Artículo de método

-Alta resolución de mapeo óptico del nodo sinoauricular Ratón

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DOI:

10.3791/54773

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2 de diciembre de 2016

 , 
1Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

En este artículo

Resumen

A continuación, se presenta un protocolo para el mapeo óptico de la actividad eléctrica de la aurícula derecha del ratón y, especialmente, el nodo sinoauricular, con una resolución espacial y temporal alta.

Resumen

Las disfunciones del nódulo sinoauricular (SAN) y las complicaciones asociadas constituyen causas importantes de morbilidad en pacientes con enfermedades cardíacas. El desarrollo de nuevas terapias farmacológicas para curar a estos pacientes se basa en la comprensión profunda de la fisiología normal y la fisiopatología de la RAS. Entre los estudios de marcapasos cardíacos, la RAS de ratón es ampliamente utilizada debido a su factibilidad para modificaciones en la expresión de diferentes genes que codifican canales iónicos SAN o proteínas de manejo de calcio. La evidencia emergente de estudios electrofisiológicos e histológicos también ha demostrado la representatividad y similitud de la estructura y las funciones de la SAN del ratón con los mamíferos más grandes, incluida la presencia de vías de conducción especializadas desde la SAN hasta la aurícula y una compleja jerarquía de marcapasos dentro de la SAN. Recientemente, la técnica de mapeo óptico ha facilitado en gran medida la exploración e investigación del origen de la excitación y la conducción dentro y desde la RAN de ratón, lo que a su vez ha ampliado la comprensión de la RAS y ha beneficiado los tratamientos clínicos de las enfermedades asociadas a la disfunción de la RAS. En este manuscrito, hemos descrito en detalle cómo realizar el mapeo óptico de la SAN de ratón a partir del corazón intacto, perfundido por Langendorff, y de la preparación auricular aislada. Este protocolo es una herramienta útil para mejorar la comprensión de la fisiología y la fisiopatología de la RAS en ratones.

Introducción

Los nuevos avances científicos que conducen a saltos en la comprensión de la fisiología humana suelen ir precedidos de avances tecnológicos. El mapeo óptico fluorescente, por ejemplo, permite la investigación de múltiples parámetros fisiológicos tanto en células como en tejidos. 1,2 Mejoró significativamente nuestra comprensión de cómo la estructura anatómica se asocia con las funciones y disfunciones electrofisiológicas. En el corazón, el marcapasos natural y los sistemas de conducción, como el nódulo sinoauricular (SAN) y la unión auriculoventricular, están formados por miocitos ganglionares que están aislados por los miocitos auriculares circundantes. 3-5 Dicha organización crea estructuras tridimensionales complejas con propiedades eléctricas especializadas. Se ha reconocido que tanto la remodelación estructural como funcional de estas estructuras de marcapasos forman heterogeneidades electrofisiológicas significativas. 6,7 Comprender el mecanismo que subyace a la forma en que tales heterogeneidades dan lugar a disfunciones de SAN y arritmogénesis auricular beneficiará enormemente el tratamiento clínico de estas enfermedades. Requiere una técnica para visualizar la propagación de señales eléctricas a nivel tisular, como el mapeo óptico.

Recientemente, la evidencia acumulada ha demostrado el avance del mapeo óptico en estudios de electrofisiología y patología auricular. 2 Sin embargo, los estudios novedosos y rigurosos dependen de la interpretación precisa de los datos experimentales, cuya validez y estabilidad dependen de protocolos de experimentación cuidadosos. Los ratones modificados genéticamente se utilizan ampliamente para la investigación como modelos animales de enfermedades humanas, como el síndrome del seno enfermo, las anomalías del marcapasos y las arritmias auriculares. 6,8-11 Por lo tanto, una combinación de mapeo óptico fluorescente con modelos de ratones transgénicos proporciona una poderosa herramienta para estudiar las anomalías eléctricas cardíacas asociadas con diversas patologías. En este artículo, presentamos un protocolo para el mapeo óptico de alta resolución de la SAN y el atrio del ratón. Específicamente, discutimos y comparamos diferentes enfoques de carga de tinte, efectos del tiempo en el blanqueo del tinte y la estabilidad de la frecuencia cardíaca durante el experimento.

