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Artículo de método

Preparación de mezcla de culturas gliales primarios de ratón adulto espinal tejido del cordón

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DOI:

10.3791/54801

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19 de noviembre de 2016

 , 
1Department of Biomedical Sciences, College of Osteopathic Medicine, University of New England

En este artículo

Resumen

El desarrollo del dolor neuropático implica cambios patológicos de las células gliales de la médula espinal. Se carece de un sistema de cultivo glial fiable derivada de tejido de la médula espinal adulta y diseñado para el estudio de estas células in vitro. Por lo tanto, se muestra aquí cómo establecer cultivos mixtos gliales primarios a partir de tejido de médula espinal de ratón adulto.

Resumen

Ha sido bien aceptado que la médula espinal respuestas gliales contribuyen significativamente al desarrollo del dolor neuropático. Información relativa a las actividades tremenda gliales en los niveles celular y molecular ha sido obtenida a través de los sistemas de cultivo celular in vitro. Los sistemas in vitro utilizados, incluyen principalmente la glía primaria derivada de tejido cortical cerebral neonatal y líneas celulares inmortalizadas. Sin embargo, estos sistemas no siempre son representativas de las características de las células gliales de la médula espinal in vivo. Con el fin de investigar más a fondo el papel de las células gliales de la médula espinal en el desarrollo de los nervios periféricos del dolor neuropático inducido por lesión usando un sistema de cultivo que mejor refleja la condición in vivo, nuestro laboratorio ha desarrollado un método para establecer la médula espinal primaria cultivos gliales mixtos a partir de ratones adultos. Brevemente, las médulas espinales se recogen de los ratones adultos y procesados ​​a través de la digestión con papaína seguido de la eliminación de la mielina con un densdad-gradiente medio. Suspensiones de células individuales se cultivan en medio de Eagle modificado de Dulbecco completo (cDMEM) suplementado con 2-mercaptoetanol (2-ME) en 35,9 o C. Estas condiciones de cultivo fueron optimizadas específicamente para el crecimiento de las células gliales mixtos. En estas condiciones, las células están listas para ser utilizado para la experimentación entre 12 - 14 d (células son por lo general en la fase de registro durante este tiempo) después del establecimiento del cultivo (D 0) y pueden ser mantenidos en condiciones de cultivo hasta D 21. Este sistema de cultivo se puede utilizar para investigar las respuestas de las células gliales de la médula espinal a la estimulación con diversas sustancias y agentes. Además del dolor neuropático, este sistema puede ser utilizado para estudiar las respuestas gliales en otras enfermedades que implican cambios patológicos de las células gliales de la médula espinal.

Introducción

El dolor crónico es un problema de salud grave que afecta a aproximadamente 100 millones de adultos en los Estados Unidos, con un coste anual estimado de hasta $ 635 billón 1. La creciente evidencia ha indicado una contribución significativa de las células gliales de la médula espinal en el desarrollo del dolor neuropático, uno de los tipos más devastadores de dolor crónico 2. Un sistema adecuado de cultivo in vitro podría ayudar significativamente en la investigación aún más las funciones de las células gliales en los niveles celular y molecular.

En la actualidad, los sistemas de cultivo in vitro gliales en utilizadas por los investigadores incluyen principalmente células gliales derivadas de tejidos corticales neonatales de ratón o rata cerebros y inmortalizados líneas de células gliales derivadas de ratón o rata neonatal células gliales primarios. células neonatales contienen un número significativo de células no diferenciadas que se pueden diferenciar aún más en las células gliales (astrocitos y microglia principalmente), proporcionando así unacélulas bundant para el uso experimental 3. Sin embargo, nuestro estudio anterior ha demostrado que las células gliales del cerebro neonatal respondieron significativamente diferente de las células gliales de la médula espinal para adultos a la estimulación de lipopolisacárido (LPS). Por ejemplo, la interleucina (IL) -4 muestran mejorada efectos inhibidores sobre el óxido nítrico inducida por LPS (NO) en la rata adulta glia médula espinal en comparación con células gliales del cerebro neonatal 4. Además, los perfiles de producción de quimioquinas tras la estimulación por un neuropéptido, la calcitonina péptido relacionado con el gen (CGRP), son indiscutiblemente diferente entre glia cerebro de ratón neonatal (métodos descritos en la Ref. 5) y de ratón adulto médula espinal glia (Figura 1). líneas celulares establecidas son fáciles de usar y de mantener y pueden proporcionar un gran número de células en un período de tiempo corto. En general, las líneas celulares inmortalizadas son generados ya sea usando un sistema de inmortalización mediada por virus (tales como la línea celular microglial ampliamente utilizado BV2) 6, 7 o después de THe identificación de transformación espontánea (tal como la línea celular de astrocitos C8-D1A y la línea celular microglial C8-B4) 8, 9 líneas celulares son excelentes en el estudio de las características moleculares de los astrocitos y microglia individualmente.; sin embargo, los resultados obtenidos de líneas celulares siempre requieren una validación adicional en las células primarias o en condiciones in vivo. También hay que señalar que no ha habido un informe de una línea celular glial que se deriva de un glia de la médula espinal de roedores.

