrenadante usando una pipeta de vidrio estéril y resuspender el sedimento de células en 6 ml de medio de ensayo.
  6. Mezclar 5 l de suspensión de células con 5 l de una solución de vital importancia mancha y añadir una alícuota en una cámara de recuento.
  7. Contar el número de células vivas usando un microscopio de luz o contador de células automatizado y estimar la densidad de células vivas en la suspensión celular. Diluir si es necesario para obtener una densidad final de 550.000 células vivas por ml de medio de ensayo.

4. Las células de la placa en una placa de 96 pocillos Negro pared de fondo transparente y diluido Añadir extracto de agua

  1. Crear una placadiseño que incluye una curva de 9 puntos ensayo de calibración específica, las muestras de QA / QC y múltiples diluciones de cada extracto de agua. Un ejemplo de un diseño de placa de 96 pocillos se muestra en la Figura 1.
  2. Añadir 90 l de medio de ensayo a los pocillos de control libres de células repetidas.
  3. Se vierte la suspensión de células en un depósito de pipeteado estéril y añadir 90 l de suspensión celular a los otros pocillos utilizando una pipeta multicanal.
  4. Añadir 10 l de las muestras diluidas preparadas durante la etapa 2 a los pocillos apropiados. La concentración final de DMSO por pocillo debe ser 0,5% como máximo.
  5. Cubrir la placa con una tapa y colocarla en un incubador de CO2 al 5% a 37 ° C durante 16 horas.

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Figura 1:. Ejemplo de una disposición de las placas de 96 pocillos La placa de múltiples pocillos está diseñado para incluir una curva de calibración específica ensayo, 3 tiposde los controles de QA / QC (medios solamente, células en un medio limpio y células en DMSO claveteado medio) y 4 diluciones por extracto de agua. Cada control y la dilución del extracto de agua se analiza en pocillos por triplicado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Preparar la solución de carga y añadir a cada pocillo

  1. Después de la incubación, dejar que la placa se equilibre a temperatura ambiente. Para este bioensayo FRET, los pasos 5.2 a 5.6 deben llevarse a cabo en ausencia de luz directa.
  2. Preparar una solución de 6x carga de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  3. Añadir 20 l de la solución de carga 6x a cada pocillo.
  4. Añadir 10 l de reactivo de la viabilidad celular a cada pocillo para evaluar la citotoxicidad del extracto de agua diluida.
  5. Sellar la placa con película adhesiva de aluminio.
  6. Se incuba la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 horas.

6. Medida de citotoxicidad y actividad de respuesta endocrina

  1. Configurar el lector de microplacas con capacidades de lectura de abajo siguiendo las instrucciones del fabricante.
  2. Para el bioensayo transactivación FRET, medir la fluorescencia en el azul (409/460 nm, excitación (Ex) / emisión (Em) de longitud de onda) y verde (409 Ex / Em 530 nm) canales.
  3. Para el ensayo de citotoxicidad, medir la fluorescencia a 560 Ex / Em 590 nm.

7. Evaluar QA / QC cheques para determinar la calidad de los Datos

  1. Comparar la fluorescencia prima media de la libre de células (medio solamente) y controles de sólo células (células en medio de ensayo limpio). La fluorescencia de fondo de medios de comunicación sólo debe ser al menos 25% más baja que la respuesta del control de las células solamente.
  2. Procesar los datos de FRET primas. Para ambos conjuntos de datos 'azules' y 'verdes', restar la fluorescencia media de los pocillos de control de células libres de toda célula que contiene también. Calcula elrelación azul / verde para cada pocillo experimental.
  3. Comparar relación azul / verde de las células y las células sólo para los controles con DMSO. los valores de fluorescencia de los controles deberán estar dentro del 15% de desviación estándar relativa (RSD).
  4. Trazar la curva de calibración específica ensayo como relación azul / verde contra la concentración de la muestra se expresa como una masa molecular de registro (log M). Calcular la pendiente, R2 y log CE 50 (50% Concentración de efecto). Los parámetros de calibración deben estar dentro del rango esperado que figuran en la Tabla 1.
  5. Calcular la RSD para todos los pocillos por triplicado. La variabilidad entre los distintos recipientes debe ser inferior a 20%.
  6. Para los datos de citotoxicidad (560 Ex / Em 590 nm), restar el promedio de control libre de células (es decir, el fondo de medios) de todos los pozos que contienen células.
  7. Se calcula la media de fluorescencia de fondo-resta para cada muestra. Representar gráficamente los datos de fluorescencia resultantes como un porcentaje del control de DMSO. diluciones de la muestra no deberíaexhibir la mortalidad celular más de 20% en comparación con las células de sólo y DMSO controles.

