Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

Resumen

Este trabajo describe un flujo de trabajo avanzado para la determinación precisa y rápida del recuento de células NK (Natural Killer) y la citotoxicidad de las células NK en muestras de sangre humana.

Resumen

la citotoxicidad de células NK es una medida ampliamente utilizada para determinar el efecto de la intervención exterior en función de las células NK. Sin embargo, la precisión y reproducibilidad de este ensayo pueden considerarse inestable, ya sea debido a errores del usuario o debido a la sensibilidad de las células NK a la manipulación experimental. Para eliminar estos problemas, un flujo de trabajo que les reduce al mínimo fue establecido y se presenta aquí. Para ilustrar, se obtuvieron muestras de sangre, en diversos momentos, desde corredores (n = 4) que fueron sometidos a una intensa sesión de ejercicio. En primer lugar, las células NK se identifican de forma simultánea y aislados mediante el etiquetado CD56 y la clasificación basada en magnético, directamente de la sangre entera y de tan poco como un mililitro. Las células NK según se retiran de cualquier anticuerpo reactivo o de tapado. Se puede contar con el fin de establecer un recuento de células NK precisa por mililitro de sangre. En segundo lugar, las células NK según (efectores células o E) se pueden mezclar con 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO) etiquetada células K562 (células diana o T) en un ensayo-óptima 1: 5 T: relación de E, y se analizó usando un citómetro de flujo de imágenes que permite la visualización de cada evento y la eliminación de cualquier falso positivo o falsos negativos (tales como dobletes o células efectoras). Este flujo de trabajo se puede completar en aproximadamente 4 h, y permite obtener resultados muy estables incluso cuando se trabaja con muestras humanas. Cuando esté disponible, los equipos de investigación pueden probar varias intervenciones experimentales en sujetos humanos, y comparar las mediciones a través de varios puntos de tiempo sin poner en peligro la integridad de los datos.

Introducción

Las células asesinas naturales son un elemento esencial del sistema inmune innato. Mientras que están muy regulados, que tienen la capacidad de reconocer y eliminar las células anormales a través del contacto de célula a célula y sin activación previa ^1. Como tales, forman una línea rápida de defensa contra las infecciones. El ejercicio, especialmente intenso, se ha demostrado que deprimen de forma transitoria el sistema inmune ^{2, 3, 4, 5.} Las células NK son particularmente propensos a este efecto ^<....

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos de recolección de sangre se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices establecidas por la Universidad Estatal de los Apalaches (ASU) Junta de Revisión Institucional (IRB).

1. Extracción de sangre entera

1. Tiene un flebotomista certificado extraer la sangre según las directrices de la Organización Mundial de la Salud.
2. Extraer la sangre en un tubo de recogida de sangre de 4 ml que contenía ácido etilendiaminotetraacético Di-Potasio (K ₂ EDTA). Invertir tubo de recogida de sangre de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mantenga el tubo de recogida de sangre a temperat....

Resultados

Determinación del número de células NK
Se midió el efecto de la pesada que se ejecuta en el recuento de células NK en la sangre total, utilizando el protocolo de ejercicio descrito en la figura 2. Las muestras de sangre fueron extraídas antes del ejercicio, inmediatamente después del ejercicio, 1,5 horas después del ejercicio, y, finalmente, 24 y 48 h después de la extracción de sangre inicial. La concentración de las células NK por mililitro de sangre total se midi.......

Discusión

El método descrito en este estudio mide directamente la actividad específica de las células NK de un individuo en respuesta a estímulos (en este caso particular, el ejercicio prolongado). Típicamente, las células NK están aisladas de la propia sangre usando gradientes de densidad o clasificación de células mediante el uso de una combinación de marcadores. Aunque se utilizan ampliamente estos métodos, que tienen muchos inconvenientes: son mucho tiempo, implican múltiples manipulaciones, y son en gran medida dependientes .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Linfoblastos K-562	ATCC	CCL-243
Iscove's Modified Dulbecco's Media	ATCC	30-2005	Alto contenido de glucosa, con L-Glutamina, con HEPES, Alfa Mínimo Esencial Filtrado Estérilmente
Medio ATCC	CRL-2407	Sin ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos pero con 2 mM de L-glutamina y 1,5 g/L de bicarbonato de sodio
Solución Azul de Tripano 0,4%	Amresco	K940-100ML	Grado de cultivo de tejidos
Solución de tinción de yoduro de propiedad	BD Pharmingen	51-66211E
Solución de etiquetado celular Vybranto DiO Vybranto		V-22886
Separador autoMACS Pro	Miltenyi Biotec	130-092-545
tampón de ejecución autoMACS	Miltenyi Biotec	130-091-221
tampón de lavado autoMACS	Miltenyi Biotec	130-092-987
autoMACS Columnas	Miltenyi Biotec	130-021-101
Sangre entera CD56 MicroBeads, humano	Miltenyi Biotec	130-090-875
ImageStream X Mark II Citómetro de flujo de imágenes	EMD Millipore
Speedbeads	Amnis Corporation	400030
0,4-0,7% de hipoclorito (esterilizador)	VWR	JT9416-1
Coulter Clenz	Beckman Coulter	8546929
70% de isopropanol (desburbujeador)	EMD Millipore	1.3704
D-PBS (líquido de vaina)	EMD Millipore	BSS-1006-B (1X)	Sin calcio ni magnesio
Software INSPIRE	EMD Millipore		Versión Mark II, septiembre de 2013
Ideas Software de Aplicación	EMD Millipore		Versión 6.1, Julio 2014