Un método alternativo de inyección y validado para acceder al espacio subretiniano vía Un enfoque posterior transescleral

Summary

Las inyecciones subretinianas son la técnica más común para administrar grandes agentes terapéuticos, como proteínas y vectores virales, a los fotorreceptores y al epitelio pigmentario de la retina. Aquí se describe un método alternativo en ratones que se dirige con éxito al espacio subretiniano con un daño colateral mínimo y tiempos de recuperación rápidos.

Abstract

inyecciones subretinales han utilizado con éxito en seres humanos y roedores para realizar intervenciones terapéuticas de proteínas, agentes virales, y las células a la interfotorreceptor compartimento / subretinal que tiene la exposición directa a los fotorreceptores y el epitelio pigmentario de la retina (RPE). inyecciones subretinales de plasminógeno, así como los últimos ensayos preclínicos y clínicos han demostrado la seguridad y / o eficacia de la entrega de vectores virales y células madre de individuos con enfermedad de la retina avanzada. Los modelos de ratón de la enfermedad de la retina, distrofias retinianas hereditarias en particular, son esenciales para probar estas terapias. El procedimiento de inyección más común en los roedores es el uso de pequeñas incisiones o transcorneal transescleral con un enfoque anterior a la retina. Con este enfoque, la aguja de inyección penetra en la retina neurosensorial interrumpir el RPE subyacente y en la inserción puede fácilmente nick la lente, haciendo que la opacificación de la lente y el deterioro de Imagi no invasivang. Acceder al espacio subretiniano a través de un transescleral, abordaje posterior evita estos problemas: la aguja atraviesa la esclerótica de aproximadamente 0,5 mm desde el nervio óptico, sin penetración de la retina y evita interrumpir el vítreo. El daño colateral se limita a la asociada con el sclerotomy focal y los efectos de un transitorio, desprendimiento seroso de la retina. La simplicidad del método minimiza la lesión ocular, asegura una rápida reinserción y recuperación de la retina, y tiene una baja tasa de fracaso. El mínimo daño a la retina y RPE permite una clara evaluación de la eficacia y los efectos directos de los propios agentes terapéuticos. Este manuscrito describe una nueva técnica de inyección subretinal que se puede utilizar para dirigir los vectores virales, agentes farmacológicos, las células madre o células madre pluripotentes inducidas (iPS) al espacio subretiniano en ratones con una alta eficacia, un daño mínimo, y una recuperación rápida.

Introduction

Inyecciones subretinales son el medio principal de suministro de agentes celulares y virales para las retinas de ratones para estudiar sus efectos en los fotorreceptores y RPE subyacente ^1,2. La mayoría de los protocolos de inyección subretiniana en ratones utilizan una transcorneal o un sitio de inyección transescleral anterior al ecuador (Figura 1). Este enfoque puede resultar en daño colateral inherente que incluye mellar y turbidez resultante de la lente, la alteración de la integridad del vítreo, la penetración de la retina neurosensorial y el iris, hemorragia retiniana, desprendimientos de retina sustanciales y edema subretinal duradera ^3-9. Las manipulaciones experimentales deben superar estos efectos con el fin de evaluar los efectos de las intervenciones terapéuticas ^3,7,10,11. Este estudio proporciona una descripción detallada y validación de un método de inyección transescleral posterior que evita estas complicaciones, minimiza el trauma y tiene una alta tasa de éxito de la focalización del subespacio de la retina.

Las inyecciones dirigidas al espacio subretiniano en ratones son a menudo muy difícil de realizar y la mayoría de los investigadores se encuentran con una alta frecuencia de intentos fallidos en el que el vector se entrega a una ubicación incorrecta o hay un daño significativo de la retina, por ejemplo, en un desprendimiento de retina completa ^6. El número de ojos excluidos del análisis debido a complicaciones de inyección normalmente no se informó en los estudios del ratón, pero en nuestra propia experiencia y en colaboración con otros investigadores, el número de inyecciones fallidas puede ser tan alta como 50% y variar en función de la experiencia y capacidades del investigador que está llevando a cabo las inyecciones. El éxito de la inyección se suele evaluar mediante imágenes de fondo de ojo directa y / o la tomografía de coherencia óptica (OCT) ^7,9. Un método fácil de dominar con altas tasas de éxito para inyecciones subretiniana en ratones puede acelerar la experimentación y reducir el costo de los estudios preclínicos de treatments para enfermedades de la retina que son las principales causas de ceguera en los Estados Unidos.

