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El uso de un cartucho de filtro para la filtración de agua Las muestras y extracción de ADN del Medio Ambiente

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DOI:

10.3791/54741

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25 de noviembre de 2016

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1Department of Ecology and Environmental Sciences, Natural History Museum and Institute, Chiba, 2Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 3Faculty of Science and Technology, Ryukoku University, 4Okinawa Churashima Research Center, 5Graduate School of Simulation Studies, University of Hyogo

En este artículo

Resumen

Describimos un protocolo para la filtración de muestras de agua con un cartucho de filtro y la extracción de ADN ambiental (eDNA) sin tener que abrir la carcasa para quitar el filtro. Este protocolo está desarrollado para el metabarcoding del eDNA de los peces, pero también es aplicable al eDNA de otros organismos.

Resumen

Estudios recientes demostraron que el uso del ADN ambiental (ADNe) de los peces es apropiado como herramienta de monitoreo no invasiva. La mayoría de estos estudios emplearon filtros de fibra de disco para recolectar eDNA de muestras de agua, aunque varios estudios microbianos en ambientes acuáticos han empleado cartuchos de filtro, porque el cartucho tiene la ventaja de acomodar grandes volúmenes de agua y de facilidad de uso en general. Aquí proporcionamos un protocolo para la filtración de muestras de agua utilizando el cartucho de filtro y la extracción de eDNA del filtro sin tener que abrir la carcasa. Las partes principales de este protocolo consisten en: 1) filtración de muestras de agua (volúmenes de agua ≤4 L o >4 L); (2) extracción de ADN en el filtro utilizando un agitador de rodillos colocado en una incubadora precalentada; y (3) purificación de ADN utilizando un kit comercial. Con el uso de este y otros protocolos utilizados anteriormente, realizamos un análisis de metabarcoding de ADNe tomado de un enorme tanque de acuario (7.500m3) con composición de especies conocida, y mostramos el número de especies detectadas por biblioteca de los dos protocolos como resultados representativos. Este protocolo se ha desarrollado para el metabarcoding del eDNA de los peces, pero también es aplicable al eDNA de otros organismos.

Introducción

ADN Ambiental (Edna) en los ambientes acuáticos se refiere a material genético que se encuentra en la columna de agua. Estudios recientes han demostrado la utilidad de Edna para la detección de peces de diferentes ambientes acuáticos, incluyendo estanques, ríos 1-3 4-8, corrientes 9, 10-14 y agua de mar. La mayoría de estos estudios se centraron en la detección de una sola o unas pocas invasiva 1,4-6,8,14 y especies raras o amenazadas 3,9, mientras que algunos estudios recientes intentaron detección simultánea de múltiples especies en las comunidades locales de pescado 7,9, 12,13,15 y mesocosmos 11,12.

Este último enfoque se denomina "metabarcoding" y Edna metabarcoding utiliza uno o varios conjuntos de cebadores de PCR para coamplify una región génica a través de taxonómicamente diversas muestras. Esto es seguido por la preparación de la biblioteca con la indexación y la adición adaptador, y las bibliotecas de indexado se analizan mediante una secuenciación paralela de alto rendimientoplataforma. Recientemente Miya et al. 12 desarrollaron cebadores universales de PCR para metabarcoding Edna de peces (llamados "MiFish"). Los cebadores MiFish se dirigen a una región hipervariable del gen mitocondrial 12S rRNA (163-185 pb), que contiene información suficiente para identificar peces a la familia taxonómica, género y especie a excepción de algunos congéneres estrechamente relacionadas. Con el uso de estos cebadores en Edna metabarcoding, Miya et al. 12 detectaron más de 230 especies marinas subtropicales de tanques del acuario con conocidos composición de las especies y arrecifes de coral cerca del acuario.

