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Síntesis de cationizada Magnetoferritin para la magnetización ultra-rápido de las células

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DOI:

10.3791/54785

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13 de diciembre de 2016

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1Bristol Centre for Functional Nanomaterials, University of Bristol, 2Department of Materials, Imperial College London, 3Self Assembly Group, CIC nanoGUNE, 4Ikebasque, Basque Foundation for Science, 5School of Cellular and Molecular Medicine, University of Bristol, 6H.H. Wills Physics Laboratory, University of Bristol

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo para la síntesis y cationización de magnetoferritina dopada con cobalto, así como un método para magnetizar rápidamente células madre con magnetoferritina catiónica.

Resumen

Muchas aplicaciones biomédicas importantes, tales como imágenes de células y la manipulación a distancia, se pueden lograr mediante el etiquetado de las células con nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas (SPIONs). El logro suficiente captación celular de SPIONs es un reto que tradicionalmente se ha cumplido mediante la exposición de las células a concentraciones elevadas de SPIONs o mediante la prolongación de los tiempos de exposición (hasta 72 horas). Sin embargo, estas estrategias son propensos a mediar en la toxicidad. A continuación, presentamos la síntesis de la magnetoferritin SPION a base de proteínas, así como un protocolo de funcionalización de la superficie fácil de que permite una rápida magnetización celular utilizando concentraciones bajas de exposición. El núcleo de SPION magnetoferritin consiste en óxido de hierro cobalto-dopado con un diámetro medio de partículas de 8,2 nm mineralizada en el interior de la cavidad del bazo de caballo apo-ferritina. cationización química de magnetoferritin produjo una novela, SPION altamente membrana activa que magnetiza células madre mesenquimatosas humanas (hMSC) utilizando tiempos de incubación comoLas concentraciones más corto de un minuto y hierro como bajos como 0,2 mM.

Introducción

unión a la superficie o internalización de nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas (SPIONs) ha permitido la magnetización de una variedad de tipos de células para aplicaciones tales como formación de imágenes y la manipulación a distancia. 1 Sin embargo, lograr suficiente magnetización celular puede ser un reto, especialmente cuando la interacción entre el SPION y la superficie celular es débil. 2 En las concentraciones anteriores, la exposición prolongada o alta SPION se han empleado como estrategias para superar este desafío. 3,4 Sin embargo, estas estrategias son problemáticos, ya que aumentan la toxicidad 5,6 y tienen un éxito muy limitado en tipos de células con bajas tasas de internalización, tales como linfocitos. 7 Para mejorar la captación celular de SPIONs, los enfoques de funcionalización varios de superficie se han explorado. Por ejemplo, los anticuerpos se han utilizado para promover la endocitosis mediada por receptor, 8 mientras que la captación no específica se puede lograr utilizando una transfeccióncaballeros 9,10 o especies penetran en las células, tales como tat-péptido del VIH. 11,12 Sin embargo, los enfoques de anticuerpos y de funcionalización péptido están limitados por reactivos caros y preparación sintética complejo, mientras que los agentes de transfección pueden inducir la precipitación de nanopartículas y afectar negativamente a la función celular. 13,14

Recientemente hemos informado de la síntesis de magnetoferritin cationizada químicamente, una novela SPION que era muy eficaz en las células madre mesenquimatosas humanas de magnetización (hMSC) utilizando tiempos de incubación tan corto como un minuto. 15 Magnetoferritin se sintetiza mediante la reconstitución de un SPION dentro de la cavidad desmineralizada de la ferritina proteína de almacenamiento de hierro. 16 Este SPION a base de proteínas combina muchas propiedades que lo hacen muy adecuado para la magnetización de células, tales como el control sobre las propiedades magnéticas del núcleo magnético, 17-19 y biocompatibilidad y la solubilidad acuosa conferidos por la cubierta de proteína. Promovermás, funcionalización de la superficie se consigue fácilmente debido a los aminoácidos direccionables que pueden ser químicamente o genéticamente modificadas 20-22. 23-25 Hemos demostrado que cationización química de los residuos de aminoácidos ácidos de la cubierta de proteína genera una nanopartícula estable que fácilmente interactuó con dominios aniónicos en la superficie celular que conduce a una rápida y persistente magnetización celular. Este procedimiento elimina la necesidad de funcionalización laborioso y protocolos de incubación largos, y debido al mecanismo de etiquetado no específica esta estrategia magnetización rápida debe encontrar aplicación muy extendida en otros tipos de células. A continuación, presentamos un informe en profundidad del procedimiento de marcaje celular ultra-rápida, incluyendo los protocolos detallados de la síntesis, la purificación y la superficie funcionalización de magnetoferritin cationizada.

Protocolo

las células madre mesenquimales humanas (hMSC) se recogieron de la parte proximal del fémur de médula ósea de los pacientes artrósicos sometidos a cirugía de reemplazo total de cadera, en total acuerdo con las directrices del Comité de Ética de Investigación del Hospital Southmead de Bristol (referencia # 078/01) y después se obtuvo el consentimiento del paciente.