La posterior, técnica de inyección subretiniana transescleral descrito aquí es una adaptación de los protocolos clínicos y preclínicos ^9,12. Las evaluaciones de diagnóstico no invasivas realizadas en ratones inyectados demuestran daños leves y muy localizada y carecen de lente de garantías adicionales, lesión de la retina y RPE. Por otra parte, con relativamente poca práctica, un experimentador puede lograr estos resultados con una alta tasa de éxito (80 - 90% o más), lo que reduce los costos asociados con este tipo de estudios. Este procedimiento se puede usar para realizar intervenciones terapéuticas celulares, virales, o farmacológicos a los fotorreceptores y / o RPE en estudios preclínicos y evaluar fácilmente intervenciones experimentales.

Protocol

Animales: tipo salvaje C57BL / 6J ratones criados en la Universidad de California en Los Angeles (UCLA). Todos los animales eran de entre 11 - 17 semanas de edad, y se incluyen ratones machos y hembras. Todos los ratones fueron alojados en grupo, mantenido en un 12:12 ciclo luz / oscuridad con comida y agua ad libitum. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales de la UCLA y la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología Declaración para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y Visión.

NOTA: Todos los fármacos y agentes inyectables son Farmacopea de Estados Unidos grado (USP).

1. Preparación quirúrgica

1. Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de 100 mg / kg de ketamina y 8 mg / kg de xilazina en una mezcla de solución salina. Administrar la anestesia a una profundidad tal que el ratón no tiene pizca dedo del pie o los reflejos corneales táctiles.
2. Mantener la temperatura corporal a 37,0 ° C con un relleno aislante de agua circulante.
3. Dilatar los alumnos con un 2,5% de ojo d fenilefrinaROPS y recortar los bigotes para facilitar la visualización. Whiskers proporcionan la entrada sensorial significativa al ratón, por lo tanto, barba recorte debería eliminar sólo la parte que bloquea el acceso claro a la vista, y no a la base de la barba. En nuestra experiencia, los ratones muestran una recuperación normal después de este procedimiento. Aplicar ojo metilcelulosa gotas para evitar la sequedad y minimizar los anestésicos cataratas inducidas transitorias ^13.
4. Esterilizar los instrumentos antes de la cirugía (es decir, betadine y etanol o perlas calientes).
5. Preparar fluoresceína diluida (0,01% usando 0,9% de solución salina) en un ambiente estéril (es decir, cabina de bioseguridad) si se llevará a cabo la visualización (véase la sección 3).

2. Preparación del lugar de inyección

1. Preparar una jeringa (por ejemplo, la jeringa 5 l) con el volumen apropiado de inyección (por ejemplo, 0,3 a 1,0 l).
2. Coloque el puntero del ratón por lo que el ojo está mirando hacia arriba y claramente visible en el dissecting microscopio.
3. pellizcar suavemente la conjuntiva temporal con unas pinzas de punta fina. Hacer una incisión circunferencial de aproximadamente 90 grados con unas tijeras curvadas Vannas.
4. Repita el paso 2.3 con la cápsula de Tenon subyacente.
5. Resecar el tejido conectivo que rodea con unas pinzas de punta fina mientras gira el mundo por vía nasal. El trabajo hacia el lugar de la inyección de aproximadamente 0,5 mm temporal en el nervio óptico. Tenga mucho cuidado para no perturbar el seno retro-orbital.

3. sclerotomy y Subretiniana Inyección

NOTA: Se recomienda que la inyección de 0,01% de fluoresceína en 0,9% de solución salina se utiliza para ayudar en la visualización, mientras que el aprendizaje de este procedimiento. La distribución topográfica de la fluoresceína puede ser efectivamente documentado con imágenes de fondo de ojo (ver sección 4).