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Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH Pub. No. 80-23). Todos los métodos y protocolos que se utilizan en estos estudios han sido aprobados por la Universidad de Wisconsin Cuidado de Animales y el empleo Comité de Protocolo siguiendo las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicados por el NIH (publicación No. 85-23, revisada en 1996). Todos los animales utilizados en este estudio recibieron atención humanitaria de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Eliminación del corazón y la perfusión de Langendorff

  1. Antes del aislamiento del corazón, la solución de Tyrode caliente a 37 ° C utilizando un baño de agua y una camisa de agua.
  2. Anestesiar al ratón con isoflurano 5% / 95% de O2.
  3. Garantizar el nivel adecuado de anestesia mediante la comprobación de la pérdida del reflejo del dolor.
  4. Realizar una toracotomía. Abre el cofre mediante el uso de curvas 5.5 "tijeras de Mayo y 5.5" hemostática para Kellyceps para hacer un corte de 1 cm en la parte frontal del tórax.
    1. extraer rápidamente el corazón del pecho (a menos de 30 segundos). Utilice 4 "Iris fórceps curvos para agarrar el tejido pulmonar y cortar el pulmón, el timo y el corazón junto con el pericardio mediante 4.3" tijeras iris. No agarre directamente el corazón.
    2. Lavar en oxigenada (95% O 2/5% de CO 2), a temperatura constante (36,8 ± 0,4 ° C) modificado solución de Tyrode. Utilice la siguiente composición de la solución (en mM): NaCl 128,2, KCl 4,7, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 1,3 CaCl 2, 20,0 NaHCO 3, y 11,1 glucosa (pH 7,35 ± 0,05).
  5. Mientras bañado en la misma solución, identificar el pulmón, el timo y el tejido graso. Con cuidado, diseccionar ellos desde el corazón. Utilice curva 3 "tijeras Vannas-Tübingen y 4,3" # 5 pinzas.
  6. Luego identificar la aorta y canular que en un 21 G cánula a medida. Utilice dos curvas "fuerza # 5B 4.3PD.
  7. Después de la canulación, perfundir simultáneamente (a través de la cánula a una velocidad de flujo de ~ 5 ml / min, lo que debe ajustarse en base a la presión aórtica, ver más abajo) y superfuse (en el baño a una velocidad de flujo de ~ 50 ml / min) el corazón con una solución de Tyrode calentado y se filtró a través de todo el experimento. Pasar la solución de perfusión a través de un filtro de nylon de 11 micras en línea para evitar la obstrucción de la circulación coronaria.
  8. El uso de un transductor de presión (o un indicador de presión) conectado a través de una de 3 vías de bloqueo de la llave de paso Luer a la línea de perfusión, monitorizar la presión aórtica y mantenerla entre 60 y 80 mmHg. Ajustar la velocidad de perfusión, si es necesario para mantener la presión aórtica dentro de este rango.

2. Mapeo óptico de la SAN de todo el corazón Langendorff perfundidos

  1. Instrumentación
    1. Colocar el corazón en posición horizontal y el pin de la punta del ventrículo a la parte inferior revestida de silicio de la cámara usando 0,1 mm de diámetro a pasadores prevenir corriente inducida por el movimiento durante el experimento. 12
    2. Introduzca un pequeño ( "x ID 0,005" 0,012) tubo de silicona en el ventrículo izquierdo (VI) a través de la vena pulmonar, la aurícula izquierda (LA) y la válvula mitral (MV). Fijar el tubo mediante una sutura de seda (4-0) en el tejido conectivo de resonancia.
    3. Coloque el corazón con su cara posterior hacia arriba (Figura 1, panel izquierdo).
    4. Pin el borde del apéndice RA (RAA) a la parte inferior de silicio de la cámara usando diámetro pasadores minutien 0,1 mm. Ajustar su nivel con el fin de hacer que la superficie posterior de la RA plana y permitir que se encuentra el plano focal de la cámara. Esto permitirá que las mediciones ópticas de la superficie máxima de la aurícula.
    5. Soga superior (VCS) e inferior (IVC) de la vena cava por una sutura de seda (4-0), estirar y fijar el otro extremo de la sutura a la parte inferior de una cámara revestida de silicio (véase la Figura 3A). Asegúrese de que las suturas no bloqueen elcampo de vista óptico.
    6. Coloque el electrodo de estimulación a medida en el borde de la RAA. Para hacer electrodos, el uso de silicio recubierto alambres de plata diámetro de 0,25 mm, con 0,5 mm de distancia entre electrodos y carente de silicio para una longitud de 1 mm en el extremo de estimulación. A continuación, coloque dos ECG de 12 mm de aguja (calibre 29) electrodos monopolares cerca de la base de los ventrículos derecho e izquierdo. Coloque el ECG electrodo de tierra cerca del vértice de los ventrículos.
  2. tinción
    1. Dado que los dos tintes fluorescentes y blebbistatin desacoplador electromecánico son sensibles a la luz, realice todos los procedimientos descritos a continuación en un cuarto oscuro. En primer lugar preparar colorante sensible al voltaje RH-237 o di-4-ANNEPS como una solución madre, 1,25 mg / ml en sulfóxido de dimetilo (2,5 mM), que alícuota (30 l cada una) y almacenar las alícuotas a -20 ° C.
    2. Diluir 5-10 l de solución de colorante de valores en 1 ml de solución de Tyrode calentado (37 ° C) y luego inyectarla en la línea de perfusión coronariadurante un período de 5-7 min usando un puerto de inyección en línea Luer.
    3. Preparar blebbistatin como una solución madre (2 mg / ml en dimetilsulfóxido, 6,8 mM) por adelantado y almacenarlo a 4ºC.
    4. Después de 20 min de estabilización, añadir 0,5 ml de calentado (37 ° C) blebbistatin en el perfundido y diluir 0,1 ml de blebbistatin en 1 ml de (37 ° C) solución de Tyrode calentado. A continuación, inyectar en la línea de perfusión coronaria durante un periodo de 5-7 min usando un puerto de inyección en línea Luer.

