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Artículo de método

Una plataforma de ensayos anti-biopelícula Adecuado para la Exploración de bibliotecas de compuestos naturales

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DOI:

10.3791/54829

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27 de diciembre de 2016

 ,  , 
1Pharmaceutical Design and Discovery (PharmDD), Faculty of Pharmacy, University of Helsinki

En este artículo

Resumen

Las infecciones por biofilm muestran una alta tolerancia a la quimioterapia. Ningún ensayo por sí solo capta la complejidad de las biopelículas. En su lugar, se necesitan ensayos complementarios. Presentamos una plataforma de cribado (desarrollada para S. aureus) que combina ensayos de viabilidad, biomasa y matriz de biopelícula. Permite el descubrimiento de fármacos anti-biopelícula, incluida la evaluación de los efectos quimioterapéuticos a largo plazo.

Resumen

Las biopelículas son considerados como uno de los temas más desafiantes de la biomedicina moderna, y son potencialmente responsables de más del 80% de las infecciones con antibióticos tolerantes. Biofilms han mostrado una tolerancia excepcionalmente alta para la quimioterapia, que se cree que es multifactorial. Por ejemplo, la matriz proporciona una barrera física que disminuye la penetración de los antibióticos en el biofilm. Además, las células dentro de los biofilms son fenotípicamente diversa. Probablemente, la capacidad de recuperación de biopelícula surge de una combinación de estos y otros, todavía desconocidos, mecanismos. Todos los antibióticos existentes en la actualidad se han desarrollado contra-unicelulares (bacterias planctónicas). Por lo tanto, hasta el momento, un repertorio muy limitado de moléculas existe que pueden actuar selectivamente sobre biofilms maduros. Esta situación ha llevado a un cambio de paradigma progresivo en el descubrimiento de fármacos, en la que se ha instado a la búsqueda de anti-biopelículas a ocupar un lugar más prominente. Un reto adicional es que hay unanúmero de métodos estandarizados para la investigación de biopelículas, especialmente aquellos que pueden ser utilizados para el cribado a gran rendimiento de bibliotecas químicas muy limitado. Aquí, se presenta una plataforma anti-biofilm experimental para la detección química. Utiliza tres ensayos para medir la viabilidad biofilm (con la tinción de la resazurina), la biomasa total (con tinción con violeta cristal), y la matriz de la biopelícula (usando una aglutinina de germen de trigo, basado-WGA-fluorescencia de tinción de la poli- N -acetil-glucosamina, PNAG , fracción). Todos los ensayos se desarrollaron utilizando Staphylococcus aureus como bacteria modelo. Se presentan ejemplos de cómo la plataforma puede ser utilizado para el cribado primario, así como para la caracterización funcional de los accesos identificados anti-biopelícula. Esta secuencia experimental permite además para la clasificación de los golpes sobre la base de los puntos finales medidos. También proporciona información sobre su modo de acción, especialmente en el largo plazo frente a los efectos de quimioterapia a corto plazo. Por lo tanto, es muy Advantageous para la identificación rápida de los compuestos de golpe de alta calidad que pueden servir como puntos de partida para diversas aplicaciones biomédicas.

Introducción

Las bacterias pueden cambiar entre dos estilos de vida muy diferentes, planctónicas y sésiles, de los cuales un biofilm es el ejemplo más común. En biofilms, las bacterias forman comunidades estructuradas embebidas en una matriz de producción propia 1. Esta matriz de producción propia es una barrera entre las bacterias y su entorno exterior, y protege las células microbianas, manteniéndolos en las proximidades. La composición de la matriz del biofilm varía entre, e incluso dentro de cada especie, pero en su mayoría se compone de una estrecha red de lipopolisacáridos, ADN extracelular y proteínas. La matriz sirve como una barrera física la inhibición de la entrada de agentes nocivos, sino que también protege la biopelícula de la deshidratación y evita que los nutrientes se escape de la célula 2.

