De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica

Resumen

Se desarrolló un ensayo en tiempo real de alto rendimiento para identificar simultáneamente (1) antimicrobianos penetrantes en células eucariotas dirigidos a un patógeno bacteriano intracelular, y (2) evaluar la citotoxicidad de las células eucariotas. Posteriormente, se combinó una variación de la misma tecnología con la tecnología de dispensación digital para permitir estudios fáciles, de alta resolución, de dosis-respuesta y de sinergia bidimensional y tridimensional.

Resumen

Las medidas tradicionales de actividad antimicrobiana intracelular y la citotoxicidad de las células eucariotas se basan en ensayos de punto final. Dichos ensayos de punto final requieren varios pasos experimentales adicionales antes de lectura de salida, tales como la lisis celular, la determinación de unidades formadoras de colonias, o la adición del reactivo. Al realizar miles de ensayos, por ejemplo, durante el cribado de alto rendimiento, el esfuerzo aguas abajo requerida para este tipo de ensayos es considerable. Por lo tanto, para facilitar el descubrimiento antimicrobiano de alto rendimiento, hemos desarrollado un ensayo en tiempo real para identificar simultáneamente inhibidores de crecimiento bacteriano intracelular y evaluar la citotoxicidad de células eucariotas. En concreto, la detección de crecimiento bacteriano intracelular en tiempo real se ha habilitado mediante el marcado de las cepas bacterianas de cribado, ya sea con un operón lux bacteriana (1 ^st generación de ensayo) o reporteros de proteínas fluorescentes ^(2ª generación, ensayo ortogonal). A, célula membrana impermeable, tinte de unión a ácido nucleico no tóxicotambién se añadió durante la infección inicial de los macrófagos. Estos colorantes se excluyen de las células viables. Sin embargo, las células huésped no viables pierden integridad de la membrana que permite la entrada y etiquetado fluorescente de ADN nuclear (ácido desoxirribonucleico). En particular, el ADN de unión se asocia con un gran aumento en el rendimiento cuántico fluorescente que proporciona una lectura basada en la solución de la muerte de la célula huésped. Hemos utilizado este ensayo combinado para llevar a cabo una pantalla de alto rendimiento en formato de microplacas, y para evaluar el crecimiento intracelular y la citotoxicidad por microscopía. En particular, los agentes antimicrobianos pueden demostrar la sinergia en el que el efecto combinado de dos o más agentes antimicrobianos cuando se aplica juntos es mayor que cuando se aplica por separado. Las pruebas de sinergia in vitro frente a patógenos intracelulares es normalmente una tarea prodigiosa como permutaciones combinatorias de antibióticos en diferentes concentraciones deben ser evaluados. Sin embargo, encontramos que nuestro ensayo en tiempo real combinado con automatizado, dispensación tecnología digital permitted pruebas de sinergia fácil. El uso de estos enfoques, hemos sido capaces de examinar sistemáticamente la acción de un gran número de antimicrobianos solos y en combinación contra el patógeno intracelular, Legionella pneumophila.

Introducción

Los patógenos que crecen o residen temporalmente en compartimentos intracelulares son difíciles de erradicar terapéuticamente. Obligar o relativamente obligar a patógenos intracelulares tales como Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis, y Mycobacterium spp. a menudo requieren ciclos de terapia antimicrobiana prolongada para la curación que puede variar de meses a incluso años. Además, los patógenos extracelulares pueden ocupar transitoriamente nichos intracelulares y de este modo escapar un despeje de cursos normales de terapia antimicrobiana y más tarde emerger para iniciar nuevas rondas de infección virulenta. Staphylococcus aureus ¹ y enterobacterias ^2,3 infecciones uropatogénicas son dos ejemplos cada vez más reconocidos. Por lo tanto, un objetivo fundamental el descubrimiento de fármacos es la identificación de nuevos agentes antimicrobianos que penetran en compartimentos intracelulares. El tratamiento óptimo para erradicar rápidamenteorganismos intracelulares y prevenir el desarrollo de resistencia a los antimicrobianos mediante la exposición sub-inhibidor es especialmente deseable.

