la muerte de las células β de los islotes precede al desarrollo de la diabetes tipo 1, y la detección de este proceso puede permitir una intervención terapéutica temprana. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de cómo medir las especies de ADN INS metiladas diferencialmente en suero humano como biomarcador de la muerte celular β.
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Artículo de método
Medición de diferencialmente metilado
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Resumen
Resumen
Se cree que la muerte de las células de los β de los islotes subyace a la patogénesis de prácticamente todas las formas de diabetes y precede al desarrollo de una hiperglucemia franca, especialmente en la diabetes tipo 1. El desarrollo de biomarcadores sensibles y fiables de la muerte celular β puede permitir una intervención terapéutica temprana para prevenir o retrasar el desarrollo de la diabetes. Recientemente, varios grupos, incluido el nuestro, han informado que el ADN libre de células y diferencialmente metilado que codifica preproinsulina (INS) en la circulación se correlaciona con la muerte de células β en la diabetes pretipo 1 y la diabetes tipo 1 de nueva aparición. Aquí, presentamos un protocolo paso a paso que utiliza PCR digital para la medición del ADN INS libre de células que se metila diferencialmente en la citosina en la posición -69 pb (en relación con el sitio de inicio transcripcional). Demostramos que el ensayo puede distinguir entre citosina metilada y no metilada en la posición -69 pb, es lineal en varios órdenes de magnitud, proporciona una cuantificación absoluta del número de copias de ADN y se puede aplicar a muestras de suero humano de individuos con diabetes tipo 1 de nueva aparición y controles libres de enfermedad. El protocolo descrito aquí se puede adaptar a cualquier especie de ADN para la que se desee la detección de citosinas metiladas diferencialmente, ya sea a partir de la circulación o de células y tejidos aislados, y puede proporcionar una cuantificación absoluta de fragmentos de ADN.
Introducción
La diabetes de tipo 1 (T1D) es una enfermedad autoinmune que se caracteriza por la destrucción de los islotes productoras de insulina por las células β células T autorreactivas 1. El diagnóstico de la diabetes tipo 1 se hace típicamente en la medición de (glucemia> 200 mg / dl) la hiperglucemia en un individuo joven magra, que podría presentar con cetoacidosis como evidencia de la deficiencia de insulina. En el momento del diagnóstico de T1D, hay evidencia de una pérdida sustancial de la función de células β y la masa (de 50 - 90%) 2. En estudios clínicos, varios fármacos moduladores inmunes que fueron instituidas en el momento del diagnóstico como resultado la estabilización de la función de las células β (y, presumiblemente, la masa), pero ninguno ha dado lugar a la remisión clínica de la enfermedad, un hallazgo que ha levantado la llamada para el desarrollo de biomarcadores para la detección precoz de la enfermedad y para el seguimiento longitudinal de la efectividad de las terapias de combinación 3,4. Los esfuerzos de los consorcios internacionales, como unaEs la Red de Investigación Consorcio de islotes humanos en los Institutos Nacionales de Heath 5, han hecho hincapié en la necesidad de desarrollar biomarcadores que se centran en el estrés celular β y la muerte en la DM1.
En línea con estos esfuerzos, nuestro grupo y otros han desarrollado recientemente ensayos de biomarcadores que miden la circulación, fragmentos de ADN epigenetically modificados que se derivan principalmente de las células que mueren beta 6 - 9. En todos los ensayos publicados hasta la fecha, la atención se ha centrado en la cuantificación del gen humano que codifica la preproinsulina (INS), lo que demuestra un mayor grado de sitios CpG no metilados en las regiones codificantes y promotores en comparación con otros tipos de células. La liberación de fragmentos de ADN INS no metilados se planteó la hipótesis de que surja principalmente de la muerte (necrosis, apoptosis) las células beta. Nuestros estudios recientes demostraron que en la juventud, las elevaciones en el ADN INS tanto metilado y no metilado en la posición -69 pb (con relación al tél inicio de la transcripción sitio) se observaron en nueva aparición de diabetes tipo 1, y juntos sirvió como biomarcadores específicos para esta población 6. Estos ensayos de biomarcadores implican el aislamiento de ADN libre de células a partir de suero o plasma usando kits comerciales de giro, seguido de una conversión de bisulfito del ADN aislado (para convertir las citosinas no metiladas a uracilos, dejando citosinas metiladas intacta).
En este informe, se describen los aspectos técnicos de la recogida de muestras de suero, el aislamiento de ADN libre de células a partir de suero, la conversión de bisulfito, y el rendimiento de la PCR digital de la gotita (en adelante, digital PCR) para el ADN metilado diferencialmente INS.
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Protocolo
Declaración de ética: Los protocolos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Indiana. Los padres de los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito, y los niños mayores de 7 años dieron su consentimiento para su participación.
1. Procesamiento del suero
NOTA: El ensayo descrito se ha probado rigurosamente utilizando suero humano aislado de la siguiente manera.
- Recoja la sangre en un tubo de extracción de sangre con tapa roja (sin aditivo; sin recubrimiento).
- Deje reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que se forme el coágulo.
- Tubo de centrífuga a 2.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Transfiera el sobrenadante (suero) a un nuevo tubo designado para el almacenamiento de suero (tubos de polipropileno con tapa de rosca, el tamaño depende de las muestras).
- Almacenar las muestras a -80 ºC hasta que estén listas para el aislamiento del ADN.
2. Extracción de ADN sérico
NOTA: El ADN se extrae con un kit de extracción de ADN utilizando 50 μl de suero (recomendado), siguiendo el protocolo del fabricante con algunas modificaciones.
- Prepare 200 μl de tampón de lisis + 1 μl de poli(A) (5 μg) por muestra en un tubo de microcentrífuga. Vórtice durante 15 s. Dejar a un lado hasta el paso 2.3.
- Extraer muestras de suero del congelador a -80 ºC y descongelar a temperatura ambiente. Aumentar el volumen de la muestra de suero hasta 200 μl en total utilizando solución salina tamponada con fosfato (PBS, con cloruro de calcio y cloruro de magnesio).
- Lisar la muestra añadiendo 20 μl de proteasa (1,4 unidades de Anson/ml) a la muestra, seguido de 200 μl de tampón de lisis/mezcla de poliA (del paso 2.2) y vórtice durante 8 segundos. Incubar la muestra a 56 °C durante 10 minutos, luego centrifugar brevemente durante 7 segundos a máxima velocidad en una microcentrífuga (>10.000 x g).
- Precipite el ADN añadiendo 230 μl de etanol al 100% a la muestra y al vórtice durante 8 segundos. Centrifugar brevemente durante 7 segundos a velocidad máxima (>10.000 x g).
- Aplique el ADN a la columna de centrifugado añadiendo una mezcla de muestra de 600 μl a la mini columna de centrifugación. Centrifugar a 6.000 x g durante 1 min. Deseche el flujo y coloque la columna en un tubo limpio.
- Lave el ADN añadiendo 500 μl de tampón de lavado 1 a la columna. Centrifugar a 6.000 x g durante 1 min. Deseche el flujo y coloque la columna en un tubo limpio. Añadir 500 μl de tampón de lavado 2 a la columna y centrifugar a máxima velocidad (>10.000 x g) durante 3 min. Coloque la columna en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y vuelva a centrifugar a máxima velocidad durante 1 min.
- Eluir el ADN colocando la columna en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadiendo 60 μl de tampón de elución directamente sobre el filtro. Es importante cambiar las puntas entre muestras para evitar la contaminación cruzada. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego centrifugar a 6.000 x g durante 1 minuto. Añadir otros 60 μl de tampón de elución y centrifugar a 6.000 x g durante 1 min.
- Almacene el ADN a -20 ºC para su uso posterior, o proceda inmediatamente a la conversión de bisulfito.
3. Conversión de bisulfito
NOTA: La conversión de bisulfito se realiza utilizando un kit de conversión de bisulfito, siguiendo el protocolo del fabricante con algunas modificaciones.
- Para convertir citosinas no metiladas en uracilos, agregue 130 μl de reactivo de conversión de bisulfito a 20 μl de ADN del paso 2.7 en un tubo de PCR (tubo de PCR de 0,2 ml o tubos de PCR de 8 tiras). Guarde los 40 μl restantes de ADN para su uso futuro o para utilizarlos en reacciones replicadas. Mezcle 20 veces pipeteando hacia arriba y hacia abajo y centrifugue brevemente para asegurarse de que no haya gotas en los lados o en la tapa. Incubar en un baño de agua o termociclador de la siguiente manera: 98 °C durante 8 min, 54 °C durante 60 min, 4 °C durante 5 min.
- Continúe con el paso 3.2 o almacene a 4 °C durante un máximo de 20 horas.
- Añada 600 μl de tampón aglutinante a la columna de centrifugado y colóquela en el tubo de recogida suministrado. Aplique el ADN bisulfitado a la columna y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Centrifugar a máxima velocidad (>10.000 x g) durante 30 seg. Deseche el flujo.
- Lave el ADN añadiendo 100 μl de tampón de lavado a la columna y centrifuga a máxima velocidad (>10.000 x g) durante 30 segundos.
- Realice la desulfonación para eliminar el grupo sulfonato y finalizar la conversión de citosinas no metiladas en uracilo agregando 200 μl de tampón de desulfonación a la columna. Deje reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos, luego centrifugue a velocidad máxima (>10,000 x g) durante 30 segundos.
- Lave el ADN añadiendo 200 μl de tampón de lavado a la columna y centrifuga a máxima velocidad durante 30 segundos. Deseche el flujo y repita este paso de lavado.
- Coloque la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Eluya el ADN añadiendo 10 μl de tampón de elución directamente al filtro de columna. Incubar durante 1 min. Centrífuga durante 30 s a toda velocidad para eluir el ADN. Cuantificar el ADN recuperado por espectrofotometría en A260.
NOTA: El ADN detectado por espectrofotometría representa principalmente el ADN poliA portador que se agregó en el paso 2.3 anterior. Normalmente, la recuperación de poliA es el ≥85% de la entrada (>4,25 μg). - Almacene el ADN a -20 °C hasta que esté listo para proceder con la PCR digital.
4. PCR digital multiplexada
- Hacer una mezcla maestra con suficiente solución para cada muestra y control. Incluya al menos una muestra que contenga agua (control negativo), una muestra de un plásmido que contenga INS no metilado (1 pg, control positivo), una muestra de plásmido que contenga INS metilado (1 pg, control positivo) y una muestra que contenga una mezcla 1:1 de plásmidos.
- Para preparar la mezcla maestra de PCR, agregue 12,5 μl por reacción de tampón de PCR (p. ej., 125 μl por 10 muestras), 1,25 μl por mezcla de cebador/sonda de reacción (p. ej., 12,5 μl por 10 muestras), 8,25 μl por agua de reacción (p. ej., 82,5 μl por 10 muestras), 0,5 μl por reacción de la enzima EcoR1 (p. ej., 5 μl por cada 10 muestras).
NOTA: Los cebadores y sondas utilizados aquí son los siguientes: Imprimación directa: 5'-GGAAATTGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGT-3'; Imprimación inversa: 5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3'; Sonda FAM: FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB; Sonda VIC: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.
- Para preparar la mezcla maestra de PCR, agregue 12,5 μl por reacción de tampón de PCR (p. ej., 125 μl por 10 muestras), 1,25 μl por mezcla de cebador/sonda de reacción (p. ej., 12,5 μl por 10 muestras), 8,25 μl por agua de reacción (p. ej., 82,5 μl por 10 muestras), 0,5 μl por reacción de la enzima EcoR1 (p. ej., 5 μl por cada 10 muestras).
- Configure la reacción de PCR multiplex en una placa de 96 pocillos. Agregue 19,5 μl de mezcla maestra a cada pocillo. Agregue 2,5 μl de muestra de ADN convertido en bisulfito en cada pocillo apropiado (guarde los 7,5 μl restantes de ADN convertido en bisulfito o utilícelos en reacciones replicadas). Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
NOTA: Los 8 pocillos seguidos deben contener control de muestra o tampón. - Selle con un sello de aluminio usando un sellador de placas y centrifugue en un centrifugador de placas hasta que no haya líquido en los lados de los pocillos.
- Configure el generador automático de gotas en la pantalla táctil.
NOTA: Los 8 pocillos del cartucho deben contener control de muestra o tampón.- Establezca el número de filas que se utilizan tocando las filas en las que se cargan las muestras en la placa de 96 pocillos del paso 4.2 y resalte la fila en azul para indicar una fila activa.
- Cargue los consumibles de atrás hacia adelante para evitar la contaminación. Para comenzar, agregue cartuchos a lo largo de la fila posterior del instrumento. Cargue las puntas en la fila central del instrumento.
NOTA: Los cartuchos solo pueden caber en los soportes en la orientación correcta. - Coloque la placa de 96 pocillos en el instrumento. Retire un bloque frío del congelador a -20 °C y coloque en él una nueva placa con faldón de 96 pocillos. Colóquelo dentro del instrumento junto a la placa de 96 pocillos cargada con muestra.
- Agregue aceite al dispensador en la parte delantera del instrumento. Seleccione el tipo de aceite en la pantalla táctil.
- Toque el botón azul de inicio para iniciar la carrera. Confirme la configuración de la placa y toque el botón de inicio de ejecución para comenzar.
- Una vez que haya terminado, retire la placa de 96 pocillos que contiene las gotas recién formadas y selle con un sello de aluminio con un sellador de placas.
- Realice PCR10 en un termociclador utilizando el siguiente programa: 95 °C durante 10:00 min; 40 ciclos a: 94 °C durante 00:30 min, 57,5 °C durante 01:00 min; 98 °C durante 10:00 min; 12 °C durante 10 min o hasta 24 h.
- Coloque la placa en el lector de gotas y configure el lector.
- Haga clic en la pestaña de configuración. Abra una nueva plantilla haciendo clic en plantilla > nueva. Introduzca un nombre de archivo.
- Utilice el editor de pocillos para establecer los parámetros de cada muestra. Asigne un nombre único a cada muestra, establezca el experimento en Detección de eventos raros (R-RED) y establezca la mezcla maestra en la mezcla utilizada en el paso 4.1.
- Asigne un nombre al objetivo 1 (es decir, sin metilar) y establezca el objetivo 1 como desconocido (U). Asigne un nombre al objetivo 2 (es decir, metilado) y establezca el objetivo 2 como referencia (R).
- Haga clic en la pestaña Ejecutar para iniciar la ejecución. En la ventana de opciones de ejecución, seleccione la química de detección (FAM/VIC).
5. Análisis de datos
- Abra los resultados en la pestaña Analizar y analice utilizando un gráfico 2D basado en controles positivos (consulte la Figura 1).
- Exporte el archivo CSV generado por el lector de gotas a un programa de hoja de cálculo para el análisis de datos.
- Para generar "copias por μl" de suero, use la fórmula: (concentración * 250) / (volumen de suero utilizado para el aislamiento de ADN en μl). 6
NOTA: Por lo general, los datos se convierten enlog 10 cuando se adquieren del suero humano para garantizar una distribución normal. Alternativamente, los datos pueden trazarse en una escala logarítmica10 y analizarse mediante estadísticas no paramétricas.
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Resultados
Para interpretar los datos de forma adecuada, utilizamos plásmido controles tanto para el ADN diana INS no metilado y no metilado en cada PCR plazo digital. Estos controles aseguran que las señales correspondientes a ADN metilado y no metilado son claramente distinguibles. La Figura 1 muestra los gráficos de dispersión 2-D correspondientes a las gotas para los controles de plásmido que contienen bisulfito convertido no metilada de ADN INS (Figur...
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Discusión
La metilación de las citosinas por metiltransferasas de ADN permite el control epigenético de la transcripción en muchos genes. El gen INS en los seres humanos se expresa casi exclusivamente en los islotes β células, y no parece haber una correlación entre la frecuencia de metilación de citosinas en el gen INS para silenciamiento de su transcripción 11. Como tal, la mayoría de tipos de células muestran frecuencias sustancialmente más altos de metilación del gen INS en varias citosin...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención UC4 de los Institutos Nacionales de Salud DK104166 (a RGM). Deseamos agradecer la asistencia del Centro de Traducción del Centro de Investigación de la Diabetes de Indiana, respaldado por la subvención P30 DK097512 de los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Vacutainer de tapa roja | Beckon Dickinson | 366441 | sin aditivo, interior sin recubrimiento, 10 ml |
| Tubo criovial | Simport | T310-3A | polipropileno, tubo con tapón de rosca, cualquier tamaño |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | desencantado en tampón TE (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) a 5 µ g/µ l |
| Etanol absoluto (200 pruebas) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (con CaCl2 y MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8-strip Tubos | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| control de tampón para sondas | Biorad | 1863052 | |
| mezcla de cebador/sonda humana no metilada/metilada | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 New | England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semifaldón | Eppendorf | 951020346 | |
| Sellado térmico de lámina perforable | Biorad | 1814040 | |
| PX1 Sellador de placas | PCR Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Sistema de PCR digital de gotas | AutoDG Biorad | 1864101 | |
| Generación automatizada de gotas Aceite para sondas | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartucho para generador de gotas automatizado | Biorad | 186-4108 | |
| Puntas de pipeta para generador de gotas automatizado | Biorad | 186-4120 | |
| Contenedores de puntas de pipeta para generador de gotas automatizado | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Termociclador | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Lector de gotas Biorad | 186-4003 | ||
| ddPCR Aceite Lector de gotas | Biorad | 186-3004 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