3. mapeo óptico de la SAN desde el auricular aislada Preparación

  1. Instrumentación
    1. Para la preparación atrial aislado, aislar y canular el corazón como se describió anteriormente en los pasos 1.1-1.5 para la preparación de todo el corazón.
    2. Diseccionar los ventrículos lejos de la cara anterior. Ver Figura 1A, panel derecho, cortar # 1 para más detalles.
    3. Abra la RA cortando a través de la VA tricúspideLVE (TV) a lo largo del eje de TV-SVC. Ver Figura 1A, panel derecho, cortar # 2 para más detalles.
    4. Corte la rama medial de la cresta terminal para abrir el RAA. Ver Figura 1A, panel derecho, cortar # 3.
    5. Abrir la pared libre de la aurícula anterior mediante la realización de un corte de la línea media de la corte anterior # 3 hasta el borde de la esquina inferior derecha de la RAA, aplanar y el pin de la pared libre de la aurícula hasta el fondo de una cámara revestida de silicio. Ver la dirección mostrada por la flecha hueca en la Figura 1A, corte # 4. Preservar un borde de tejido ventricular para fijar la preparación para evitar daños en las aurículas.
    6. Del mismo modo, abierta LA cortando a través de la MV a lo largo de la esquina MV-superior del apéndice LA (LAA).
    7. Para abrir la LAA, cortado desde la mitad de la LAA abierto, a través de la pared libre de la aurícula anterior hasta cerca de un borde medio de la LAA.
    8. Abrir la pared libre de la aurícula alo anteriorendo la misma dirección, y luego aplanar y el pin a la parte inferior de una cámara recubierta con Sylgard.
    9. Retire parcialmente el tejido del tabique interauricular. Esto reducirá la dispersión de la señal óptica a partir de tejido que no está en el foco. Por lo tanto, tanto el LA y RA, así como la SAN y la unión aurículo-ventricular (AVJ) son accesibles en esta preparación (Figura 1B).
    10. Levante la preparación final en alrededor de 0,5 mm desde la parte inferior de la cámara de silicio recubierto con el fin de permitir superfusión desde ambas superficies epicárdicos y endocárdicos.
    11. Superfuse la preparación con calentado (37 ° C) solución de Tyrode a una velocidad constante de 12 ~ ml / min para un flujo de centrado situado cerca de la SVC y ~ 30 ml / min para una superfusión baño.
    12. Coloque el Ag / AgCl 2 electrodo de medida de estimulación (0,25 mm de diámetro) en el borde de la RAA diseccionado. A continuación, coloque dos ECG de 12 mm de aguja (29G) electrodos (monopolar) cerca de la RAA y LAA, respectivamente. Coloque la planta ECG elegidosmontó cerca de la AVJ.
  2. tinción
    1. Realizar una aplicación directa del colorante sensible al voltaje (RH-237 o di-4-ANNEPS). Para esto, diluir 1-2 l de la solución de colorante de valores de 1 mm de solución de Tyrode calentado (37 ° C) y liberar lentamente el colorante diluido en la superficie de la preparación mediante el uso de un 1 mm de la pipeta.
    2. Alternativamente, lleve a cabo la tinción de la aurícula con el colorante sensible al voltaje a través de una perfusión coronaria del corazón perfundido Langendorff similar a la descrita anteriormente para la preparación de todo el corazón (pasos 2.2.1-2.2.2).
      1. Después de la tinción de la perfusión coronaria, aislar la preparación atrial como se describe. Realizar tinción de la superficie adicional cuando sea necesario para alcanzar un nivel de fluorescencia satisfactorio. aislamiento auricular rápido no blanquear el tinte y no afecta a la calidad de la tinción.
    3. Inmovilizar la preparación con el electro-mecánico de desenganche, blebbistatin. Diluir 3-5 l blebbistatin solución madre en la solución de Tyrode calentado (37 ° C) y liberan lentamente el blebbistatin diluida sobre la superficie de la preparación y la solución circundante. Desde blebbistatin ha demostrado ser sensible a la luz, de 13,14 a evitar una larga exposición a la luz durante la preparación y tinción.
    4. Realizar la aplicación blebbistatin adicional tanto como sea necesario para suprimir la contracción. Normalmente hasta 3 aplicaciones adicionales (3-5 l por cada aplicación) se puede utilizar para suprimir el artefacto de movimiento suficientemente con el fin de reconstruir con precisión SAN y activación auricular.
    5. Añadir 0,5 ml adicionales de blebbistatin calentado en el perfundido. Durante este procedimiento, una pausa en la superfusión durante 30 segundos para permitir que el tinte / blebbistatin para teñir el tejido auricular.