Para ayudar a la investigación de la función de las células gliales de la médula espinal en el desarrollo del dolor neuropático, un sistema de cultivo que se deriva de la médula espinal de ratón adulto se ha desarrollado mediante la adaptación de un método reportado previamente utilizado para generar de rata adulta cultivos gliales mixtos 4, 5 . El cultivo glial médula espinal de ratón se refinó aún más recientemente 10 y se describe en más detalle en este artículo. Adultas de la médula espinal mezclado culturas gliales cSe establecerá una con un ratón a partir de cepas seleccionadas que se adapten a las necesidades del estudio en particular, y las células se pueden mantener en cultivo durante hasta 21 días después del inicio del cultivo. Este método se puede utilizar en estudios de dolor neuropático, así como en las investigaciones de diversas enfermedades neurológicas que implican cambios patológicos en la médula espinal, tales como la esclerosis amiotrófica lateral (ALS), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) -asociado neuropatía sensorial, y múltiple la esclerosis (MS).

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Protocolo

El siguiente protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad de Nueva Inglaterra. El siguiente protocolo es para la preparación de cultivos gliales de la médula espinal 4 de ratón adulto.

1. Preparación de las soluciones en una campana de cultivo bajo condiciones asépticas

  1. Preparar medios de cultivo: modificación del medio de Eagle (cDMEM) que contiene DMEM completo de Dulbecco (con 4,5 g / l de glucosa), 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina , 250 ng / ml de anfotericina B y 50 mM 2-mercaptoetanol (2-ME; véase el punto 1.1.1). Mezclar y filtrar esterilizar todos los demás componentes y luego añadir FBS. Almacenar los medios de cultivo a 4 ° C.
    1. Preparar 50 mM 2 ME-/ solución salina tamponada con fosfato solución madre (PBS): Añadir 100 ml de concentrado 2-ME (14,3 M) en 28,6 ml de PBS 1x, y esterilizar el filtro (la solución se puede almacenar a 4 ° C durante varios meses). TSE 1 ml de 2-ME solución de reserva por cada 1.000 ml de medio de cultivo.
  2. Preparación de los medios de gradiente de densidad
    1. Preparar una solución isotónica medios de gradiente de densidad de valores (por ejemplo, el 100% de Percoll) a partir de 1 parte de 10x PBS estéril regular y 9 partes de medios de gradiente de densidad estéril de valores (por ejemplo, Percoll).
    2. Diluir los medios de gradiente de densidad de 100% (hecho en 1.2.1) con 1x regular de PBS estéril para hacer un medio de gradiente de densidad de 20% (por ejemplo, 10 ml de medio de gradiente de densidad de 100% con 40 ml de 1x PBS) y almacenarla en 4 o C. Llevar los medios de gradiente de densidad de 20% a temperatura ambiente (TA) antes de preparar el cultivo celular.
  3. Preparación de las soluciones del sistema de disociación de papaína
    NOTA: El sistema de disociación de papaína puede ser identificado en la Tabla de Materiales. Otros kits de disociación similares (incluyendo los reunidos en la casa) también se pueden utilizar. Todo Components deben ser estériles.
    1. Añadir 32 ml de solución salina equilibrada de Earle (EBSS) a la mezcla de inhibidor de ovomucoide (polvo).
    2. Añadir 5 ml de EBSS a un vial de papaína (polvo). Coloque el vial de la papaína en un 37 ° C baño de agua durante 10 minutos o hasta que la papaína se disuelve.
    3. Añadir 500 l de EBSS a un vial de DNasa (polvo). Mezclar suavemente.
    4. Añadir 250 l de la solución de DNasa (arriba) al vial de la papaína.
    5. Calcular la cantidad total de la mezcla de papaína / DNasa anterior es necesario (aproximadamente 800 l de mezcla de papaína / DNasa por ratón médula espinal) y transferir la mezcla necesaria en un tubo de 50 ml para la digestión del tejido (paso 3.2). Almacenar el sobrante en el vial original a 4 ° C durante al menos dos semanas.
    6. Mantenga todos los componentes de los kits en hielo hasta que se necesite.
  4. Preparar tubos de recogida de la médula espinal: un tubo estéril de 15 ml con 5 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS; del sistema de papaína disociación,0; para la recogida de la médula espinal) y un tubo estéril de 15 ml con PBS 1x (para llenar la jeringa de 5 ml, véase el paso 2.4). Además, preparar una placa de Petri estéril (35 mm o 60 mm) con 5 ml de HBSS y mantenerlo en la campana de cultivo.