Las biopelículas son considerados como uno de los temas más desafiantes de la biomedicina moderna, y son supuestamente responsables de más del 80% de las infecciones con antibióticos tolerantes a 3. ellos DISPestablecer una tolerancia inherentemente alta contra las amenazas externas: humedad, presión osmótica, el estrés mecánico 4, calor, radiación UV 5, desinfectantes, agentes antimicrobianos, y el sistema inmune del huésped 1. Por ejemplo, la concentración de agente antimicrobiano necesaria requerida para matar un biofilm ha demostrado ser hasta 1.000 veces mayor en comparación con la requerida para matar a las bacterias planctónicas. La explicación de esta mayor tolerancia parece ser multifactorial. La matriz proporciona una barrera física que disminuye la penetración de los antibióticos en el biofilm. Además, las células dentro de los biofilms son fenotípicamente diversa; su transición entre los diferentes estados metabólicos debido a un gradiente existente de oxígeno, nutrientes y metabolitos entre las partes interior y exterior de la biopelícula 6. Por lo tanto, en algunas regiones del biofilm, como el núcleo, las bacterias son privadas de oxígeno y nutrientes y viven en un metabólicamente menos activo o un estado completamente inactivos 7. Las células completamente inactivos se denominan células como persister, y no son susceptibles a los tratamientos antimicrobianos convencionales 8. Por lo tanto, es probable que la resiliencia biofilm surge de una combinación de los mecanismos actualmente sugeridos y otros, todavía desconocidos,. Staphylococcus spp. siguen estando entre las más problemáticas bacterias gram-positivas, causando graves, a menudo relacionados con la biopelícula, infecciones 4. Se sugiere que hasta el 99% de todas las bacterias están asociadas dentro de los biofilms, por lo que es el estilo de vida bacteriana predominante 3. Sin embargo, todos los antibióticos actualmente existentes se han desarrollado contra bacterias (planctónicas) de una sola célula. Hasta el momento, un repertorio muy limitado de moléculas existe que pueden actuar selectivamente sobre biofilms maduros. Esta situación ha llevado a un cambio de paradigma progresivo en el descubrimiento de fármacos, en la que se ha instado a la búsqueda de anti-biopelículas a ocupar un lugar más prominente.

Desde un METODOLOGÍAical perspectiva, existen retos adicionales, ya que sólo un número limitado de métodos de biopelícula han sido desarrollados por organizaciones de normalización, en especial los aplicables a la selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas. Todos los ensayos estandarizados (con una sola excepción) se basan en los reactores de biopelícula, y estos métodos requieren grandes volúmenes de trabajo y grandes cantidades de compuestos a ensayar, que son por lo general no está disponible durante la fase de investigación temprana 9-12. El ensayo de cribado-aplicable estandarizado única existente es el llamado dispositivo de Calgary Biofilm, de la que el sistema disponible en el mercado mínimo biofilm eliminación de concentración (MBEC) se desarrolló 13-15. Sin embargo, la limitación de este ensayo es que los biofilms se cultivan en las clavijas, y no todas las especies bacterianas o incluso cepas de la misma especie son capaces de formar biopelículas en este dispositivo. Además, los métodos que se pueden aplicar en particular a la exploración de compuestos naturales sonnecesario. Los productos naturales han sido la principal fuente de innovación en el descubrimiento de fármacos antimicrobianos en el último siglo 16. Ellos pueden proporcionar nuevos compuestos anti-biopelícula con mecanismos de acción únicos que también pueden ser eficaces contra las células persister. Por lo tanto, la exploración de bibliotecas naturales y naturalmente inspirados tiene grandes posibilidades de producir cables anti-biopelícula prometedores y únicos.