Al tiempo que optimiza el protocolo metabarcoding para dar cabida a agua de mar natural con diferentes niveles de concentración de peces Edna, nos hemos dado cuenta de que los cebadores MiFish vez en cuando no amplificar la región diana para la posterior elaboración de la biblioteca. Una de las razones más probables para esta amplificación por PCR pierda falta de cantidades adecuadas de la teADN mplate contenida en pequeños volúmenes de agua filtrada (es decir, 1-2 L). Aunque la concentración de Edna de un grupo taxonómico específico es desconocido antes de la amplificación, filtración de grandes volúmenes de agua (> 1-2 L) sería un medio sencillo y eficaz para recoger más Edna de los ambientes acuáticos con escasa abundancia de peces y la biomasa, tales como de alta mar y de aguas profundas ecosistemas.

En relación con filtros de fibra de disco utilizado convencionalmente en una serie de investigaciones Edna pescado 16, cartuchos de filtro tienen la ventaja de acomodar volúmenes de agua más grandes antes de obstrucción 17. De hecho, un estudio reciente mostró gran volumen (> 20 l) de filtración de muestras de agua marina costeras que utilizan cartuchos de filtro 18. Además, se empaquetan individualmente y estéril, y varios pasos del flujo de trabajo experimental se pueden realizar en la carcasa del filtro, reduciendo así la probabilidad de contaminación del laboratorio 19. El últimocaracterística es crítica por Edna metabarcoding, en el que el riesgo de contaminación se mantiene entre los más grandes experimental desafía 20,21. A pesar de estas ventajas técnicas de cartuchos de filtro, no se ha utilizado en estudios Edna de peces con dos excepciones 8,15.

Aquí se proporciona un protocolo para la filtración de muestras de agua con el cartucho de filtro y extracción de Edna de su filtro sin tener que cortar y abrir la carcasa. También disponemos de dos sistemas de filtración de agua alternativos dependiendo de los volúmenes de agua (≤4 L o> 4 L). Para comparar el rendimiento del protocolo de nuevo desarrollo y un protocolo utilizado previamente utilizando un filtro de fibra de vidrio en nuestro grupo de investigación 12,14,22,23, realizamos Edna metabarcoding análisis de agua de mar de un gran tanque de acuario (7,500 m 3 ) con la composición de las especies conocidas, y mostrar el número de especies detectadas derivados de los dos protocolos como resultados representativos. Este protocolo hcomo se han desarrollado para metabarcoding Edna de peces, sino que también es aplicable a Edna de otros organismos.

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Protocolo

NOTA: Este protocolo no aborda los métodos de toma de muestras de agua y metabarcoding. El agua puede tomarse muestras de diferentes maneras dependiendo de los propósitos del estudio 16 y vea Miya et al. 12 para detalles de los métodos que utilizan cebadores metabarcoding MiFish. Tenga en cuenta que el agua en la muestra se debe mantener muy frío y se filtró dentro de unas pocas horas para evitar la degradación de Edna. Tenga en cuenta también que este protocolo implica el uso de un agitador rotatorio y una incubadora, y este último debe ser lo suficientemente grande para dar cabida a la primera. Además, una centrífuga que puede acomodar a ambos 15 ml y 50 ml tubos cónicos es indispensable para eliminar el líquido restante del filtro post-filtración y para recoger ADN extraído dentro del cartucho, respectivamente.

1. El procesamiento de un tapón de rosca y una bolsa de plástico de 1 L

NOTA: Omita este paso si el volumen de filtración es> 4 L.

  1. Perforar un agujero a través del centro de un tornillo cap (unido a una bolsa de plástico 1 L desechable) con el mismo diámetro (4,8 mm) que el tubo que se proyecta desde un conector luer-lock macho. El uso de alicates diagonales, acortar el tubo del conector luer-lock macho a una longitud apropiada (ca. 3 mm) para evitar la obstrucción de una pequeña cantidad de agua dentro de la tapa después de la filtración.
  2. Aplicar un pegamento adhesivo especializado para el polietileno (PE) y polipropileno (PP) tanto al fondo y la superficie del conector de cierre luer macho y tapón de rosca, respectivamente. Espere unos minutos para una buena unión adhesiva (consulte las instrucciones del fabricante).
  3. Insertar el conector Luer macho en el orificio de la tapa roscada. Espere hasta que la unión adhesiva completa de las dos partes (generalmente> 24 h). Esterilizar el tapón de rosca con el conector luer-lock macho con 10% de lejía comercial (ca. 0.6% de hipoclorito de sodio) antes de su uso.
  4. Haga dos agujeros en las dos esquinas inferiores de la bolsa de plástico de 1 litro con el fin de colgarlo de un mesPanel h (paso 3). Asegúrese de que el diámetro de los agujeros es mayor que el de las patas del panel de malla.