1. Síntesis y purificación Magnetoferritin

  1. Observaciones generales
    1. Realizar la síntesis magnetoferritin en un recipiente de reacción de doble camisa se puede sellar a 65 ° C en atmósfera de nitrógeno para restringir la oxidación de los precursores metálicos. Inyectar las soluciones de sal de metal y el peróxido de hidrógeno a través de los puertos de acceso de la tapa en el recipiente de reacción utilizando una bomba de jeringa.
    2. Después de la síntesis magnetoferritin, purificar la proteína por cromatografía de intercambio de aniones (ver sección 1.4) para eliminar las nanopartículas no encerrado en la cavidad de proteínas, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (ver sección 1.5) para aislar monómeros de proteínas. DelawareTermine la concentración de proteína usando un ensayo de Bradford (ver sección 1.6).
  2. Los preparativos antes de la síntesis
    1. Deoxygenate 500 ml de agua desionizada mediante la colocación de un tubo conectado a un cilindro de gas nitrógeno en el agua, sellando el recipiente con film transparente y burbujeante a través de gas de nitrógeno durante aproximadamente 60 min.
    2. Calentar un baño de agua conectado al recipiente de reacción de doble camisa a 65 ° C. Añadir 75 ml de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) 50 mM de tampón (pH 8,6) en el recipiente de reacción, sellar el recipiente, y deoxygenate por burbujeo de gas nitrógeno a través de la solución tampón durante aproximadamente 20 min. Al mismo tiempo, se agita la solución tampón utilizando un agitador magnético.
    3. Después de desoxigenación de la solución tampón HEPES, retirar el tubo de suministro de gas nitrógeno de la memoria intermedia y mantenerla en suspensión en el recipiente para mantener una atmósfera de nitrógeno. Añadir apo-ferritina para lograr una concentración final de 3 mg / ml. Continuar la agitación magnética, pero reduce la velocidad de agitación si se produce la formación de espuma.
    4. Preparar una solución madre 25 mM de heptahidrato de sulfato de cobalto por disolución de 0,19 g en 50 ml de agua desionizada desoxigenada.
    5. Preparar una solución de 25 mM de solución de sulfato hexahidrato de amonio y hierro mediante la disolución de 0,98 g en 100 ml de agua desionizada desoxigenada.
    6. Retirar 2,5 ml de la solución de sulfato hexahidrato de amonio y hierro y reemplazar con 2,5 ml de la heptahidrato de sulfato de cobalto.
    7. Preparar una solución 8,33 mM de peróxido de hidrógeno en agua desionizada desoxigenada añadiendo primero 965 l de una solución de peróxido de hidrógeno (30% w / w) a 9 ml de agua desionizada desoxigenada, y luego la adición de 1 ml de esta sub-Stock 99 ml de agua desionizada desoxigenada.
  3. síntesis Magnetoferritin
    1. Inyectar 10.1 ml de tanto el precursor de hierro-cobalto y el peróxido de hidrógeno al mismo tiempo en la solución de apo-ferritina (s magnéticamentetirred) a un caudal de 0,15 ml / min utilizando dos bomba de jeringa (volumen total inyectado: 20.2 ml).
    2. Durante el período de inyección, desoxigenar otros 500 ml de agua desionizada.
      NOTA: El contenido del recipiente de reacción adoptan gradualmente un color marrón oscuro a medida que avanza la reacción.
    3. Poco antes de la finalización de la primera inyección, preparar otros 100 ml de precursor de hierro-cobalto y solución de peróxido de hidrógeno usando el agua desionizada recién desoxigenada.
    4. Repetir la etapa de inyección descrito en 1.3.1 utilizando soluciones recién preparadas de hierro-cobalto y peróxido de hidrógeno.
    5. Durante el período de inyección, desoxigenar otros 500 ml de agua desionizada, y proceder como se describe en 1.3.3 y 1.3.4.
    6. Después de la tercera inyección, deje la solución a madurar durante 15 minutos con agitación.
    7. Añadir 1,5 ml de una solución de citrato de sodio 1 M al recipiente de reacción para quelar iones metálicos libres en solución.
    8. Retirar la solución de la reacciónbuque en 50 ml tubos de centrífuga, centrifugar durante 30 min a 4.350 xg y pasar el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras. En esta etapa, el sobrenadante filtrado se puede almacenar a 4 ° C hasta la purificación.
  4. Cromatografía de intercambio de iones
    1. Cargar la muestra en una columna (2,5 cm de diámetro, 20 cm de largo) que contiene una matriz catiónico usando una bomba peristáltica a un caudal de 10 ml / min.
    2. Lavar la columna con aproximadamente 100 ml de tampón (tampón Tris 50 mM (hidroximetil) aminometano (Tris), pH 8,0) que se ejecuta usando una bomba de gradiente a un caudal de 10 ml / min.
    3. Para eluir la proteína, se lava la columna a 10 ml / min con concentraciones crecientes de cloruro de sodio (NaCl) en tampón Tris: 150, 500 y 1.000 mM concentración final de NaCl, 150 ml de cada concentración.
    4. Como la proteína se eluye a una concentración de NaCl de 500 mM, recogerla en fracciones de 50 ml utilizando un colector de fracciones automatizado.
      NOTA: Para unaprotocolo detallado de cromatografía de intercambio iónico consultar los protocolos publicados anteriormente. 26
  5. Cromatografía de exclusión por tamaños
    1. Se concentran los 150 ml de magnetoferritin a un volumen de aproximadamente 2 ml usando una unidad de filtro 15 ml centrífuga seguido de una unidad de volumen de 4 ml. Consulte las instrucciones del fabricante de las unidades de filtro centrífugo (véase la lista de materiales) para un protocolo detallado de este procedimiento.
    2. Cargar la muestra concentrada en una columna de filtración en gel utilizando un bucle de inyección.
    3. Lavar la columna con tampón de desarrollo (tampón Tris 50 mM, pH 8,0, que contiene NaCl 150 mM) a una velocidad de flujo de 1,3 ml / min.
    4. Recoger fracciones de 6 ml utilizando un colector de fracciones automático. monómeros de proteínas eluyen pasado. En este punto, magnetoferritin purificado se puede almacenar a 4 ° C hasta que cationización.
      NOTA: Para un protocolo detallado de la cromatografía de exclusión por tamaños usando una columna de filtración en gel consultar Previously publicado protocolos. 27
  6. La determinación de la concentración de proteínas
    1. Preparar normas de ferritina de 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 y 1 mg / ml en tampón Tris 50 mM utilizando comercialmente disponible de ferritina de bazo de caballo.
      NOTA: La concentración de proteína de la ferritina está disponible en el mercado aparece en el frasco. Si no es así, póngase en contacto con el proveedor para obtener esta información.
    2. Diluir las muestras de concentración desconocida magnetoferritin en tampón Tris 50 mM hasta que el color de la solución coincide aproximadamente el color de la norma 0,5 mg / ml. Anote el factor de dilución.
    3. Añadir 10 l de cada muestra estándar y magnetoferritin por triplicado en pocillos de una placa de 96 pocillos.
    4. Añadir 200 l de reactivo de Bradford ya preparada a cada pocillo (refiérase a la lista de materiales para Bradford detalles de reactivos de ensayo).
    5. Se incuba a temperatura ambiente durante 8 minutos.
    6. Medir la absorbancia a λ = 595 nm utilizandoun lector de microplacas.
    7. Trazar la absorbancia media de las normas de ferritina como una función de la concentración de proteínas y el uso de la pendiente y la intersección del ajuste lineal para calcular la concentración de la muestra magnetoferritin.
      NOTA: Tener en cuenta el factor de dilución que se utiliza para ajustar la muestra magnetoferritin con la curva estándar.