Con este fin, hemos desarrollado una tecnología de selección de alto rendimiento para identificar agentes antimicrobianos intracelulares-penetrante de orientación el crecimiento intracelular del patógeno modelo, Legionella pneumophila. ⁴ observaciones clínicas anteriores indican que las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos estándar no predice con precisión in vivo la eficacia terapéutica contra este organismo. ⁵ En concreto, esto se debía a que las principales clases de antimicrobianos tales como beta-lactámicos y aminoglucósidos, aunque muy eficaz contra la Legionella axenically crecido, no tienen suficientemente penetran en los compartimentos intracelulares donde reside la Legionella. ^5,6 tarde, las pruebas sugiere que los ensayos de crecimiento intracelular técnicamente más complejas predijeron con eficacia la eficacia clínica. ⁷ Por desgracia, estos ensayos fueron variables ensayos extremadamente laborioso ya que los macrófagos infectados, tratados con antimicrobianos, que se sometieron a lisis en diferentes puntos Tiempos de unidades formadoras de colonias enumeración. Dichos ensayos son poco prácticos para hacerlo a gran escala y no son adecuados para el descubrimiento de fármacos de alto rendimiento.

Por lo tanto, hemos desarrollado la tecnología para la determinación en tiempo real de crecimiento bacteriano intracelular. ⁶ Esto se logró mediante el uso de una cepa bacteriana modificada a través de la integración de cualquiera de un bacteriana luciferasa operón ⁸ (ensayo de primera generación, que se describe anteriormente) ⁴ o fluorescente proteína ⁹ reporteros (segunda generación, de ensayo ortogonal, que se describe aquí) en el cromosoma bacteriano. De esta manera, luminiscente o señal fluorescente proporciona un sustituto, la lectura en tiempo real del número de bacterias.

Sin embargo, estos atributos no se refieren a un factor de confusión importante en INFECTIO intracelularn ensayos, fuera de objetivo efectos en las células huésped. En particular, la muerte de la célula huésped inherentemente limita el crecimiento intracelular y conduce a la identificación de falsos positivos del efecto antimicrobiano. Como muchos de los compuestos en las bibliotecas de cribado son células eucariotas tóxicos, tales falsos positivos abrumarían verdaderos agentes antimicrobianos, lo que exige un gran número de seguimiento, los ensayos de citotoxicidad punto final para la resolución.

Por lo tanto, era de gran interés para poder evaluar la viabilidad celular eucariota y el crecimiento intracelular de forma simultánea. En particular, una característica de las células eucariotas no viables es la pérdida de integridad de la membrana celular. Por lo tanto, las sondas que ponen a prueba la permeabilidad de la membrana de la célula se pueden usar para evaluar la viabilidad celular. Hemos caracterizado previamente la capacidad de una serie de células putativamente membrana no permeables, colorantes fluorescentes, unión al ADN para acceder y manchar el ADN nuclear de células muertas. ⁴ en el ADN nuclear de unión, estos tintes muestran un gran aumento en quantum rendimiento fluorescente resulta en una mayor señal a través de fluorescencia de la solución de fondo. Como tal, estos colorantes proporcionan una lectura cuantitativa de la muerte celular eucariota. ⁴ En particular, se encontró que varios eran ellos mismos no tóxico durante prolongado co-incubación con macrófagos J774. Cuando se añade durante la infección inicial, proporcionaron un tiempo real, la lectura fluorescente de la muerte celular eucariota que se puede medir por un fluorímetro de microplaca o observó microscópicamente.

Por lo tanto, mediante la combinación de uso de un reportero bacteriana y no tóxico, la membrana impermeable, colorantes de unión al ADN, que fueron capaces de desarrollar un método no destructivo, el ensayo simple, en tiempo real para medir tanto la carga bacteriana y la citotoxicidad de células eucariotas simultáneamente. Este ensayo ha permitido a la pantalla en 384 pocillos formato de placa de ~ 10.000 bioactivos conocidos incluyendo ~ 250 antimicrobianos y> 240.000 pequeñas moléculas con actividad funcionalmente no caracterizado por la capacidad de inhibir el crecimiento intracelular deLegionella pneumophila, mientras que al mismo tiempo la generación de datos de citotoxicidad de células eucariotas para cada compuesto. ⁶ Nuestro análisis de los antimicrobianos conocidos contra el crecimiento intracelular de Legionella fue la exploración más completa de este tipo hasta la fecha. ⁶