4. Mapeo óptico configurar

NOTA:. Una descripción detallada del sistema de mapeo óptico se proporciona en otra parte 12

  1. Utilizar una cámara con una temresolución poral de 2.000 cuadros / seg o superior, y una serie de lentes de condensador para llegar a una resolución espacial de 100 m / pixel o superior. Esto es necesario para reconstruir la activación y propagación SAN intranodal.
  2. Para reducir los artefactos de movimiento de la solución de vibración, fijar un pequeño vidrio de cubierta en la superficie de la solución sobre el corazón / aislados preparación auricular.
  3. Utilice una luz de excitación (520 ± 45 nm de longitud de onda) proporcionado por una corriente constante, lámpara halógena de bajo ruido. Dirigir el haz de luz que se filtra en la preparación mediante el uso de una guía de luz bifurcada flexible.
  4. Se filtra la fluorescencia emitida por un filtro de paso largo (> 715 nm). Recoger, digitalizar y guardar la señal fluorescente adquirida en un software de ordenador utilizando proporcionada por el fabricante de la cámara.

5. Procesamiento de Datos

Nota: Los datos de mapeo óptico se recoge y se almacena como una serie de matrices de intensidad de fluorescencia en diferentes puntos temporales. Cada píxel represeNTS una medida de la intensidad de fluorescencia recogida de una ubicación específica en la preparación del tejido en un punto de tiempo específico. La fluorescencia de fondo se elimina automáticamente por píxel para permitir una mejor visualización de los cambios de fluorescencia producidos por cambios de voltaje de membrana y de arriba abajo para que se corresponda con los potenciales de acción (AP) medidos por los sistemas de microelectrodos. Los detalles de los diferentes pasos en el procesamiento de datos de imágenes ópticas, incluyendo la segmentación de imágenes, filtrado espacial, filtrado temporal, y la eliminación deriva de referencia, se proporcionan en la revisión enfocada. 15