2. La cationización Magnetoferritin

  1. Observaciones generales
    NOTA: Para cationización magnetoferritin, N, N -dimetil-1,3-propanodiamina (DMPA) se acopló a residuos de ácido aspártico y glutámico en la superficie MF usando N - (3-dimetilaminopropil) - etilcarbodiimida clorhidrato de N '(EDC).
    1. Llevar a cabo la reacción a temperatura ambiente bajo agitación. El protocolo dado a continuación es para la cationización de 10 mg de magnetoferritin en un volumen total de 5 ml (concentración de proteína de 2 mg / ml). Sin embargo, aumentar o disminuirmanteniendo la proteína: DMPA: relaciones de EDC consistente, así como los volúmenes de la solución tampón y magnetoferritin.
    2. Antes de la reacción de cationización, dializar las muestras magnetoferritin en tampón de fosfato 50 mM (pH 7) que contiene NaCl 50 mM. Esto es importante para eliminar el tampón de elución Tris y evitar reacciones no deseadas entre la amina Tris y los residuos de ácido carboxílico activados-EDC. Determinar la concentración de proteína después de la diálisis y ajustarlo a 4 mg / ml antes de la cationización.
  2. protocolo de cationización
    1. Pesar 374 mg de DMPA y disolver en 2,5 ml de ácido etanosulfónico tampón 200 mM ácido 2- (N morfolino) (MES).
    2. Ajustar el pH de la solución a aproximadamente 7 usando (6 M) de ácido clorhídrico concentrado (HCl).
      PRECAUCIÓN: Realice este paso en una campana de extracción, como la adición del ácido al DMPA libera gases tóxicos!
    3. Añadir 2,5 ml de solución magnetoferritin a 4 mg / ml (final de concentración de MES es 100 mM, concentración final de magnetoferritin es 2 mg / ml, la cantidad total de proteínas es 10 mg).
    4. Añadir un agitador magnético y se agita durante 2 horas se equilibre.
    5. ajustar cuidadosamente la solución a pH 5,0 usando HCl 1 M.
    6. Añadir 141 mg de polvo de EDC a la solución de DMPA / magnetoferritin.
    7. Se continúa agitando durante 3,5 horas.
    8. Se filtra la solución a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras para eliminar cualquier precipitado.
    9. Añadir la solución a un tubo de diálisis con un peso molecular de 12-14 kDa de corte y dializar contra 4 L de tampón de 50 mM de fosfato (pH 7) que contenía NaCl 50 mM durante 2 días a 4 ° C, en sustitución del tampón de diálisis por lo menos tres veces durante ese período.
      NOTA: En este punto, magnetoferritin cationizado se puede almacenar a 4 ° C hasta su uso posterior.

