Un simple ensayo de fluorescencia para la cuantificación de los neutrófilos extracelular canina Trampa de lanzamiento

Resumen

trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) son redes de ADN, histonas y proteínas de neutrófilos. Aunque un componente de la respuesta inmune innata, redes están implicados en la autoinmunidad y la trombosis. Este protocolo describe un método simple para el aislamiento de neutrófilos canino y cuantificación de los TNE utilizando un ensayo de fluorescencia de microplacas.

Resumen

Las trampas extracelulares de neutrófilos son redes de ADN, histonas y proteínas de neutrófilos liberadas en respuesta a estímulos infecciosos e inflamatorios. Aunque son un componente de la respuesta inmunitaria innata, los TNE están implicados en una serie de procesos patológicos, como la autoinmunidad y la trombosis. Este protocolo describe un método sencillo para el aislamiento de neutrófilos caninos y la cuantificación de NETs mediante un ensayo de fluorescencia en microplaca. La sangre se extrae mediante técnicas convencionales de venopunción. Los neutrófilos se aíslan mediante sedimentación de dextrano y un gradiente de densidad utilizando condiciones optimizadas para la sangre de perro. Después de dejar tiempo para la unión a los pocillos de una placa de 96 pocillos, los neutrófilos se tratan con agonistas inductores de NET como el forbol-12-miristato-13-acetato o el factor activador de plaquetas. La liberación de ADN se mide por la fluorescencia de un tinte de ácido nucleico impermeable a las células. Este ensayo es un método sencillo y barato para cuantificar la liberación de NET, pero la formación de NET, más que otras causas de muerte celular, debe confirmarse con métodos alternativos.

Introducción

Hay más de 70 millones de perros en los EE.UU. solamente ^1. Como miembros de la familia valorados, estos animales a menudo reciben la atención médica de corte borde. Del mismo modo, ya que comparten nuestro medio ambiente, los perros pueden ayudar a comprender la patogénesis y el tratamiento de las enfermedades humanas ^1. Sin embargo, si la traducción de los descubrimientos en la medicina humana en tratamientos veterinarios o viceversa, es importante para caracterizar completamente las variaciones de especies incluso en sistemas altamente conservadas tales como la respuesta inmune innata. Ejemplos de diferencias entre el canino y el sistema inmu....

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo con el permiso del Comité de ética de la Universidad Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Estado de Iowa.

1. Recolección de Sangre

1. Dibuje 9 ml de sangre de un safena, la vena cefálica o yugular directamente en anticoagulante (por ejemplo, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 1,8 mg K ₂ EDTA / ml de sangre) vacutainers, o en una jeringa con transferencia inmediata a tubos de sangre que contenían EDTA. rodar suavemente o invertir los tubos de sangre para asegurar una mezcla adecuada de la sangre y anti-coagulante.

2. Aislamiento de neutrófilos ....

Resultados

Usando este protocolo, debería haber un cambio veces fuerte en la fluorescencia después de la estimulación de los neutrófilos con los controles positivos, PMA y PAF. Como se ilustra en la Figura 1B, la estimulación de los neutrófilos caninos con 31 mM de PAF para 1 hr resultados en un aumento de 4,0 veces en la fluorescencia media en comparación con las células no estimuladas (rango 2,0 a 5,8, n = 5 perros) ^18. PMA a 0.1 M (Figura 1A) es un ag.......

Discusión

El ensayo de liberación de ADN presentada es un ensayo fácilmente cuantificables para el ADN extracelular. El método fue adaptado de técnicas similares que se utilizan para evaluar la formación neta de otras especies, pero la velocidad de centrifugación, las concentraciones de agonistas y los tiempos de incubación han sido alterados para optimizar el método para su uso con los neutrófilos caninos ^8,17,18. ajustes similares podrían hacerse para adaptar el método para otras especies. El ensayo es sencillo y de .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de plástico de sangre entera con recubrimiento en aerosol K2EDTA	BD	367835
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Dextran-500	Corporación química y científica precisa.
Solución salina tamponada con fosfato	ThermoFisher scientific	20012043
Suero fetal para terneros bovinos, inactivado por calor	ThermoFisher scientific	10100139
RPMI Media 1640, sin rojo fenol ni L-glutamina	ThermoFisher scientific	32404-014	Debe estar libre de rojo fenol
Placa de poliestireno estéril de fondo plano 96 pozos	Falcon
Forbol 12-miristato 13-acetato	Sigma-Aldrich	P1585
Factor activador de plaquetas	Sigma-Aldrich	P4904
SYTOX Tinción de ácido nucleico verde	ThermoFisher scientific	S7020
Synergy 2 Lector multimodo	BioTek	NA

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