A continuación, presentamos los detalles experimentales de una plataforma de ensayos que fue desarrollado para la detección química de los compuestos anti-biopelículas utilizando tres pruebas para medir los efectos sobre la viabilidad, la biomasa total, y la matriz del biofilm de Staphylococcus aureus. La primera ensayo mide la viabilidad biofilm, y se basa en la tinción resazurina. La resazurina es una mancha redox que es azul y no fluorescente en su estado oxidado y se convierte en resorufina rosa, altamente fluorescente cuando se reduce por la actividad metabólica de las bacterias. Es un m muy simple y rápidoétodo adecuado para pruebas de detección primaria 17-20. El segundo ensayo, basado en la tinción de cristal violeta, mide la masa total de biofilm. El cristal violeta es una mancha muy utilizado para el estudio de las bacterias y las bacterias en las biopelículas 19,21-23. El ensayo se basa en reactivos baratos y tiene un simple lectura de la absorbancia de punto final. Por último, la tercera ensayo se dirige a la -matrix extracelular sustancia polimérica (EPS) de la biopelícula a través de aglutinina de germen de trigo (WGA), que se une específicamente a poli- N -acetil residuos-glucosamina (PNAG) presentes en la matriz de las biopelículas estafilocócicas 24. El WGA está conjugado con un fluoróforo que puede ser detectada mediante lectores de intensidad de fluorescencia 25. Presentamos aquí los razonamientos y detalles de la plataforma que hemos desarrollado, incluyendo ejemplos de aplicaciones.

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Protocolo

1. crecer la bacteria

  1. Precultivo las bacterias durante la noche en un caldo de soja tríptico (TSB) a 37 ° C con 220 rpm de agitación (16-18 h).
  2. Diluir el precultivo 100-1.000 veces (dependiendo de la tasa de crecimiento de las bacterias; aquí, 1.000 veces se utiliza para S. aureus) en TSB fresco y se deja crecer a 37 ° C y 200 rpm para llegar a un crecimiento exponencial (óptico densidad a 595 nm (OD 595) entre 0,2 y 0,6).
    NOTA: Este paso requiere la optimización específica de la cepa.

2. La formación de biopelículas: pre y post-exposición

  1. Diluir las exponencial cultivadas cultivo de 100 veces (esto es igual a aproximadamente 10 6 unidades formadoras de colonias por mililitro (CFU / ml)).
  2. Protocolo de Pre-exposición
    1. Para las muestras de control sin tratar, añadir 200 l de cultivo bacteriano diluido por pocillo de una placa de 96 micropocillos estéril.
    2. Añadir 4 l de un compuesto de ensayo o un control deantibióticos (50x solución de valores) y 196 l de cultivo bacteriano diluido por pocillo.
    3. Incubar a 37 ° C en un agitador de placas a 200 rpm durante 18 horas.
      Nota: Aquí se utiliza un agitador con una órbita de 2 mm.
  3. Protocolo post-exposición
    1. Para todas las muestras, añadir 200 l de cultivo bacteriano diluido por pocillo de una placa de 96 micropocillos estéril.
    2. Incubar a 37 ° C en un agitador de placas a 200 rpm durante 18 horas.
      Nota: Aquí se utiliza un agitador con una órbita de 2 mm.
    3. Retire toda la solución planctónicas con cuidado, sin tocar la biopelícula, usando una pipeta multicanal.
    4. Añadir 4 l de un compuesto de ensayo o un antibiótico de control (50x solución madre) y 196 l de TSB por pocillo.
    5. Incubar a 37 ° C en un agitador de placas a 200 rpm durante 24 horas más.
      Nota: Aquí se utiliza un agitador con una órbita de 2 mm.