3. mesenquimales humanas Etiquetado de células madre con cationizada Magnetoferritin

  1. Observaciones generales
    1. realizar todas cultivo celular usando la clase II cabinas de flujo laminar e incubadores humidificados a 37 ° C y 5% atmósfera de dióxido de carbono.
    2. Células de cultivo como monocapas usando 175 cm 2 frascos y 20 ml de medio de cultivo, que se reponía cada 3 - 4 días. El medio de cultivo consistió de Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM), que contiene 1,000 mg / l de glucosa, 10% (v / v) de suero bovino fetal, 1% (v / v) de solución de penicilina / estreptomicina, 1% (v / v) L alanil-L-glutamina solución y el factor de crecimiento de fibroblastos humano 5 ng / ml recién suplementado.
  2. Etiquetado magnético de hMSC con magnetoferritin cationizada
    1. Semilla 150.000 hMSCs en 25 cm 2 frascos y dejar adherir durante la noche a 37 ° C.
    2. Filtrar esterilizar magnetoferritin cationizada a través de un filtro de 0,22 micras jeringa y determinar la concentración de proteína.
    3. Mantener condiciones estériles, preparar una solución de 0,5 M magnetoferri cationizadaestaño en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Mantenga tapado en una campana de cultivo estéril hasta su uso.
    4. Se lavan las células cultivadas en placas con 2 ml de PBS temperatura ambiente.
    5. Añadir 1 ml de la solución magnetoferritin cationizada esterilizada para las células cultivadas en placas y se incuba durante el período de tiempo deseado (1 min a 1 h).
    6. Lavar las células con PBS, y las células después de la cosecha mediante la adición de 0,5 ml de ácido tripsina / etilendiaminotetraacético (EDTA) e incubando a 37 ° C durante 5 min.
    7. Añadir 1 ml de medio de cultivo para inactivar la tripsina / EDTA, transferir la solución a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar durante 5 min a 524 x g.
    8. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento celular en 0,5 ml de tampón de separación magnética, que consta de 0,5% (w / v) de suero bovino fetal y EDTA 2 mM en PBS.
  3. Separación celular magnética
    1. Ponga el imán en el soporte de múltiples, y añadir una columna de separación magnética al imán. Colocar un filtro de pre-separación en el thcolumna de dirección.
    2. Colocar 0,5 ml de tampón de separación magnética en el filtro de separación y se deja correr tanto a través del filtro y la columna de lavar y humedecerlos.
    3. Colocar un tubo de centrífuga de 15 ml en la columna.
    4. Añadir 0,5 ml de la suspensión celular en el depósito del filtro de la columna de separación magnética.
    5. Cuando el depósito está vacío, añadir 0,5 ml de tampón de separación magnética.
    6. Cuando el depósito está vacío, añadir otros 0,5 ml de tampón de separación magnética.
    7. Repetir una vez más (el volumen total de tampón de separación magnética utilizada para el lavado debe ser de 1,5 ml). Esta etapa de lavado se eluye todas las células no magnetizadas de la (fracción de células no magnetizada) columna.
    8. Retirar la columna del imán y colocarlo en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml. Retirar filtro desde el depósito de la columna.
    9. Añadir 1 ml de tampón de separación magnética para el depósito e inmediatamente empujar a través de la columna usando el émbolo suministrado por la fabricaciónr. Este eluye las células magnetizadas de la columna en el tubo de centrífuga (fracción de células magnetizado).
    10. Centrifugar los dos tubos de 5 min a 524 x g.
    11. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender los sedimentos celulares en 0,3 ml de PBS.
    12. Contar el número de números de células en cada fracción usando un hemocitómetro.
    13. Determinar la fracción de células magnetizadas, M (%), usando la siguiente ecuación:
      figure-protocol-1
      donde n (M) es el número de células en la fracción imantada y n (M + NM) es la suma del número de células en las fracciones magnetizadas y no magnetizadas.
  4. Preparación hMSC marcadas con magnetoferritin cationizada para la cuantificación de hierro utilizando espectroscopia de emisión óptica con plasma acoplado inductivamente (ICP-OES)
    NOTA: puede ser necesario adaptar para otros instrumentos ICP-OES El protocolo. Es aconsejable consultar con la retécnico responsable.
    1. Centrifugar un número conocido de células durante 5 minutos a 524 x g.
    2. Eliminar el sobrenadante de PBS y añadir 0,25 ml de 50% (v / v) de ácido nítrico.
    3. Vortex mezclar la suspensión de células acidificada.
    4. Incubar a temperatura ambiente durante la noche.
    5. Añadir 4,75 ml de agua destilada a cada muestra y agitar la mezcla.
    6. Analizar con ICP-OES. 28
    7. Normalizar el contenido de hierro medido en el número de células para determinar un valor para el contenido de hierro celular.