  1. Manualmente o mediante el algoritmo especial (por ejemplo, un umbral o el borde de detección) 15 para determinar los límites del tejido, crear una máscara binaria de 1 (píxeles incluidas) y 0 (píxeles excluidos) y aplicar la máscara para cada trama de la secuencia. Este proceso crea una imagen binaria que pone de relieve las áreas de interés para su posterior procesamiento.
  2. Para mejorar la relación señal-ruido de la opciónlos datos de iCal, filtran las señales dentro de las áreas de interés seleccionadas. Para ello, utilice espacial (es decir, un promedio de píxeles fluorescentes vecinos según la definición de un contenedor de convolución deseado o kernel, por ejemplo 3 x 3 o, para los datos ruidosos, 5 x 5) y / o filtrado temporal (por ejemplo, Butterworth, tipo Chebyshev 1, Chebyshev tipo 2, elíptica etc.) (Figura 2). Tenga en cuenta la posibilidad de artefactos inducidos filtrados-hora de interpretar los datos. Para más detalles, véase la revisión. 15
  3. Retire la deriva de la línea de base en las grabaciones ópticas cuando sea necesario (mediante el uso de filtración de paso alto o ajuste polinómico a la señal original) y luego normalizar cada señal de píxel desde 0 (fluorescencia mínimo) a 1 (fluorescencia máxima).
  4. Seleccionar una ventana de tiempo que abarca los tiempos de activación de todos los píxeles para una única propagación AP. Asignar a cada pixel de su tiempo de activación como el tiempo de derivado de máxima carrera ascendente (dF / dt max, donde F es fluorescenintensidad ce). El uso de todos los tiempos de activación de píxeles, reconstruir el mapa de activación isócrono. Cada isócrona será por lo tanto mostrar los píxeles activados al mismo tiempo.
  5. Para reconstruir el mapa de distribución de la duración del PA (APD), para cada pixel calcular la duración entre el tiempo de activación y el tiempo en un nivel específico de la repolarización (por ejemplo, al 80% de la repolarización, APD 80). El uso de todos los valores de píxel de APD, reconstruir la distribución Mapa isócrono APD. Cada isócrona será por lo tanto mostrar los píxeles con la misma APD.
  6. Para el cálculo de la velocidad de conducción para la propagación AP, adaptarse a una superficie de la preparación de los datos de tiempo de activación calculados en 5.4. Para ello, utilice polinomio superficie de ajuste o local suavizado superficie del núcleo y luego calcular los vectores de velocidad de conducción locales a partir del gradiente de la superficie ajustada.
  7. Para crear el mapa de la repolarización, asignar a cada pixel de su tiempo de repolarización, definida como la segunda derivada máxima (D 2 F / dt2) de la señal óptica en el extremo de la OAP, o el tiempo de 90% de repolarización.

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Resultados

Mapeo óptico de la avería SAN desde el corazón Langendorff perfundidos
Un ejemplo típico de un mapa de contornos activación de la AD reconstruida por el ritmo sinusal espontánea se muestra en la Figura 3 para un corazón de ratón Langendorff perfundidos. El punto de activación temprana se encuentra dentro de la región intercaval cerca del SVC en la red SAN se define anatómicamente. 3,16 Dos RA mapas de contorno de activación adquirido en...

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Discusión

A continuación, presentamos dos tipos de preparaciones de ratón SAN: 1) SAN intacto en el corazón entero perfundido Langendorff, y 2) en el SAN aislado, abrimos la preparación de la aurícula. Estos dos tipos de preparación sirven para diferentes propósitos experimentales. En la preparación todo el corazón perfundido Langendorff, la estructura de la aurícula intacto se conserva lo que hace posible el estudio de arritmias complejas auriculares como la fibrilación auricular, así como las interacciones entre el SAN y el atr...

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Divulgaciones

No se declaran conflictos de intereses.

Agradecimientos

Contamos con el apoyo de la start-up de la Facultad de Medicina de la Universidad de Wisconsin-Madison (A.V.G.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
camisa de aguaRadnoti1660 series Baño de tejidos para procedimientos
de agua / circuladorFisher Scientific1016S amplificador de
presiónAD InstrumentsMLT0670
EMD Millipore Filtros de red de nailon Millipore
Fisher Scientific AD InstrumentosMLT0670
Acero inoxidable Pines Minutien - 0,1 mm de diámetroFine Science Tools26002-10 
bomba de perfusiónWorld Precision InstrumentsPERIPRO-4LS Bomba de
superfusiónWorld Precision InstrumentsPERIPRO-4HS
Vannas Tijeras de tubinga Precision Instruments503379
Dumont501201 de World Precision Instruments500085
tijeras Mayo WorldPrecision Instruments501750
pinzas hemostáticas Kelly
de WorldInstruments World Precision Instruments15917
Iris tijeras,World Precision Instruments501263
ECG, aguja de 12 mm (calibre 29), electrodos (monopolares);AD InstrumentsMLA1203
puerto de inyección Luer en líneaIbidi10820
Ultima-L SciMediaMiCAM-05 
lámpara halógenaMoritex USA IncMHAB-150W
NaClFisher ScientificS271-1
CaCl2 (2H2O)Fisher ScientificC79-500
KClFisher ScientificS217-500
MgCl2 (6H2O)Fisher ScientificM33-500
NaH2PO4 (H2O)Fisher ScientificS369-500
NaHCO3Fisher ScientificS233-3
D-GlucosaFisher ScientificD16-1
BlebbistatinTocris Bioscience1760
RH237ThermoFisher ScientificS1109
Sulfóxido de dimetilo (DMSO)Sigma-AldrichD2650
de aislamiento de órganos grandes o células individuales baño Transductor de presión NY1102500 Pinzas de World Pinzas de 501241 Precision Cámara CMOS

Referencias

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