3. La resazurina tinción protocol para la Evaluación de Viabilidad de biopelículas

  1. Preparar una solución madre de 0,1 mg / ml de resazurina (0,4 mM) en PBS estéril. Mantener esta población estéril, protegido de la luz, y a 4 ° C.
  2. Diluir la resazurina de la 1:50 en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) para conseguir una concentración final de 20 mM.
  3. Transferir la totalidad de la solución planctónicas (dejando las biopelículas en los pozos) con cuidado, sin tocar los biofilms o la creación de burbujas de aire, a una limpia placa separada, de 96 pocillos usando una pipeta multicanal.
  4. Se lavan las biopelículas una vez con PBS estéril mediante la adición de 200 l por pocillo, y retirarlo con cuidado usando una pipeta multicanal.
  5. Añadir 200 l de la resazurina diluida por pocillo de la placa de biofilm usando una pipeta multicanal.
  6. Incubar en la oscuridad, a temperatura ambiente (RT), y 200 rpm, agitando durante aproximadamente 20 min hasta que los controles no tratados biofilm son uniformemente de color rosa.
  7. Medir la fluorescencia aλ exc = 560 nm y λ em = 590 nm con un lector de placas (arriba a la lectura).

4. Cristal Violeta protocolo de tinción de Biomasa La cuantificación de biopelículas Usando el mismo plato como en el paso 3

  1. Quitar la mancha resazurina cuidadosamente de los pozos utilizando una pipeta multicanal.
  2. Fijar los biofilms con 200 l de metanol durante 15 min.
  3. Deje que la placa de aire seco durante 10 minutos.
  4. Añadir 190 l de 0,02% (vol / vol, se diluyó en agua desionizada) solución de cristal violeta, con cuidado usando una pipeta multicanal. Evitar tocar los lados de los pocillos con la mancha mientras pipeteado y evitar la formación de burbujas de aire no presionando la pipeta para completar de soplado.
  5. Incubar durante 5 min a TA.
  6. Quitar la mancha con cuidado, usando una pipeta multicanal.
  7. Lavar dos veces con agua desionizada (200 l cada vez).
  8. Deje que los pozos se secan durante 5 minutos a temperatura ambiente y se disuelven la mancha restanteen 96% de etanol o ácido acético 33%.
  9. Incubar durante 1 hora a RT y leer la absorbancia a 595 nm.

5. Evaluar el efecto bactericida sobre las bacterias planctónicas utilizando la placa misma muestra que para las biopelículas

  1. Medir la turbidez a 595 nm de la placa con la solución de 3,3 planctónicas.
  2. Teñir las bacterias planctónicas con resazurina mediante la adición de 10 l de la población de resazurina por pocillo. Mezclar bien con la pipeta.
  3. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 min, hasta que los controles no tratados son uniformemente de color rosa.
  4. Medir la fluorescencia a λ exc = 560 nm y λ em = 590 nm.

6. trigo aglutinina de germen de tinción para la matriz de cuantificación y la fluorescencia de imágenes de microscopía de biopelículas

  1. la cuantificación de la matriz
    1. Preparar una solución / ml 5 g de la sonda WGA en PBS estéril.
    2. Use un pla muestra paralelaET para esta tinción. Eliminar la solución de planctónicas de los pocillos y lavar una vez con PBS estéril (200 l por pocillo), utilizando una pipeta multicanal cuidadosamente sin tocar las biopelículas.
    3. Añadir 200 l de solución de WGA por pozo se manche.
    4. Incubar en la oscuridad a 4 ° C durante 2 horas.
    5. Retire el exceso de colorante lavando los pocillos con 200 l de PBS tres veces.
    6. Deje que la placa seca durante 15 minutos a temperatura ambiente.
    7. Disolver la mancha unido en ácido acético 33%, utilizando 200 l por pocillo.
    8. Sellar los pozos con tapas de tira y someter a ultrasonidos utilizando un aparato de ultrasonidos baño de agua durante 30 segundos a temperatura ambiente y 40 kHz.
    9. Incubar la placa durante 1 hora a RT.
    10. Repetir la etapa de sonicación. Los pozos pueden permanecer sellados entre las etapas de sonicación.
    11. Medir la fluorescencia a λ ex = 495 nm y λ em = 520 nm con un lector de placas (arriba a la lectura).
  2. La visualización de la matriz conmicroscopio fluorescente
    1. Utilizar el mismo protocolo que el anterior hasta el paso 6.1.6.
    2. Después de la etapa de secado, visualizar las muestras con un microscopio de fluorescencia, usando un filtro FITC (u otro filtro de excitación verde adecuado).