Resultados

TEM se utilizó para confirmar la mineralización de nanopartículas dentro de la cavidad apoferritina y determinar el tamaño del núcleo promedio (Figuras 1A y 1B). El análisis de imágenes de las muestras no teñidas magnetoferritin dio un diámetro de núcleo promedio de 8,2 ± 0,7 nm, y de la mancha aurothioglucose confirmó la presencia de las nanopartículas dentro de la jaula de proteínas. Tenga en cuenta que las imágenes muestran una muestra magnetoferritin que se purificó adicionalmente usando separación magnética para aislar núcleos de nanopartículas uniformes. muestras Magnetoferritin que no se purificaron magnéticamente tienen una distribución de tamaño de núcleo ligeramente más amplia. 29 Análisis de la estructura del núcleo magnetoferritin usando difracción de electrones área seleccionada se indica la posible presencia de la estructura espinela inversa basado en la magnetita (Fe 3 O 4) y / o maghemita (γ-Fe 2 O 3), así como la estructura de espinela debido a la Co 3 O 4. Además, los espectros de Raman reveló picos atribuidos a Fe 3 O 4, pequeñas cantidades de γ-Fe 2 O 3, y una ferrita de cobalto (Figura 1 C). análisis ICP-OES de magnetoferritin mostró un promedio de 102 g de hierro y 0,9 g de cobalto por miligramo de magnetoferritin.

Un esquema está incluido, que ilustra la etapa de cationización posterior (Figura 2 A). El diámetro hidrodinámico de magnetoferritin y magnetoferritin cationizada era 11,8 ± 1,1 nm y 12,5 ± 1,4 nm, respectivamente, como se determina por dispersión de luz dinámica. La eficiencia de cationización covalente DMPA-acoplamiento a magnetoferritin se evaluó mediante potenciometría zeta y el láser de desorción ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas asistida por matriz. El potencial zeta cambió de -10.5 mV para MF a + 8,3 mV para magnetoferritin cationizada, lo que confirma unacambio en el potencial de superficie de negativo a positivo (Tabla 1). Experimentos de espectrometría de masas encontraron un peso molecular de 20,1 kDa subunidad nativa para apo-ferritina y 21,1 kDa para cationizada apo-ferritina (Figura 2 B). Este aumento de la masa corresponde a aproximadamente 12 moléculas de DMPA acopladas por subunidad de la proteína, y la cationización de 288 residuos de la proteína completa 24 de la subunidad.

la saturación magnética y la susceptibilidad se midieron utilizando magnetometría SQUID, y transversal y longitudinal de relajación se midieron usando imágenes de resonancia magnética. Las propiedades magnéticas fueron similares para magnetoferritin y magnetoferritin cationizada, lo que indica que cationización tuvo un impacto insignificante sobre las propiedades magnéticas de la SPION cerrado (Tabla 1). Además, estas propiedades son similares a otras nanopartículas a base de óxido de hierro, lo que demuestra que 19,30 cationizada magnetoferritin sería tan adecuados como agentes de contraste para MRI basados ​​en SPION convencionales en la mejora de contraste de formación de imágenes.

Después de una exposición de 30 minutos, la superficie de la célula estaba densamente cubierta con magnetoferritin cationizada (Figura 3 A). Sin embargo, después de una semana, no hay nanopartículas se encuentran en la superficie celular (Figura 3 B). magnetoferritin cationizada era extraordinariamente eficaz en hMSCs magnéticamente etiquetado. En particular, la exposición de las células a magnetoferritin cationizada durante un minuto resultó en la magnetización de 92% de la población de células y la entrega de 3,6 pg de hierro por célula. El aumento del tiempo de incubación a 15 minutos dado lugar a la magnetización de toda la población celular (Figura 3 C).

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Figura 1: Caracterización de magnetof núcleos erritin dopado con 5% de cobalto. Imágenes TEM de magnetoferritin teñidas con aurothioglucose (A) y sin teñir (B). El recuadro muestra la difracción de electrones correspondiente con índices de magnetita. Barra de escala: 20 nm. (C) Raman espectro para magnetoferritin. Las flechas indican los principales modos de vibración Raman para la ferrita de cobalto (T 2 g), magnetita y magemita (tanto A 1 g). 31,32 La longitud de onda del láser utilizado fue 532 nm. (Imagen adaptada de Okuda et al. 18). Tenga en cuenta que esta muestra magnetoferritin había sido purificado adicionalmente utilizando la separación magnética, que aisló partículas magnetoferritin uniformemente cargados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