En base a la eficacia de nuestro formato de ensayo, también posteriormente explorado los efectos potencialmente sinérgicas de agentes antimicrobianos conocidos cuando se usan en combinación. Una de las pruebas de sinergia más comunes, el llamado ensayo de tablero de ajedrez, se realiza de manera estándar mediante la evaluación de los efectos combinatorios de diluciones en serie de dos veces de dos o más agentes antimicrobianos. ¹⁰ En estos ensayos, la sinergia se define por la observación de mayor efecto cuando dos o más agentes antimicrobianos se aplican conjuntamente que la suma de los efectos de cada aplicados por separado. Es de destacar que, hasta ahora, sólo se centra y pruebas de sinergia selectiva se llevó a cabo en contra intracelular de Legionella pneumophila debido a la gran esfuerzo involucrado en ensayos de punto final tradicional multiplicada por las permutaciones necesarias combinatorias.

Para facilitar las pruebas de sinergia, hicimos uso de nuestro ensayo de citotoxicidad en tiempo real de crecimiento intracelular / eucariota en combinación con la tecnología digital de dispensación automatizada ^6. Esta automatización nos permitió prescindir de diluciones en serie de compuestos disueltos en DMSO o solución acuosa solo o en combinación en formato de 384 pocillos. ¹¹ Por otra parte, tales robusta tecnología de tratamiento de líquidos nos permitió realizar fácilmente una resolución más alta, la raíz cuadrada de dos niños (en lugar de la norma, de menor resolución, doblando) combinaciones de dilución para alcanzar mayores niveles de especificidad en nuestro bidimensional, la sinergia de tablero de ajedrez análisis. Esta resolución fue especialmente valiosa para abordar las preocupaciones en materia sinergia sobre la reproducibilidad cuando se utiliza una doble serie de dilución ^12. Por último, nuestro ensayo fue cuantitativa y también Therntes de gradaciones de inhibición medido. Como resultado, el ensayo capturó la totalidad de la información inhibitorio, expresable en isocontorno isobologramas en el que isocontours conectar concentraciones combinatorias con niveles similares de inhibición del crecimiento. ⁶ Esta estrategia trazado permitió la visualización de las curvas de dosis-respuesta combinatorias. Para ilustrar nuestra metodología, describimos nuestro protocolo para la realización de estos ensayos y mostrar los resultados representativos.

Protocolo

El crecimiento intracelular 1. Tiempo Real y la célula eucariótica Ensayo de citotoxicidad