8. Análisis de datos

  1. Calcular el límite de detección del ensayo (LOD) como la respuesta de calibración mínimo más dos desviaciones estándar de la media de esa respuesta.
  2. Para las muestras que muestran una relación dosis-respuesta, derivar la CE 50   del extracto de agua utilizando la pendiente de una regresión lineal de la curva de calibración entre 10 y 50% las concentraciones de efectos de la sustancia de referencia.
  3. Calcular la concentración Bioanalytical Equivalente (BEQ) usando la fórmula: CE = BEQ 50 de sustancia de referencia / CE 50 de muestra de agua.

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Resultados

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En el presente estudio, se seleccionaron muestras de 4x 24 hr compuestos de efluentes de aguas residuales municipales tratadas, 6 muestras al azar de las aguas superficiales de sistemas de agua dulce en el sur de California y un campo en blanco que consiste en agua ultrapura para ilustrar este protocolo. 3 de las 4 muestras de los efluentes de las plantas fueron activados convencionales de tratamiento de lodos de aguas residuales ( "efluente secundario"), y la cuarta de una planta de tra...

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Discusión

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La potencia bien documentado de los estrógenos ambientales, tales como 17β-estradiol (E2), Presentación de órdenes de estos productos químicos en concentraciones / L 23,24 ng. En este estudio, la respuesta ER para los efluentes de aguas residuales (rango de BEQ de: 2.3 a la 17 MAL E2 / L) fue algo superior a la reportada para efluente secundario de la EDAR de Australia 20, mientras que los EQB para las aguas superficiales (<0,5 a 4 ng E2 / L ) se encontraban dentro del rango reportado para la su...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La financiación fue proporcionada por la Junta Estatal de Control de Recursos Hídricos (Acuerdos Nº 10-096-250 y 14-090-270). Agradecemos a S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi y J. Printen. Los autores declaran no tener conflicto de intereses, y la referencia a los nombres comerciales no implica su aprobación.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de ensayo GeneBLAzer ER alpha DAEl kit ThermoFisherK1393incluye células detenidas por división (DA) de ER y kit de carga LiveBLAzer FRET.
El kit de ensayo ThermoFisherK1391incluye células detenidas por división (DA) GR y kit de carga LiveBLAzer FRET.
Reactivo de viabilidad celular PrestoBlue ThermoFisherA-13261
Azul tripano, 0.4% en PBSSigma-Aldrich T8154También disponible en ThermoFisher
Corning Pared negra de 96 pocillos, placa de fondo transparenteCorning3603Envuelto individualmente, estéril con tapa
Filtros de fibra de vidrio Whatman, GF/A, 1.6 y micro; MSigma-Aldrich 
Película de sellado de aluminio MicroplateE& Cartucho K ScientificT592100
Oasis HLB de 6 cc, sorbente de 200 mgWatersWAT106202
17β EstradiolSigma-Aldrich E2758CAS #50-28-2
Ácido ascórbicoFisher ScientificA61-100También disponible en Sigma-Aldrich
Dexametasona  Sigma-Aldrich D4902CAS #50-02-2
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-Aldrich D8418Solventes de grado molecular
(acetona, hexano, metanol)Azidasodio de grado HPLC de Fisher
Sigma-Aldrich S2002es altamente tóxico y debe manipularse con precaución. Use ropa protectora y pese debajo de una campana extractora. También disponible en EMD Millipore.
Contador de células automatizado o hemocitómetroVarios*Entre los proveedores se encuentran Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich y ThermoFisher.
Cabina de seguridad biológica de clase IIVarios*
CO2 incubadoraVarios*
Congelador criogénico Varios*Se recomienda el almacenamiento de nitrógeno líquido.
Lector de microplacas de fluorescenciaVarios*  El lector debe tener capacidad de lectura inferior.
* No se recomienda la fuente, la elección de este equipo depende del presupuesto, la frecuencia de uso y el espacio del laboratorio.
WHA1820025 de Scientific El producto químico

Referencias

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