2. Colección de la médula espinal

NOTA: Todo el equipo debe ser estéril. Realizar la recolección en un área designada aprobado por el IACUC.

  1. Obtener las siguientes herramientas para las médulas espinales de recolección de ratón: tijeras rectas afilados / romos de 18 cm quirúrgicos, un bisturí de 12 cm estándar (# 3 sólido), de acero al carbono hojas de bisturí estériles Nº 10, una pequeña decapitator animal, de 12 cm estándar curvada fórceps y una aguja 20G estéril unida a una jeringa de 5 ml.
  2. La eutanasia a los animales con CO2 y desinfectar la cabeza de ratón y la región trasera con un 70% de etanol (EtOH).
  3. Decapitar al animal con decapitator. Hacer una incisión longitudinal medio de la espalda baja para exponer la capa muscular. Haceruna transección limpia a través de la columna de vertebrados en el nivel de la cadera (también cortar a través de la capa muscular que cubre la columna de vertebrados) con las tijeras quirúrgicas estériles rectas (18 cm).
  4. Colocar el animal en una hoja de fresca toallita desechable. Con cuidado, inserte la aguja G 20 (que se adjunta a una jeringa de 5 ml lleno de PBS 1x estéril (paso 1.4)) en la columna vertebral hacia el lado rostral. Mantenga el animal hacia abajo con fuerza y ​​empuje la jeringa rápidamente. Toda la médula espinal debe salir desde el extremo del cuello uterino. Recoger la médula espinal en el tubo que contiene 15 ml de HBSS.
  5. Repita el paso 2.4 para el resto de los ratones. Entre cada animal, desinfectar todos los instrumentos utilizados con EtOH al 70%.
    NOTA: Por lo general, una sola placa de 12 pocillos se puede establecer por cada 4 médulas espinales de ratones (véase 4.3).

3. Preparación de la suspensión de células únicas

Nota: Realice los pasos 3 y 4 en una campana de cultivo para mantener todo estéril.

  1. Transferir todos los cables de la columna vertebral en la placa de Petri que contiene HBSS-(paso 1.4). Cortar cada una de las médulas espinales en muchos, pequeños trozos finos con tijeras y pinzas estériles. Transferir el tejido de la médula espinal al tubo cónico de 50 ml que contiene la papaína preparado / mezcla de enzimas ADNasa (etapa 1.3.5) usando pinzas estériles o una pipeta ml 10 (evitar la adición de HBSS a la mezcla de enzimas, ya que esto va a diluir aún más la preparó solución de enzima y puede resultar en una disminución del rendimiento de la enzima).
  2. Vortex el tubo suavemente para mezclar. Incubar el tubo a 37 ° C durante 1 h en un incubador / agitador con agitación orbital a 150 rpm.
  3. Vortex el tubo de nuevo y vigoroso triturar la solución de enzima con el tejido usando una pipeta de 5 ml para promover aún más la disociación.
  4. Transferir la suspensión celular en un tubo de 15 ml y centrifugar a 300 xg durante 5 min a TA.
  5. Durante la centrifugación, mezclar 2,7 ml de EBSS con 300 l de reconstituido inh albúmina ovomucoidesolución ibitor (1.3.1) en un tubo estéril. Añadir 150 l de la solución de DNasa (etapa 1.3.3).
  6. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular con la solución preparada anteriormente (paso 3.5). Vortex bien para romper el sedimento celular.
  7. Añadir 3 ml de solución reconstituida albúmina ovomucoide inhibidor (etapa 1.4.1) a la suspensión celular. centrifugar las células a 70 xg durante 6 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante (que contiene fragmentos de membrana).

4. eliminación adicional de la mielina de la suspensión de células únicas

  1. Añadir 8 ml de medio de gradiente de densidad de 20% (preparado en la etapa 1.2.2) en el tubo que contiene el sedimento celular, vórtice suavemente para perturbar el sedimento, y centrifugar las células a 800 xg durante 30 min a TA sin frenado. Retire cuidadosamente la capa superior de los desechos (en su mayoría de mielina) y el sobrenadante, pero mantener el sedimento.
  2. Para eliminar restos de la gradiente de densidad, se lavan las células por resuspending el sedimento celular con 8 ml de una cDMEM diluido (1 parte cDMEM y 2 partes HBSS). Centrifugar las células a 400 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y lavar las células de nuevo con la cDMEM diluido (arriba) de la misma manera. Mantener las células en hielo hasta la siembra de ellos.
  3. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en medio de cultivo (cDMEM suministra con 2-ME (preparado en el paso 1.1)). Para una placa de 12 pocillos, utilice 3 ml x 4 (número de ratones utilizados) + 2 ml = 14 ml de medios de comunicación. Esto asegurará que haya suficiente suspensión de células para toda la placa (12 pocillos) y proporcionará para pozos adicionales que se pueden utilizar para determinar el número promedio de células por pocillo y el contenido microglial de la cultura. Si se van a utilizar otros tipos de recipientes de cultivo, calcular el volumen total de medios de cultivo necesario proporcionalmente.
  4. Añadir 1 ml de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 12 pocillos.
  5. Se incuban las células a 35,9 ° C con 5% de CO 2.
  6. Cambiar los medios de comunicación (quitar los viejos medios a través de aspiración) en D1 y luego cada 3 - 4 d a partir de entonces (normalmente cambiar el soporte de D: 1, 4, 8 y 11, y luego usar las células en el día 12).
    NOTA: En los días 1, el cultivo puede contener cantidades significativas de desechos debido a la mielina residuo desde el tejido de la médula espinal; por lo tanto, se recomienda cambiar los medios de comunicación en el día 1 (véase la discusión para más información). Los cultivos están listos para el tratamiento entre D 12 - 14. Las células son por lo general 80% de confluencia en D 12 y pueden ser de casi el 100% de confluencia de D 14. Por lo general, el D 12, hay cerca de 100.000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos .

figure-protocol-1
Figura 2:. Imágenes representativas de células gliales mixtas en diferentes momentos después del establecimiento de la cultura glia mixto glia mixtos médula espinal primarios se prepararon a partir de adultos C57BL / 6 ratones. imágenes representativasmostrar el progreso de la cultura gliales después de la siembra. Al día 1, algunas células se unen a la placa de cultivo, pero todavía están en su mayoría ronda. También hay muchas células flotantes y escombros significativa. Al día 4, la mayoría de las células están unidas a la placa de cultivo. Las células aparecen ramificada con los procesos visibles. Las células se distribuyen de forma esporádica y las culturas son aproximadamente 20-30% de confluencia en este momento. En el día 8, las culturas son entre un 50-60% de confluencia. Algunas áreas de las culturas tienen grandes parches de células. Otras áreas de las culturas tienen escasa crecimiento de las células. Algunas células dentro de los parches adquieren una apariencia "cuadrado-como". Al día 12, los cultivos están en o por encima de 80% de confluencia (confluencia de 90% en la imagen que se muestra aquí). De células se encuentran en la fase logarítmica de crecimiento en este momento y entre los días 12-14 es el momento óptimo para el uso de las células de la glia para los experimentos. Por favor, haga clic aquí para ver unaversión más grande de esta figura.

  1. Examinar el contenido de la microglia utilizando células de los pozos adicionales (paso 4.3) a través de células activadas por fluorescencia estándar (FACS) protocolo de tinción 11 usando la combinación de anti-ratón-CD45 y anticuerpos monoclonales anti-CD11b ratón. Células CD45 + CD11b + se identifican como microglia.

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Resultados

Este método se puede usar para preparar células gliales mixtos a partir de los dos ratones y ratas. El número total de células medio por pocillo en una placa de 12 pocillos en D-12 después del inicio del cultivo debe ser relativamente estable, con alrededor de 100.000 células por pocillo cuando las células se derivan de la médula espinal de ratón. Las células gliales obtenidas a partir de este método se pueden utilizar en experimentos diseñados para examinar las respuestas gliales de la ...