2. Montaje del sistema de filtración

  1. Fije el tubo de alto vacío para el conector de entrada de una bomba de aspiración y conecte el otro extremo del tubo a un colector. Asegúrese de que los tres de color rojo camisetas válvulas del colector están en la posición "off" (es decir, horizontal).
  2. El uso de un conjunto de guantes limpios, inserte un adaptador luer hembra y un conector de vacío en los extremos superior e inferior de la tubería de goma de vacío para la filtración, respectivamente.
  3. adjuntar cuidadosamente el accesorio Luer hembra a un puerto de salida del cartucho de filtro y conecte el conector de vacío para un tapón de silicona.

3. La filtración de las muestras de agua (L) ≤4 utilizando el cartucho de filtro

NOTA: Omita este paso si el volumen de filtración es> 4 L. Este sistema de filtración requiere un panel autoportante de fo colgar la bolsa de plástico llena de 1 L de agua. Un panel de malla, múltiples puntas, y un soporte para el panel, todos disponibles en tiendas en línea, serían útiles para el montaje de esta unidad. Autoclave la entrada y salida tapones luer para el cartucho de filtro antes de su uso.

  1. Verter el agua muestreada 1 L en la bolsa de plástico y cerrar el tapón roscado con el conector Luer macho.
  2. conectar con cuidado un orificio de entrada del cartucho de filtro montado con el conector luer-lock macho de la bolsa de plástico. No apriete demasiado el conector de cierre luer; de lo contrario la unidad se escape una vez que el bombeo se inicia. Asegúrese de que todas las conexiones son seguras antes de colgar la bolsa de plástico de un panel de malla.
  3. Con cuidado, colgar la bolsa de plástico con el cartucho del filtro de dos dientes en el panel de malla e insertar un tapón de silicona en un orificio de entrada del colector.
  4. Encienda el aspirador. Abrir las válvulas T rojos para la filtración. Ejecutar el colector hasta que el cartucho de filtro esté seco, tuando su vez la camiseta roja de la válvula a la posición de apagado.
  5. Repita 3.1-3.4 pasos hasta que se filtra la cantidad deseada de agua.
    NOTA: Para 1 litro de agua tomada de los arrecifes coralinos subtropicales, se tarda alrededor de tres minutos para la filtración.
  6. Retirar con cuidado el cartucho de filtro de la bolsa de plástico y la conexión de vacío.
  7. Tape ambos extremos del cartucho con las tapas de entrada y salida luer.
  8. Etiquetar el tapón del cartucho y Luer de entrada apropiada utilizando una pluma de solvente a prueba de secado rápido y etiquetado no se corra.
  9. Guarde el cartucho de filtro a -20 ° C antes de la extracción de ADN.

4. La filtración de agua (> 4 l) Las muestras utilizando el cartucho de filtro

Nota: omitir este paso si el volumen de filtración de agua es ≤4 L. Este sistema de filtración requiere una botella libro de 10 l equipado con una válvula y una punta de pipeta desechable de 10 ml. Un diámetro interior de la punta de la pipeta 10 ml (15,0 mm) y una conicidad de la puntafinal debe ajustarse a un diámetro exterior de la la válvula (15,0 mm) y el puerto de entrada del cartucho de filtro, respectivamente. Ambas conexiones son retenidos de forma segura durante la filtración en un ajuste de fricción. Esterilizar la punta de la pipeta con un 10% de lejía comercial (ca. 0,6% de hipoclorito de sodio) antes de su uso.