785fig2.jpg "/>
Figura 2: La cationización de magnetoferritin. A) representaciones disolvente accesible superficie que muestran la distribución de ácido (rojo) y los residuos de aminoácidos básicos (amarillo) en la superficie de la proteína. Magnetoferritin (1) se modifica para cationizada magnetoferritin (2) por reticulación de carbodiimida mediada de DMPA a los residuos de aminoácidos ácidos en la superficie de la proteína (3). B) Análisis de espectrometría de masas de las subunidades de ferritina apo-apo-ferritina y cationizada. Masa-carga (m / z) espectro de apoferritina (ApoF) y apoferritina cationizada (cat-ApoF) generada por MALDI-TOF. Un aumento de la masa de 20,1 kDa a 21,1 kDa se observa después de cationización. (Imagen adaptada de Carreira Correia et al. 15) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: etiquetado magnética y separación de células de hMSC incubadas con magnetoferritin cationizada. A) Imagen TEM de hMSCs después de una incubación de 30 minutos con magnetoferritin cationizada. La flecha indica la presencia de núcleos magnetoferritin densamente empaquetadas en la superficie celular. Barras de escala: 200 nm. B) Imagen TEM de hMSC una semana después de etiquetado. La superficie de la célula esté libre de magnetoferritin cationizada. C) La investigación de la rapidez de etiquetado magnético: 92% de la población celular se magnetiza después de una exposición de un minuto con 0,5 M magnetoferritin cationizados, y toda la población de células se magnetiza el plazo de 15 minutos. El contenido de hierro por célula se determinó utilizando ICP-OES. se muestran promedio y desviación estándar de tres réplicas biológicas. (Imagen adaptada de Carreira Correia et al. 15) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

MF cat-MF
Diámetro hidrodinámico [nm] 11,8 ± 1,1 12,5 ± 1,4
Zeta potencial [mV] (-) 10,4 ± 0,2 8,3 ± 0,7
Momento magnético de saturación [Am 2 kg -1] 54,9 ± 1,6 55,3 ± 1,4
La susceptibilidad de masas [10 x 4 m 3 kg -1] 1,75 ± 0,08 1,75 ± 0,07
Capacidad de relajación longitudinal [seg mM -1 -1] 2,6 ± 0,1 2,3 ± 0,1
Capacidad de relajación transversal [seg mM -1 -1] 44,6 ± 1,0 52,8 ± 0,8

Tabla 1: Caracterización físico-química de magnetoferritin (MF) y magnetoferritin cationizada (cat-MF). (Tabla adaptada de Correia Carreira et al. 15)

Discusión

TEM de las muestras teñidas con magnetoferritin aurothioglucose reveló la mineralización éxito de las nanopartículas dentro de la jaula de proteínas. difracción de electrones y el análisis Raman del núcleo de nanopartículas indicaron la presencia de una ferrita de cobalto, lo que indica el dopaje satisfactoria del núcleo de nanopartícula con cobalto. Esto demuestra que las nanopartículas de óxidos mixtos pueden ser mineralizada con éxito dentro de la cavidad apo-ferritina. Además, hemos demostrado previamente que el dopaje de cobalto se puede variar mediante la alteración de la cantidad de precursor de cobalto añadido a la mezcla de reacción, que permite un ajuste de las propiedades magnéticas. 18

Síntesis Magnetoferritin se puede realizar en una variedad de vasos, el tiempo que están estrechamente sellable y tienen puertos de acceso a través del cual se pueden introducir los reactivos (por ejemplo, una de tres bocas matraz de fondo redondo). La temperatura de reacción debe mantenerse a 65 ° C, ya sea colocando el recipiente ena / baño de aceite o de agua utilizando un recipiente de doble camisa. En este caso, se utilizó una configuración de doble camisa celda electroquímica para llevar a cabo la síntesis. Para garantizar síntesis exitosa, manteniendo el pH correcto y evitando la contaminación de oxígeno de las soluciones acuosas es crucial. soluciones de sales metálicas siempre deben prepararse recientemente antes de su uso en lugar de por adelantado. Además, las soluciones apoferritina comerciales pueden variar en calidad y afectar resultado la síntesis (por ejemplo., Tamaño de nanopartícula mineralizada núcleo). Puede ayudar a dializar la solución apoferritina en tampón HEPES 50 mM (pH 8,6) antes de la síntesis para eliminar cualquier agente reductor residual utilizado por el fabricante. Es útil hacer una nota del número de lote de la solución de apo-ferritina utilizado para la síntesis, por lo que puede ser solicitada específicamente por el fabricante debe necesidad adicional de material que se ha comprado. Por otra parte, la concentración de proteína disponible en el mercado apo-ferritina debe ser indicada en la botella, que puedeser utilizado para calcular el volumen de la solución de apo-ferritina necesario para la síntesis. Si este no es el caso, póngase en contacto con el proveedor para obtener esta información.

