Se adaptó un protocolo para detectar la actividad endocrina en extractos orgánicos de muestras de agua, incluidos los efluentes de aguas residuales tratadas y el agua superficial (receptora), utilizando bioensayos de transactivación in vitro disponibles comercialmente para detener la división ("congelar y descongelar").
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Artículo de método
La detección de la actividad endocrina en Uso de Agua comercialmente disponibles
En este artículo
Resumen
Resumen
En los bioensayos de transactivación in vitro han mostrado prometedor como herramientas de supervisión de la calidad del agua, sin embargo, su adopción y aplicación generalizada se ha visto obstaculizada debido en parte a la falta de métodos estandarizados y la disponibilidad de la tecnología robusta, fácil de usar. En este estudio, se emplearon, líneas celulares de división a detener disponibles en el mercado para la detección cuantitativa de la actividad endocrina de los productos químicos presentes en las muestras de agua de interés para los profesionales de la calidad del medio ambiente. Un protocolo único, estandarizado que incluía aseguramiento de calidad / control de calidad (QA / QC) comprueba si se ha desarrollado para la actividad de estrógeno y receptor de glucocorticoides (GR y ER, respectivamente) utilizando un ensayo de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia basado en células (FRET). Las muestras de los efluentes tratados municipal de aguas residuales y agua de superficie de sistemas de agua dulce en California (EE.UU.), se extrajeron mediante extracción en fase sólida y se analizó la actividad endocrina utilizando el proto estandarizadacolumna. Antecedentes y dosis-respuesta para los productos químicos de referencia de punto final específico cumplen las directrices de AC / CC que se consideren necesarias para la medición fiable. La respuesta de detección bioensayo para las muestras de agua de la superficie no era en gran parte detectable. Por el contrario, las muestras de efluentes de plantas de tratamiento secundario tuvieron la mayor actividad medible, con concentraciones equivalentes de bioensayo estimado (EQB) de hasta 392 ng de dexametasona / L para GR y 17 ng de 17β-estradiol / L para el ER. La respuesta bioensayo para una muestra de efluente terciario fue menor que el medido para los efluentes secundarios, lo que indica un residual inferior de endocrinos químicos activos después del tratamiento avanzado. Este protocolo mostró que en los bioensayos de transactivación in vitro que utilizan comercialmente disponible, la división celular detenido de "kits", se puede adaptar para la detección de la actividad endocrina en agua.
Introducción
El monitoreo actual calidad del agua se basa en la capacidad de medir con exactitud y precisión la presencia de contaminantes químicos como sustituto de la exposición a la fauna y los seres humanos. Sin embargo, esta vigilancia química por sustancia y paradigma de la evaluación no pueden seguir el ritmo del universo químico en constante cambio al que nos enfrentamos. A medida que aprendemos más sobre el destino y los efectos de los productos químicos sintéticos y naturales, continuamos la búsqueda de herramientas de medición que espera abordar los impactos biológicos, y que al mismo tiempo son inmunes a los cambios en la producción de sustancias químicas, el uso y la....
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Protocolo
1. Recoger y la Muestra de aguas de procesos (Modificado de Escher y otros. 9)
- Llenar un 1 L frasco de vidrio ámbar limpia que contiene 1 g de azida de sodio y ácido ascórbico 50 mg a la parte superior con la muestra de agua de interés. conserve la muestra a 4 ° C y proceso dentro de 72 horas.
NOTA: La azida sódica es altamente tóxico y debe manejarse con precaución. Use equipo de protección (gafas / máscara, guantes, ropa) y pesar en una campana de humos que funcione correctamente. No use una espátula de metal para el pesaje. - Pasar la muestra a través de un filtro de fibra de vidrio 1,6 M y luego a través de un cartuch....
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Resultados
En el presente estudio, se seleccionaron muestras de 4x 24 hr compuestos de efluentes de aguas residuales municipales tratadas, 6 muestras al azar de las aguas superficiales de sistemas de agua dulce en el sur de California y un campo en blanco que consiste en agua ultrapura para ilustrar este protocolo. 3 de las 4 muestras de los efluentes de las plantas fueron activados convencionales de tratamiento de lodos de aguas residuales ( "efluente secundario"), y la cuarta de una pla.......
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Discusión
La potencia bien documentado de los estrógenos ambientales, tales como 17β-estradiol (E2), Presentación de órdenes de estos productos químicos en concentraciones / L 23,24 ng. En este estudio, la respuesta ER para los efluentes de aguas residuales (rango de BEQ de: 2.3 a la 17 MAL E2 / L) fue algo superior a la reportada para efluente secundario de la EDAR de Australia 20, mientras que los EQB para las aguas superficiales (<0,5 a 4 ng E2 / L ) se encontraban dentro del rango reportado para la su.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
La financiación fue proporcionada por la Junta Estatal de Control de Recursos Hídricos (Acuerdos Nº 10-096-250 y 14-090-270). Agradecemos a S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi y J. Printen. Los autores declaran no tener conflicto de intereses, y la referencia a los nombres comerciales no implica su aprobación.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de ensayo GeneBLAzer ER alpha DA | El kit ThermoFisher | K1393 | incluye células detenidas por división (DA) de ER y kit de carga LiveBLAzer FRET. |
| El kit de ensayo ThermoFisher | K1391 | incluye células detenidas por división (DA) GR y kit de carga LiveBLAzer FRET. | |
| Reactivo de viabilidad celular PrestoBlue | ThermoFisher | A-13261 | |
| Azul tripano, 0.4% en PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | También disponible en ThermoFisher |
| Corning Pared negra de 96 pocillos, placa de fondo transparente | Corning | 3603 | Envuelto individualmente, estéril con tapa |
| Filtros de fibra de vidrio Whatman, GF/A, 1.6 y micro; M | Sigma-Aldrich | ||
| Película de sellado de aluminio Microplate | E& Cartucho K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB de 6 cc, sorbente de 200 mg | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ácido ascórbico | Fisher Scientific | A61-100 | También disponible en Sigma-Aldrich |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Solventes de grado molecular |
| (acetona, hexano, metanol) | Azida | sodio de grado HPLC de Fisher | |
| Sigma-Aldrich | S2002 | es altamente tóxico y debe manipularse con precaución. Use ropa protectora y pese debajo de una campana extractora. También disponible en EMD Millipore. | |
| Contador de células automatizado o hemocitómetro | Varios* | Entre los proveedores se encuentran Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich y ThermoFisher. | |
| Cabina de seguridad biológica de clase II | Varios* | ||
| CO2 incubadora | Varios* | ||
| Congelador criogénico | Varios* | Se recomienda el almacenamiento de nitrógeno líquido. | |
| Lector de microplacas de fluorescencia | Varios* | El lector debe tener capacidad de lectura inferior. | |
| * No se recomienda la fuente, la elección de este equipo depende del presupuesto, la frecuencia de uso y el espacio del laboratorio. |
Referencias
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrin....
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Ensayo biol gico de transactivaci n in vitrocribado de actividad endocrinamonitoreo de la calidad del aguaensayo del receptor de estr genosensayo del receptor de glucocorticoidestransferencia de energ a por resonancia de fluorescenciaextracci n en fase s lidac lulas con detenci n del ciclo celularconcentraci n equivalente del bioensayogarant a de calidad y control de calidad