  1. Preparar una cantidad apropiada de agua muestreada en la botella libro. inserte firmemente la punta de la pipeta 10 ml en la válvula de la botella de 10 l libro.
  2. Estrechamente insertar el puerto de salida del cartucho de filtro en el extremo de la punta de pipeta e insertar el tapón de silicona en el puerto de entrada del colector. Encienda el aspirador. Abrir las válvulas T rojos para la filtración. Ejecutar el colector hasta que el cartucho de filtro esté seco, luego gire la válvula en T rojo a la posición de apagado.
    NOTA: Para obtener 10 L de agua de mar tomada de los arrecifes de coral exteriores subtropicales, se tarda unos 30-40 minutos para la filtración.
  3. Retirar con cuidado el cartucho de filtro de la bolsa de plástico y la conexión de vacío. Cap tantoextremos del cartucho con la entrada y salida tapones luer. Etiquetar el tapón del cartucho y Luer de entrada apropiada utilizando una pluma de solvente a prueba de secado rápido y etiquetado no se corra. Guarde el cartucho de filtro a -20 ° C antes de la extracción de ADN.

5. Extracción de Edna del filtro

Nota: En los pasos 4 y 5, se utiliza un kit comercial, en gran parte siguiendo un protocolo de "sangre nucleado" proporcionado por el kit. Por simplicidad, se describe el procedimiento para el procesamiento de un cartucho individual. En la práctica, se recomienda procesamiento 8 (o el número máximo de la centrífuga) o menos filtros a la vez.

  1. Precalentar una incubadora a 56 ° C.
  2. Preparar un tubo de 2,0 ml por el corte de la tapa articulada del tubo. Deseche la tapa.
    NOTA: Este tubo se utiliza como un tubo de recogida para el líquido que queda en el filtro.
  3. Retire la entrada (NO salida) tapón luer del cartucho de filtro e insertar el puerto de entrada into el tubo de recogida. sellar herméticamente una conexión entre el tubo del cartucho y colección usando una película de auto-sellado.
  4. Inserte la unidad combinada en un adaptador de centrífuga para un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar el cartucho a 5.000 xg durante 1 min para eliminar el líquido residual en el filtro.
  5. Retire el tubo de extracción del cartucho de filtro y desechar el tubo. Re-cap el puerto de entrada del cartucho.
  6. Preparar una mezcla de 20 l solución de proteinasa-K, 220 l de PBS (solución salina tamponada con fosfato; no proporcionado por el kit) y 200 l de tampón AL.
    NOTA: El cartucho de filtro tiene capacidad para hasta cuatro veces el volumen de la mezcla (. Ca 1,8 ml).
  7. Retire la tapa de entrada y añadir la mezcla (440 l) en el cartucho de filtro usando una punta de pipeta. Insertar la pipeta completamente en el puerto de entrada de modo que la punta de la pipeta es visible en el interior del cartucho de justo por encima de la membrana.
  8. Vuelva a tapar el orificio de entrada y colocar el filtro de cocheTridge en un agitador rotatorio.
  9. Coloque el agitador rotatorio en la incubadora precalentado a 56 ° C y encienda el agitador a una velocidad de 20 rpm durante 20 min.
  10. Durante la incubación, preparar un nuevo tubo de 2,0 ml, etiquetar el tubo de manera apropiada utilizando una pluma de solvente a prueba y colocarlo en un tubo cónico de 50 ml.
    NOTA: el primero (2,0 ml) y últimos tubos (50 ml) se utilizan para la recogida del ADN extraído y para sujetar el tubo de 2,0 ml, respectivamente.
  11. Después de la incubación, retirar la tapa de entrada e inserte la entrada (NO salida) del puerto del cartucho en el tubo de 2.0 ml dentro del tubo cónico de 50 ml. Cerrar el tubo cónico de 50 ml con un tapón de rosca.
  12. Centrifugar el tubo cónico de 50 ml a 5.000 xg durante 1 min para recoger el ADN extraído del cartucho. Retire el cartucho de filtro y el tubo de 2,0 ml usando pinzas esterilizadas y tapar el tubo. Desechar el cartucho del filtro.

6. Purificación del ADN extraído

NOTA: Edna eluir con 100 l de tampón AE en lugar de 200 l especificados en el manual del kit comercial.