7. tinción de las células viables y muertas dentro de las biopelículas de Imagen con microscopía de fluorescencia y la cuantificación de la señal para la relación-verde-rojo-a (V / R)

  1. Imaging con microscopía de fluorescencia
    1. Se prepara una solución de cada sonda (células viables uno de tinción y las otras células muertas uno de tinción), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Eliminar la solución de planctónicas de los pocillos y lavar una vez con PBS estéril (200 l por pocillo) usando una pipeta multicanal.
    3. Añadir 6 l de la solución de tinción por pozo.
    4. Se incuba la placa en la oscuridad durante 15 min.
    5. Antes de la microscopia, retirar el exceso de líquido manualmente usando una pipeta multicanal.
    6. Capturar las imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia, utilizando, por ejemplo un filtro FITC (para fluorescencia verde, células viables) o un filtro TRITC (fluorescencia roja, las células muertas).
  2. La cuantificación de la señal como una proporción de verde a rojo en la fluorescencia (G / R)
    1. Seguir el mismo protocolo que en los pasos 7.1.1 y 7.1.2.
    2. Añadir 200 l de la solución de tinción por pozo y se incuba durante 15 min en la oscuridad.
    3. Medir la fluorescencia con un lector de placas a longitudes de onda / emisión de excitación 485/535 nm y 485/635 de la fluorescencia verde y roja, respectivamente (lectura superior).

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Resultados

En la plataforma propuesta, se cuantifican los efectos sobre la biomasa, y la matriz del biofilm viabilidad. En la secuencia de trabajo (Figura 1), una placa de la muestra se tiñe con resazurina y posteriormente con cristal violeta para evaluar simultáneamente los efectos sobre la viabilidad biofilm bacteriano y en la biomasa total biofilm. Ambos ensayos se pueden realizar de forma consecutiva en la misma placa, ya que se ha demostrado anteriormente que una primera tinci...

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Discusión

No hay ningún método único que puede medir simultáneamente el efecto de un compuesto sobre el, la biomasa, y la matriz de la biopelícula viabilidad. Por lo tanto, hay una necesidad de combinar los ensayos con el fin de detectar un efecto sobre los tres puntos finales, preferiblemente en una etapa de detección primaria.

La resazurina es un protocolo de tinción muy simple que consiste solamente en la adición de la sonda redox. Sin embargo, establecer el tiempo de incubación óptimo de los biofi...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

Los autores agradecen al profesor Paul Cos y LMPH, Universidad de Amberes, Bélgica, por su apoyo durante el proceso de filmación en su laboratorio. Este trabajo fue financiado por la Academia de Finlandia proyectos (proyectos 272266 y 282981) y Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finlandia. Las contribuciones técnicas de Maestría Janni Kujala son reconocidas.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ResazurinSigma AldrichR7017
Cristal violetaSigma Aldrich HT90132 
Aglutinina de germen de trigo, Alexa Fluor 488 ConjugadoThermo Fisher ScientificW11261
VIVO/MUERTO BacLight Sondas molecularesL7012SYTO 9 para la tinción de células viables Yoduro de verde y propidio para la tinción de células muertas
rojo Solución salina
Agar de soja triptonaLab M, NeogenLAB011
Caldo de soja de triptinaLab M, NeogenLAB004
F96 Placa de pocillo Poliestireno estéril Transparente Fondo planoThermo Fisher Scientific161093
Tapones a marca, tiras de 8Sigma AldrichBR781413-300EA
Thermo Fisher Scientific
Biomek 3000Beckman Coulter
Lector multiplaca Varioskan FlashThermo Fisher Scientific
Staphylococcus aureusATCC 25923
tamponada con fosfato Branson serie CPX baño ultrasónico Sigma Aldrich Z769428-1EA Multipipeta Thermo Fisher Scientific Dispensador multigota

Referencias

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