Un método alternativo de inyección y validado para acceder al espacio subretiniano vía Un enfoque posterior transescleral

Summary

Las inyecciones subretinianas son la técnica más común para administrar grandes agentes terapéuticos, como proteínas y vectores virales, a los fotorreceptores y al epitelio pigmentario de la retina. Aquí se describe un método alternativo en ratones que se dirige con éxito al espacio subretiniano con un daño colateral mínimo y tiempos de recuperación rápidos.

Abstract

inyecciones subretinales han utilizado con éxito en seres humanos y roedores para realizar intervenciones terapéuticas de proteínas, agentes virales, y las células a la interfotorreceptor compartimento / subretinal que tiene la exposición directa a los fotorreceptores y el epitelio pigmentario de la retina (RPE). inyecciones subretinales de plasminógeno, así como los últimos ensayos preclínicos y clínicos han demostrado la seguridad y / o eficacia de la entrega de vectores virales y células madre de individuos con enfermedad de la retina avanzada. Los modelos de ratón de la enfermedad de la retina, distrofias retinianas hereditarias en particular, son esenciales para probar estas terapias. El procedimiento de inyección más común en los roedores es el uso de pequeñas incisiones o transcorneal transescleral con un enfoque anterior a la retina. Con este enfoque, la aguja de inyección penetra en la retina neurosensorial interrumpir el RPE subyacente y en la inserción puede fácilmente nick la lente, haciendo que la opacificación de la lente y el deterioro de Imagi no invasivang. Acceder al espacio subretiniano a través de un transescleral, abordaje posterior evita estos problemas: la aguja atraviesa la esclerótica de aproximadamente 0,5 mm desde el nervio óptico, sin penetración de la retina y evita interrumpir el vítreo. El daño colateral se limita a la asociada con el sclerotomy focal y los efectos de un transitorio, desprendimiento seroso de la retina. La simplicidad del método minimiza la lesión ocular, asegura una rápida reinserción y recuperación de la retina, y tiene una baja tasa de fracaso. El mínimo daño a la retina y RPE permite una clara evaluación de la eficacia y los efectos directos de los propios agentes terapéuticos. Este manuscrito describe una nueva técnica de inyección subretinal que se puede utilizar para dirigir los vectores virales, agentes farmacológicos, las células madre o células madre pluripotentes inducidas (iPS) al espacio subretiniano en ratones con una alta eficacia, un daño mínimo, y una recuperación rápida.

Introduction

Inyecciones subretinales son el medio principal de suministro de agentes celulares y virales para las retinas de ratones para estudiar sus efectos en los fotorreceptores y RPE subyacente ^1,2. La mayoría de los protocolos de inyección subretiniana en ratones utilizan una transcorneal o un sitio de inyección transescleral anterior al ecuador (Figura 1). Este enfoque puede resultar en daño colateral inherente que incluye mellar y turbidez resultante de la lente, la alteración de la integridad del vítreo, la penetración de la retina neurosensorial y el iris, hemorragia retiniana, desprendimientos de retina sustanciales y edema subretinal durad....

Protocol

Animales: tipo salvaje C57BL / 6J ratones criados en la Universidad de California en Los Angeles (UCLA). Todos los animales eran de entre 11 - 17 semanas de edad, y se incluyen ratones machos y hembras. Todos los ratones fueron alojados en grupo, mantenido en un 12:12 ciclo luz / oscuridad con comida y agua ad libitum. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales de la UCLA y la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología Declaración para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y Visión.

NOTA: Todos los fármacos y agentes inyectables son Farmacopea de Estados Unidos grado (USP).

1. Prep....

Results

Posterior de aproximación inyecciones subretinianas transescleral se realizaron en 31 ojos sanos de 16 ratones de tipo salvaje con inyecciones de 0,3 l (n = 18), 0,5 l (n = 8) y 1,0 l (n = 5) de 0,01% fluoresceína. Un ojo fue excluido de la inyección debido a la opacidad corneal preexistente que impedía el análisis estructural y funcional. Todos los ojos inyectados se incluye en este informe. No hay desprendimientos de retina no deseados, se detectaron los pinchazos de la retina neurosen.......

Discussion

inyecciones subretinales son el método de elección para la administración de vectores virales y el tallo terapia derivada de células para la manipulación de fotorreceptores y RPE en la investigación básica y el tratamiento clínico. En los pacientes, las inyecciones subretinal se hacen típicamente con un sclerotomy anterior en la pars plana, una vitrectomía del núcleo posterior y la penetración de la retina por la aguja con visualización directa. Como con la mayoría de procedimientos de vitrectomía, es común para la form.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton Modelo 62 RN SYR	Hamilton	87942	Jeringa x 1
Aguja Hamilton 33 G, 1.0", 20 DEG, punto 3 (acero inoxidable 304)	Hamilton	7803-05	Agujas x 6
Tijeras curvas Vannas	Ted Pella, INC.	1347	Hoja de 5 mm Cuchillo de
microcirugía de 22.5 grados Wilson	Ophthalmic Corp.	91204
Ketaject	Phoenix	NDC 57319-609-02	Ketamina
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Xilacina
Fluoresceína 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 mg/ml
0.9% Solución salina USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	de NaCl al 0.9% Akorn
		NDC 17478-235-35	oftálmica
Bomba de circulación	Gaymar	TP-500 T/Pump	N/P 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	Serie R Cámara de fondo de	comercial
	Research Laboratories	Pinzas MICRON III
Tipo 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2.5% Fenilefrina	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Oftálmico
IMARIS8	Bitplane		Versión 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Hipromelosa  2.5%	Goniovisc	AX0401	metilcelulosa
(enjuague)	Bausch & Microscopio	solución salina
Microscopio	Zeiss	Stemi 2000
Fuente de luz	Fostec	N/P 20520	Fuente de luz