La ventaja de la adición gradual de sales metálicas y de peróxido de hidrógeno - tal como se presenta aquí y en informes anteriores - es que la mineralización del núcleo de nanopartículas puede ser controlado de tal manera que diferentes factores de carga (es decir, tamaños de nanopartículas) se puede lograr. 33 Además, es posible purificar magnetoferritin adicionalmente usando una columna de separación magnética, por ejemplo, una columna rellena con polvo de acero inoxidable asegurada dentro de un electroimán. 34 Por lo tanto, los núcleos de nanopartículas altamente monodispersas se puede aislar de la muestra magnetoferritin granel. Sin embargo, para el marcaje celular magnética como se presenta aquí esto no es necesario. Una limitación de la síntesis de magnetoferritin es el rendimiento de síntesis relativamente baja de aproximadamente 10%, y el costo relativamente alto de comercial apo-ferritin soluciones. Sin embargo, apo-ferritina también puede prepararse a partir de bazo de caballo barato disponible ferritina siguiendo protocolos de-mineralización establecidos. dieciséis

La cationización de magnetoferritin se logró mediante la adición de una relación molar de 250 moléculas de DMPA y 50 moléculas de EDC por residuo cargado negativamente (cálculos basados ​​en la secuencia de aminoácidos de caballo ferritina de bazo). Este exceso de reactivo sobre la proteína resultó en altas eficiencias de cationización, comparable también para reportaron previamente resultado para la cationización de ferritina. 35 Para el análisis MALDI-TOF, apoferritina y apoferritina cationizada se utilizaron debido a la excesiva masa molecular del núcleo magnetoferritin. Para obtener altas eficiencias de cationización, pH óptimo es también crucial. entrecruzamiento mediado por EDC es más eficaz en condiciones ligeramente ácidas, y se encontró que el pH 5 dio resultados óptimos cationización para magnetoferritin. Sin embargo, para otras proteínas cpuede necesitar ser optimizado ationization pH. La cationización en o cerca del punto isoeléctrico de la proteína debe ser evitado, porque esto puede dar lugar a la precipitación severa.

magnetización de células madre con magnetoferritin cationizada era muy eficiente y podría lograrse usando tiempos de incubación muy por debajo de 30 minutos. Incluso una incubación de una minutos dio como resultado un contenido de hierro celular de 3,6 pg, que está dentro del rango informado necesario para influir en T2 y T2 * de contraste para MRI. 36,37 También es notable que este etiquetado eficiente se logra con concentraciones bajas de hierro extracelulares. Por ejemplo, estudios previos utilizando nanopartículas aniónicos reportan los niveles de hierro de 10 pg por célula después de un período de incubación de 30 minutos con hierro 5 mM. 38 En comparación, la incubación con una solución magnetoferritin cationizada que contiene 0,5 M de proteína corresponde a la incubación con hierro de aproximadamente 0,2 mM y también produce aproximadamente 10 pg de hierro por cell después de 30 minutos. No fuimos capaces de identificar claramente las vesículas endocytotic utilizando TEM. Sin embargo, estudios previos utilizando ferritina cationizada encontraron que la internalización se produjo dentro de los primeros diez minutos de exposición. 39,40 ferritina cationizada podría estar localizada en las vesículas recubiertas, lo que indica la endocitosis clathrin- o caveolina-dependiente. Los mismos estudios también informaron que después de 30 minutos de incubación, la ferritina cationizada todavía estaba presente en la superficie celular, así como en los cuerpos multivesiculares, asemejándose a los lisosomas.