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Discusión

Es fundamental para llevar a cabo todos los pasos, incluyendo el cambio de horario, de manera coherente con el fin de obtener resultados reproducibles entre los experimentos medios de comunicación. Los siguientes pasos son particularmente críticos para obtener una excelente calidad de adultos glía mixta.

La digestión enzimática es un aspecto importante de este protocolo. Es crucial que las piezas de tejido son bien digerido con el fin de obtener una suspensión de células individuales. Sin em...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los cultivos mixtos de médula espinal adulta se desarrollaron por primera vez utilizando ratas con el apoyo de una beca R01 de los NIH/NIDA (PI De Leo) y una beca de formación T32 de los NIH (PI Green). Estos métodos se adaptaron aún más para la médula espinal de ratón con el apoyo de las siguientes subvenciones: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao) y NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). Los autores también desean agradecer al Dr. Alejandro M. S. Mayer, del Departamento de Farmacología del Colegio de Medicina Osteopática de Chicago, por su ayuda técnica en la obtención de células gliales mixtas ricas en microglía.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dulbecco' s modificación de Eagle' s (DMEM) con 4,5 g/L de glucosaLonza12-709FEl medio cDMEM es un medio de cultivo estándar ampliamente utilizado. Los investigadores individuales pueden decidir dónde comprar el DMEM y todos los demás componentes utilizados para fabricar los medios cDMEM.
L-glutamina (100x)Lonza17-605ELa L-glutamina es un componente estándar ampliamente utilizado para diversos medios de cultivo. Los investigadores individuales pueden decidir dónde comprar L-glutamina.
Solución antibiótica-antimicótica (100x)Corning-Mediatech30-004-CISe trata de una combinación de penicilina, estreptomicina y anfotericina formulada para contener 10.000 unidades/mL de penicilina G, 10 mg/mL de sulfato de estreptomicina y 25 µ g/mL de anfotericina B. Los investigadores individuales pueden decidir dónde comprar componentes individuales.
2-mercaptoetanol (2-ME)Sigma-AldrichM3148A Biorreactivo, adecuado para cultivo celular, biología molecular y electroforesis.
Sistema de disociación de papaínaWorthington Biochemical CorporationLK003150Los componentes individuales de este kit se pueden comprar por separado.
PercollGE Health Care17-0891-01Percoll se vende como solución estéril. Percoll sin diluir se puede volver a esterilizar en autoclave si es necesario.
Incubadora/agitadora de línea de laboratorio Barstead/Línea de laboratorioMaxQ4000 Esta es la incubadora/agitadora que tenemos actualmente. En su lugar, se pueden utilizar otros tipos de agitadores.
Lipopolisacáridos, Salmonella Minnesota Re595Sigma-AldrichL-9764Otras cepas de LPS también pueden inducir respuestas gliales. Sin embargo, la magnitud de las respuestas puede variar.
Ratón IL-6 DuoSet ELISA R& D SystemsDY406Cada investigador individual puede seleccionar el kit de ELISA que prefiera.
Ratón TNF-alpha DuoSet ELISAR& D SystemsDY410Cada investigador individual puede seleccionar el kit de ELISA que prefiera.
Ratón IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISAR& D SystemsDY466Cada investigador individual puede seleccionar el kit ELISA que prefiera.
Ratón MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia setBD Biosciences555260Cada investigador individual puede seleccionar el kit ELISA que prefiera.
Quimiocina de ratón Q-PlexQuansys Biosciences120251MSEste producto no estaba disponible para ensayos internos en ese momento. En su lugar, enviamos muestras al fabricante para su análisis.
APC-anti-mouse-CD45 (clon 30-F11)eBioscience17-0451puede utilizar un anticuerpo del mismo clon pero de otros proveedores.
FITC-anti-mouse-CD11b (clon M1/70)eBioscience11-0112Se puede utilizar un anticuerpo del mismo clon pero de otros proveedores.
Citómetro de flujo Accuri C6BD BiosciencesBD Accuri C6 Cada investigador puede utilizar cualquier citómetro de flujo que prefiera.
Software FlowJoTree Star, Inc.FlowJo7.6.5Cada investigador individual puede utilizar cualquier software de análisis que prefiera.
Se

Referencias

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