1. Hacer una pequeña incisión escleral en el lugar de la inyección por rascarse suavemente la copa ocular con una cuchilla oftálmica 22,5 grados. Esta incisión shousolamente ld ser lo suficientemente grande para permitir que la punta de la aguja pase a través de la esclerótica.
2. Inserte la aguja de 33 G biselado (ángulo. 5 - 10 ° en el sclerotomy con el bisel hacia y en ángulo paralelo a la retina Inyectar el volumen deseado (por ejemplo, 0,3 a 1,0 l de 0,01% con fluoresceína para fines de aprendizaje).
   NOTA: mantener la esterilidad de la jeringa mediante la limpieza a fondo con lavados sucesivos de un disolvente adecuado y agua DI antes de cada inyección.
3. Presione el émbolo lentamente (durante ~ 3 seg) sin mover la aguja y con una presión uniforme.
   NOTA: Cuando la aguja está en el espacio subretiniano, una ligera resistencia se hará sentir mientras oprime el émbolo. No habrá una resistencia mínima a si la aguja perfora la retina, y una alta resistencia si la aguja no penetra la esclerótica o RPE.
4. Espere unos segundos antes de retirar la aguja para minimizar el reflujo.
5. Enjuague el ojo con solución salina tamponada estéril y garantizar el ojo hcomo girar de nuevo a su posición normal.

4. Evaluación de desprendimiento de retina mediante OCT y el fondo de ojo Imaging

1. Realizar PTU de imágenes inmediatamente después de la inyección para evaluar la calidad de la inyección y en el momento apropiado puntos después de la inyección, según sea necesario para evaluar la estructura de la retina.
   NOTA: Los ejemplos de la utilización de octubre en estudios similares se han descrito previamente ^7,14.
   1. Ajustar y alinear la imagen de OCT para dirigirse al sitio de la inyección. El sitio de inyección debería ser la línea media y 0,5 mm temporal a la cabeza del nervio óptico. Repita según sea necesario si el desprendimiento está fuera del marco o no está centrada de forma óptima.
2. Visualizar el desprendimiento de retina y teñir el área de inyección con cara de fondo de ojo en las imágenes ^7,14.
   NOTA: Si un sistema de imágenes PTU no está disponible, la inyección de una pequeña cantidad de fluoresceína con un vector para la práctica va a permitir la visualización con cualquier cámara de fondo que realiza la angiografía con fluoresceínagraphy utilizando las mismas longitudes de onda de excitación y filtros de bloqueo. áreas localizadas de hiper-fluorescencia aparecerán debajo de la vasculatura y la vasculatura tendrán límites claros y distintos si el espacio subretiniano está dirigido correctamente. El borde de la ampolla de la inyección será demarcada por la transición de la hipertensión a la fluorescencia hipo. Varios instrumentos proporcionan esta capacidad para el ratón; la instrumentación usada aquí se describe en otro ^14.

5. Cuidado post-operatorio

1. Aplicar una capa gruesa de crema de triple antibiótico oftálmico a la superficie de la córnea del ojo inyectado.
2. Coloque los ratones en jaulas solitarias limpias para la recuperación. No combine ratones que han sido sometidos a cirugía hasta que estén completamente recuperados.
3. Monitor de la respiración y la temperatura durante la recuperación de la anestesia. Observar a los animales hasta que puedan mantener decúbito esternal.
4. Realizar el seguimiento post-operatorio adicional apropiaday tratamiento, incluyendo una inyección subcutánea de carprofeno (5 mg / kg) para el tratamiento del dolor post-quirúrgico.

6. Evaluación de la función de la retina por Electrorretinografía (ERG)

1. Realizar análisis ERG pre-inyección y en el momento apropiado después de la inyección, según sea necesario para evaluar la función de la retina. Si la inyección se hizo en el espacio subretiniano, el desprendimiento de retina debe resolver dentro de 72 horas.
   1. Utilizar técnicas estándar ERG para evaluar la función de la retina antes y después de la inyección como se ha descrito previamente ^14,15.

Reconstrucción 3D 7. La cuantificación y la ampolla de volumen

NOTA: OCT exploraciones con alto contraste que abarca la totalidad del desprendimiento dentro del marco de vista son óptimas para su uso. ImageJ / Fiji ^17,18 y Imaris se utilizaron, pero otro software puede ser utilizado.