  1. Añadir 200 l de etanol (96-100%) para el ADN extraído en el tubo de 2,0 ml de la etapa anterior (ca. 440 l), y se mezcla a fondo por agitación.
  2. Pipetear la mezcla en una columna de giro colocado en un tubo de recogida de 2 ml. Se centrifuga a 5.000 g durante 1 min. Desechar el flujo continuo y el tubo de recogida.
  3. Colocar la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recogida de 2 ml, añadir 500 l de tampón AW1, y centrifugar durante 1 min a 5.000 x g. Desechar el flujo continuo y el tubo de recogida.
  4. Colocar la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recogida de 2 ml, añadir 500 l de tampón AW2 y centrifugar durante 3 minutos a 20.000 x g. Desechar el flujo continuo y el tubo de recogida.
  5. Prepare un nuevo tubo de 1,5 ml (no incluidos en el kit) y la etiqueta del tubo de manera apropiada utilizando una pluma a prueba de agua para el secado rápido y etiquetado no se corra. Transferir la columna de centrifugación to el tubo de 1,5 ml.
  6. Eluir el ADN mediante la adición de 100 l de tampón AE al centro de la membrana de la columna de centrifugación. Incubar durante 1 min a temperatura ambiente, y luego centrifugar a 6000 xg durante 1 min.
  7. Desechar la columna de centrifugación y tapar el tubo. Almacenar el ADN purificado a -20 ° C.

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Resultados

Técnicamente es difícil de aislar y cuantificar solamente Edna peces de la Edna mayor extraído, ya que los cebadores MiFish coamplify la región diana de algunos vertebrados que no son peces, como las aves y los mamíferos, con productos de PCR del mismo tamaño (aprox. 170 pb ) 12. En lugar de cuantificar los peces a Edna, realizamos MiFish metabarcoding análisis de Edna desde un tanque de acuario con la composición de especies conocidas utilizando los dos métodos difer...

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Discusión

En muchos estudios metabarcoding utilizando muestras ambientales tales como el agua y el suelo, el tratamiento post-filtración del cartucho de filtro es generalmente como sigue 24,25: 1) de corte abierto o formación de grietas de la carcasa con herramientas de mano (cortador de tubos o pinzas); 2) la retirada del filtro del cartucho; y 3) cortar el filtro en pequeños trozos con una cuchilla de afeitar para la extracción de ADN. Para evitar este tipo de varios métodos de extracción de ADN engorroso y consume m...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado como investigación básica por CREST de la Agencia Japonesa de Ciencia y Tecnología (JST) y por subvenciones de JSPS/MEXT KAKENHI (Número 26291083) y la Fundación Canon a M.M. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Panel de mallaIris OhyamaMPP-3060-BE
Punta metálicaIris OhyamaMR12F
Soporte para el panel de mallaSin marca4184-9507disponible en Amazon Japón Bolsa de
plástico de 1 L con tapón de roscaYanagiDP16-TN1000
Conector luer-lock machoISIS11620
Punta de pipeta de 10 mlEppendorf0030 000.765
Botella de libro de 10 L con válvulaAs One1-2169-01
Filtro Sterivex-HVMilliporeSVHVL10RCdenotado como "cartucho de filtro" en todo el ms y utilizado en el protocolo
Racor luer machoAs One1-7379-04
Racor luer hembraAs One5-1043-14   
Tapón luer de entradaISISVRMP6
Tapón luer de salidaISISVRFP6
Tubo de alto vacíoComo uno6-590-01
Conector de vacíoComo uno6-663-02
Tapón de siliconaComo uno1-7650-07
ColectorComo uno2-258-01
Aspirador-GAS-1Como Uno1-7483-21
DNeasy Blood & Kit de pañuelos (250)Qiagen69506
PowerWater Kit de aislamiento de ADN Sterivex MOBIO14600-50-NFdenotado como "kit opcional" en el ms
Centrífuga de mesaKubotamodelo 4000Velocidad máxima 6.000 rpm
Rotor de ángulo fijoKubotaAT-508C
Adaptador para tubo cónico de 15 mlKubota055-1280
Solución de estabilización RNAlaterThermo Fisher ScientificAM7020
ParafilmPM992denotado como "película autosellante"

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