Otras aplicaciones podrían incluir cationización de las jaulas de apo-ferritina cargados con otras nanopartículas y / o moléculas funcionales, tales como fármacos contra el cáncer 41 o 42 puntos cuánticos. La cationización de estas construcciones de ferritina podría dar lugar a una entrega más rápida y más eficiente de su carga a las células.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado a través del Centro de Bristol para Nanomateriales Funcionales, patrocinado por el Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas (código de subvención EPSRC EP/G036780/1).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES)Fisher ScientificBPE310-1polvo; prepare una solución madre de 1 M a pH 8,6 y diluya a 50  mM antes de su uso. ¡Verifique el pH cuidadosamente antes de la síntesis!
apoferritina del bazo equinoSigma AldrichA3641utilizamos el lote # 081M7011V
sulfato de cobalto heptahidratado Sigma AldrichC6768prepara soluciones frescas a partir de la sal antes de la síntesis
sulfato de hierro y amonio hexahidratado Sigma AldrichF1543preparar soluciones frescas a partir de la sal antes de la síntesis
solución de peróxido de hidrógeno (30%)Sigma Aldrich216763preparar soluciones frescas a partir de la sal antes de la síntesis
citrato de sodioSigma AldrichS1804en polvo; se puede preparar una solución de 1 M y mantenerla a temperatura ambiente durante varios meses
Unidad de filtro Millex GP, 0,22  micrasMerck MilliporeSLGP033RSfiltro de jeringa
Trizma baseSigma AldrichT1503polvo; prepare una solución madre de 1 M a pH 8.0 y diluya a 50   mM antes
de usar cloruro de sodioSigma Aldrich31434poweder; añadir a los tampones según sea necesario
Unidades de filtro centrífugo CentriprepMembrana Merck Millipore4310Ultracel YM-50, volumen de 12 ml; utilizar para la concentración inicial hasta que la solución de magnetoferritina se haya concentrado de aproximadamente 150 ml a 20 ml; ml
Amicon Ultra-4 filtro centrífugo utisMerck MilliporeUFC801024Ultracel-10 membrana, 4  volumen en ml; Úselo para concentrar la solución de magnetoferritina de aproximadamente 20 ml a   2 ml
ANX Sepharose 4 Fast FlowGE Healthcare17-1287-04empacamos esta columna nosotros mismos
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR columna GE Healthcare17-1196-01esta columna fue comprada ya empaquetada
Ä Sistema purificador KTAGE Healthcare28406264
bomba de muestreo P-960GE Healthcare18-6727-00Carga de muestra con un caudal de 10 ml/min
colector de fracciones automatizado Frac-950GE Healthcare18-6083-00
Bradford reactivo de ensayoSigma AldrichB6916solución lista para usar
Ferritina, Tipo I: de bazo de caballoSigma AldrichF4503prepare patrones de ferritina a partir de esta solución para determinar la concentración de magnetoferritina
N,N-dimetil-1,3-propanadiamina (DMPA)Sigma Aldrich308110PRECAUCIÓN: al ajustar el pH de una solución de DMPA, realice este paso en una campana extractora
N-(3-dimetilaminopropil)-N'-clorhidrato de etilcarbodiimida ( EDC)Sigma AldrichE6383mantener en el congelador pero llevar a temperatura ambiente antes de abrir el frasco
2-(N-morpholino)ácido etanosulfónico (MES)AppliChemA0689,0500polvo; preparar una solución madre de 200 M a pH 5
tubo de diálisis membrana de celulosaSigma AldrichD9652remojar 10 min en agua desionizada antes de usar
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM), 1.000 mg/L glucosaSigma AldrichD5546caliente en 37 ° C baño de agua antes de usar
suero fetal bovinoSigma AldrichF7524añadir a la acción Frasco DMEM, 10% (v/v) concentración final
solución de penicilina/estreptomicinaSigma AldrichP0781añadir a la acción Frasco DMEM, 1% (v/v) concentración final
solución glutamaxGibco35050-087añadir a la acción Frasco DMEM, concentración final 1% (v/v)
factor de crecimiento de fibroblastos humanosPeproTech100-18Bañadir a DMEM fresco en el matraz de cultivo celular con cada cambio de medio; concentración final 5 ng/ml
salina tamponada con fosfatoSigma AldrichD8537solución estéril, para
solución de tripsina/EDTAcelular Sigma AldrichE5134mantener en el congelador y descongelar en 37  ° C baño de agua antes de usar
ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Sigma AldrichE5134polvo; haga una solución de 2 mM en PBS 
albúmina sérica bovinaSigma AldrichA7030añadir 0,5% (p/v) en 2  Solución mM EDTA en PBS; revuelva cuidadosamente con un agitador magnético, evite la formación de espuma; filtro esterilizar a través de una jeringa de 0,22 micras filtro
MACS multi stand Miltenyi Biotec130-042-303para la fijación del imán MACS
Columnas MACS MSMiltenyi Biotec130-042-201desechables; destinados a un solo uso, pero si no se requiere esterilidad, pueden reutilizarse: lavar con agua desionizada y etanol 100%, y colocar en un horno de secado; desechar si observa parches oxidados
Imán separador MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-102se puede comprar como kit de inicio, junto con columnas y soportes
Filtro de preseparación de columna MACSMiltenyi Biotec130-041-407Filtro de 30 mm
Solución de ácido nítrico, 64-66%Sigma Aldrich7006
Titrando 907, bomba de jeringaMetrohm2.907.0020
Equipo utilizado para caracterizar magnetoferritina y magnetoferritina catiónica
SpectraMax M5Dispositivosmoleculares utilizados para medir la absorbancia en el ensayo
Bradford JEM 1200 EXJEOLSe utiliza para la obtención de imágenes TEM de magnetoferritina
Espectrómetro Raman InViaRenishawSe utiliza para espectroscopia
Raman Láser Torus DPSSLáser QuantumUtilizado para espectroscopia Raman
Bruker UltrafleXtremeApplied BiosystemsSe utiliza para el análisis MALDI-TOF de apoferritina y apoferritina catiónica
ZetaSizer Nano-ZSMalvernSe utiliza para medir el diámetro hidrodinámico y el potencial zeta de la magnetoferritina y la magnetoferritina catiónica Sistema de medición de
propiedades magnéticasDiseñoSe utiliza para medir el momento de saturación magnética y la susceptibilidad magnética
Magnetom SkyraSiemensSe utiliza para determinar la relajación longitudinal y transversal 
Tecnai 12 BioTwin SpiritFEISe utiliza para la obtención de imágenes TEM de hMSC marcadas con magnetoferritina catiónica
710 ICP-OESAgilentSe utiliza para determinar el contenido de hierro en las células
solución de cultrue Instrumentos cuántico

Referencias

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