1. Exportar el B-scan de interés, la importación de ImageJ / Fiji y cultivos (Imagen> Recortar) la parte de la sc octubrean a ser modelado utilizando la herramienta de selección rectangular.
   1. Ajuste de contraste (Imagen> Ajustar> Brillo / Contraste) y deben especificar los límites que faltan mediante la conexión de dos secciones con una línea.
   2. Dibujar una línea recta con el (cambio de la celebración) herramienta de línea que se extiende por el EPR a la capa de fotorreceptores. Medida (Analizar> medida) la longitud de la línea para obtener el tamaño máximo de desprendimiento para el paso 7.8.
2. Importación cosechado tramas al software de reconstrucción 3D (Ver Tabla de Materiales) utilizando el "RGB a gris" plugin y MATLAB Compiler Runtime.
3. Ajuste el tamaño de vóxel (bajo Propiedades de la imagen) usando los parámetros de calibración a partir de las imágenes de OCT (x, y, z).
4. Ejecutar el plug-in "RGB a Gray" (bajo Propiedades de la imagen), con igual ponderación a cada canal, para crear un cuarto canal. Borrar los canales rojo, verde y azul originales.
5. Invertir el canal gris utilizando el cambio de contraste. Image Store.
6. Haga clic en el "añadir unasuperficie ew "botón en la pestaña 3D-View, y comenzar el proceso de guiado 4 pasos para crear la superficie.
   1. Ajuste el nivel de detalle de la superficie (paso 1 de 4).
      NOTA: En nuestra experiencia 8,0-12,0 era el rango más eficaz.
   2. Ajuste el tamaño de la esfera máximo (en Selección de fondo) a ligeramente menor que el tamaño máximo de desprendimiento se mide en el punto 7.1.2. Crear la superficie y deshacer la inversión de canal gris (paso 2 de 4).
   3. Establecer el umbral para el valor máximo por lo que la superficie de los espacios negativos fuera de la retina y el desprendimiento no entre en contacto (paso 3 de 4).
   4. Ajuste el tipo de filtro para el número de voxels y aislar el espacio negativo en el sitio de desprendimiento por tamaño. Acabar la superficie (paso 4 de 4).
      NOTA: El volumen de la superficie de desprendimiento se encuentra bajo volumen en la pestaña de estadísticas.

Results

Posterior de aproximación inyecciones subretinianas transescleral se realizaron en 31 ojos sanos de 16 ratones de tipo salvaje con inyecciones de 0,3 l (n = 18), 0,5 l (n = 8) y 1,0 l (n = 5) de 0,01% fluoresceína. Un ojo fue excluido de la inyección debido a la opacidad corneal preexistente que impedía el análisis estructural y funcional. Todos los ojos inyectados se incluye en este informe. No hay desprendimientos de retina no deseados, se detectaron los pinchazos de la retina neurosen...

Discussion

inyecciones subretinales son el método de elección para la administración de vectores virales y el tallo terapia derivada de células para la manipulación de fotorreceptores y RPE en la investigación básica y el tratamiento clínico. En los pacientes, las inyecciones subretinal se hacen típicamente con un sclerotomy anterior en la pars plana, una vitrectomía del núcleo posterior y la penetración de la retina por la aguja con visualización directa. Como con la mayoría de procedimientos de vitrectomía, es común para la form...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton Modelo 62 RN SYR	Hamilton	87942	Jeringa x 1
Aguja Hamilton 33 G, 1.0", 20 DEG, punto 3 (acero inoxidable 304)	Hamilton	7803-05	Agujas x 6
Tijeras curvas Vannas	Ted Pella, INC.	1347	Hoja de 5 mm Cuchillo de
microcirugía de 22.5 grados Wilson	Ophthalmic Corp.	91204
Ketaject	Phoenix	NDC 57319-609-02	Ketamina
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Xilacina
Fluoresceína 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 mg/ml
0.9% Solución salina USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	de NaCl al 0.9% Akorn
		NDC 17478-235-35	oftálmica
Bomba de circulación	Gaymar	TP-500 T/Pump	N/P 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	Serie R Cámara de fondo de	comercial
	Research Laboratories	Pinzas MICRON III
Tipo 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2.5% Fenilefrina	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Oftálmico
IMARIS8	Bitplane		Versión 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Hipromelosa  2.5%	Goniovisc	AX0401	metilcelulosa
(enjuague)	Bausch & Microscopio	solución salina
Microscopio	Zeiss	Stemi 2000
Fuente de luz	Fostec	N/P 20520	Fuente de luz