La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos

Summary

Este protocolo describe la visualización del desarrollo de biopelículas después de la exposición a factores del huésped utilizando un modelo de cámara de portaobjetos. Este modelo permite la visualización directa del desarrollo de la biopelícula, así como el análisis de los parámetros de la biopelícula mediante programas informáticos.

Abstract

Las biopelículas consisten en grupos de bacterias encapsuladas en una matriz de auto-secretada. Juegan un papel importante en la contaminación industrial, así como en el desarrollo y persistencia de muchas infecciones relacionadas con la salud. Una de las biopelículas más bien descritos y estudiados en la enfermedad humana se produce en la infección pulmonar crónica de los pacientes con fibrosis quística. Al estudiar biofilms en el contexto del huésped, muchos factores pueden afectar a la formación y el desarrollo de biopelículas. Con el fin de identificar cómo los factores del huésped pueden afectar a la formación y el desarrollo de biopelículas, se utilizó un método cubre objetos de cámara estática para crecer biopelículas en presencia de factores derivados del huésped en forma de sobrenadantes de esputo. Las bacterias se sembraron en cámaras y se expusieron a filtrados de esputo. Después de 48 h de crecimiento, las biopelículas se tiñeron con un kit de viabilidad comercial biopelícula antes de la microscopía confocal y análisis. Tras la adquisición de imágenes, las propiedades del biofilm pueden evaluarse utilizando diferentes plataformas de software.Este método nos permite visualizar las propiedades clave de la formación de biopelículas en presencia de diferentes sustancias, como los antibióticos.

Introduction

biopelículas bacterianas son grupos de microorganismos que están unidos entre sí y encerrados en una matriz de auto-secretada. ^1,2 Clásicamente, que representan bacterias unidas físicamente a una superficie abiótico o biótico formado bajo condiciones de flujo. Las biopelículas también se han demostrado para crecer en condiciones estáticas (ausencia de flujo) y distal de las superficies, tales como en la interfase aire-líquido de piscinas térmicas o unas películas formadas en tubos de ensayo. Estas biopelículas hace tiempo se reconoce en el medio ambiente y son un detrimento importante para los procesos industriales, ya que se pueden formar en los depósitos....

Protocol

Tenga en cuenta que se requiere Junta Ética de Investigación (REB) para recoger y almacenar muestras de esputo de sujetos humanos. Estos estudios fueron aprobados por el Hospital para Niños Enfermos REB # 1000019444.

1. Preparación de muestras de esputo CF

1. Recoger muestra de esputo de los pacientes durante las visitas rutinarias a la clínica de la fibrosis quística y mantener en hielo.
2. El transporte de la muestra de esputo en el hielo en la primera hora de la recogida, para el laboratorio de investigación, al objeto de tratamiento.

2. Procesamiento de esputo

1. Registrar el v....

Results

El diseño general del experimento está representado en la Figura 1. El uso de este protocolo proporciona un método conveniente para visualizar los cambios en las biopelículas que crecen durante diferentes períodos de tiempo (por ejemplo, 24, 48 o 72 hr). Es importante destacar que las señales exógenas, tales como esputo filtrados, se puede añadir a visualizar los cambios en el desarrollo de biopelículas. Como se ve en la Figura 2, la presencia d.......

Discussion

Los métodos descritos en este documento permiten la visualización de las biopelículas bacterianas cultivadas en la presencia de productos exógenos. No es sorprendente que la producción de los exoproductos es de importancia cuando se utiliza este tipo de sistema. Por ejemplo, ditiotreitol (DTT), se utiliza a menudo en muestras de esputo humanos para ayudar a licuar las muestras. Sin embargo, el efecto de la TDT solo puede disminuir el desarrollo de biopelículas y la viabilidad (datos no mostrados). Por lo tanto, los cont.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Cubreobjetos con cámara, borosilicato #1.5, 8 pocillos	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Kit de viabilidad de biofilm vivo/muerto Thermo	Fisher Scientific	L10316
Placas de agar sangre	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirmación de la viabilidad mediante recuentos de UFC o selección de colonias para la inoculación
COMSTAT	Software disponible en línea		COMSTAT es un software para analizar imágenes de biopelícula. Disponible en www.comstat.dk
Millers LB Caldo	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Medios estándar para el crecimiento nocturno de biopelículas
Filtros de jeringa Millex-GV	Millipore	SLGV013SL	Filtrado de supernantes de esputo
Solución salina tamponada con fosfato (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Lavado de cámaras de biofilm después de la eliminación de medios
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Espectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Las instrucciones para este software se pueden encontrar en: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf