Medición de diferencialmente metilado<em&gt; INS</em&gt; Especies de ADN en muestras de suero humano como un biomarcador de la muerte celular de islotes β

Sarah A Tersey; Jennifer B Nelson; Marisa M Fisher; Raghavendra G Mirmira

doi:10.3791/54838

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Artículo de método

Medición de diferencialmente metilado

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DOI:

10.3791/54838

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21 de diciembre de 2016

Sarah A Tersey¹ , Jennifer B Nelson¹ , Marisa M Fisher² , Raghavendra G Mirmira¹^,³^,⁴

¹Department of Pediatrics, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, ²Department of Pediartics, Omaha Children's Hospital and Medical Center, University of Nebraska Medical Center, ³Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Medicine, and Cellular and Integrative Physiology, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, ⁴Indiana Biosciences Research Institute

En este artículo

Resumen

la muerte de las células β de los islotes precede al desarrollo de la diabetes tipo 1, y la detección de este proceso puede permitir una intervención terapéutica temprana. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de cómo medir las especies de ADN INS metiladas diferencialmente en suero humano como biomarcador de la muerte celular β.

Resumen

Se cree que la muerte de las células de los β de los islotes subyace a la patogénesis de prácticamente todas las formas de diabetes y precede al desarrollo de una hiperglucemia franca, especialmente en la diabetes tipo 1. El desarrollo de biomarcadores sensibles y fiables de la muerte celular β puede permitir una intervención terapéutica temprana para prevenir o retrasar el desarrollo de la diabetes. Recientemente, varios grupos, incluido el nuestro, han informado que el ADN libre de células y diferencialmente metilado que codifica preproinsulina (INS) en la circulación se correlaciona con la muerte de células β en la diabetes pretipo 1 y la diabetes tipo 1 de nueva aparición. Aquí, presentamos un protocolo paso a paso que utiliza PCR digital para la medición del ADN INS libre de células que se metila diferencialmente en la citosina en la posición -69 pb (en relación con el sitio de inicio transcripcional). Demostramos que el ensayo puede distinguir entre citosina metilada y no metilada en la posición -69 pb, es lineal en varios órdenes de magnitud, proporciona una cuantificación absoluta del número de copias de ADN y se puede aplicar a muestras de suero humano de individuos con diabetes tipo 1 de nueva aparición y controles libres de enfermedad. El protocolo descrito aquí se puede adaptar a cualquier especie de ADN para la que se desee la detección de citosinas metiladas diferencialmente, ya sea a partir de la circulación o de células y tejidos aislados, y puede proporcionar una cuantificación absoluta de fragmentos de ADN.

Introducción

La diabetes de tipo 1 (T1D) es una enfermedad autoinmune que se caracteriza por la destrucción de los islotes productoras de insulina por las células β células T autorreactivas ^1. El diagnóstico de la diabetes tipo 1 se hace típicamente en la medición de (glucemia> 200 mg / dl) la hiperglucemia en un individuo joven magra, que podría presentar con cetoacidosis como evidencia de la deficiencia de insulina. En el momento del diagnóstico de T1D, hay evidencia de una pérdida sustancial de la función de células β y la masa (de 50 - 90%) ^2. En estudios clínicos, varios fármacos moduladores inmunes que fueron instituidas en el momento del diagnóstico c....