1. Preparación de células huésped (células J774A.1)
   1. Células como los macrófagos-Cultura J774A.1 Mus musculus en suspensión en RPMI 1640 con suero de ternera suplementado con hierro 9%. Inicialmente pasaje en matraces de cultivo tisular. Después las células se han vuelto confluente en un 75 cm matraz de cultivo de ² tejido en 15 ml de medio, dividido por raspado y la dilución a 65 ml con el mismo tipo de medio, de los cuales 15 ml se devuelve al matraz de cultivo de tejidos y 50 ml se transfiere a un matraz de 250 ml agitador bacteriano.
   2. Para ampliación, la cultura en suspensión en 250 ml y / o 1.000 frascos llenos de bacterias ml de una quinta parte del volumen con medio de cultivo de tejidos. Airear ajustando la velocidad de rotación en aproximadamente 120 revoluciones por minuto. Para un crecimiento constante, se incuba a exactamente 5% de _CO2 y 37 ° C.
   3. Las células se cosechan cuando alcanzan densidad en el intervalo de 2,5 x 10 ⁶ células/ ml a 5 x 10 ⁶ células / ml. Garantizar porcentaje de células muertas (lo más fácilmente posible ensayó por tinción con azul tripán) no exceda del 25%, ya que las células muertas se incrementará el ruido de fondo en los ensayos de citotoxicidad.
   4. Placa de blanco, cultivo de tejidos tratados, de 384 pocillos microplacas a 5 x 10 ⁴ células J774A.1 en 30 l de medio de cultivo de tejidos por pocillo. Incubar las microplacas durante la noche para conseguir el 90% de confluencia en el día de experimento.
2. Preparación luminiscente o fluorescente Legionella pneumophila
   1. Pasaje L. pneumophila (LP02 :: :: lux flaA ⁸⁾ bacterias en un medio apropiado, es decir, tamponada extracto de levadura carbón (BYCE) medio. Si se utiliza una cepa auxotrófico timidina, suplemento de medio con 100 g de timidina / ml. Preparar parches de bacterias para los experimentos de propagación de organismos densamente en una nueva placa BCYE e incubando un día (si de una anterior pasaje placa) o de dos a tres días (si desde el almacén congelado) para obtener confluentecrecimiento.
      1. Preparar placas BCYE disolviendo 10 g de extracto de levadura, 10 g de N - (2-acetamido) -2-aminoetanosulfónico, 0,35 g K ₂ HPO _4, y 1 g de potasio monobásico α-cetoglutarato en 950 ml de agua desionizada. Ajustar a pH 6,9 con hidróxido de potasio (≥2.5 ml de solución molar 11,9).
      2. Añadir 15 g de agar y 2 g de carbón activado; y llevar a 1 l de volumen final. Añadir una barra de agitación magnética y autoclave. medio Enfriar a 55 ° C y añadir soluciones de filtro esterilizado que contienen 0,4 g de hierro 0,42 g de amonio (III) citrato de L-cisteína y se disolvió en agua desionizada. Utilice placa de agitación imán para mezclar antes de verter las placas de Petri.
      3. Para el ensayo de crecimiento de L. pneumophila en medio de cultivo axénicos, preparar caldo de extracto de levadura-ACES (AYE) mediante la combinación de todos los reactivos químicos utilizados para BYCE excepto el carbón vegetal y el agar. Filtro de esterilizar y utilizar inmediatamente o congelar para experimentos posteriores.
   2. Volver a suspender los organismos de la same medio de cultivo tisular utilizado para las células J774A.1 con 100 mg / ml de suplementos de timidina, según proceda.
3. La infección de los macrófagos
   1. Añadir los compuestos de ensayo de interés (compuestos de detección, y controles positivos y negativos para la inhibición del crecimiento bacteriano y la lisis de células eucariotas). Preferiblemente, se disuelven soluciones madre en ≥500x en DMSO (dimetil sulfóxido) o una solución acuosa para permitir la dilución suficiente de vehículo.
      1. Aunque las soluciones madre se pueden almacenar congeladas, evitar los ciclos de congelación-descongelación para compuestos lábiles y antimicrobianos.
   2. Diluir bacterias luminiscentes para apuntar de 2,5 x 10 ⁶ CFU (unidad formadora de colonias) / m y bacterias marcado con indicador fluorescente para 1,0 x 10 ⁷ UFC / ml en medio de cultivo de tejido y añadir no tóxico, la membrana impermeable a ácido nucleico apropiada colorante de unión a 2.5x concentración de ensayo final.
   3. Añadir 20 l de mezcla a cada cultura J774A.1 así, el volumen de ensayo final50 l, concentración bacteriana final de 1 x 10 ⁶ UFC / ml (reportero lux operón) o 4 x 10 10 ⁶ UFC / ml (proteína fluorescente reportero).
   4. Incubar a 37 ° C durante 1-3 días en 5% de _CO2 a 100% de humedad relativa para evitar efectos de borde de evaporación.
4. ensayo de lectura
   1. Leer el crecimiento bacteriano y la toxicidad de células eucariotas en un luminómetro de microplacas y fluorímetro según sea apropiado para la prensa que se utiliza.
      1. Para evitar efectos de borde de la temperatura asociada, equilibre térmicamente microplacas antes de la lectura de luminiscencia por la colocación en una sola capa sobre un banco de laboratorio con tapa entreabierta durante aproximadamente 20 min (o en una cabina de seguridad biológica con tapas de aproximadamente 10 min).
   2. Microplacas volver a la incubadora, si se desea lectura en tiempo real en momentos posteriores.

Análisis 2. Datos

1. Normalizar los datos a con positivo y negativocontroles para calcular el porcentaje de inhibición o plegable para el crecimiento bacteriano intracelular y el porcentaje de citotoxicidad para las células eucariotas.
2. Para evaluar la robustez del ensayo, calcular la separación estadística entre los controles positivos y negativos tanto para la inhibición del crecimiento bacteriano y la citotoxicidad utilizando Z-factor "análisis donde Z (Z) '= 1-3 (σ _p + σ _n) / | mu _p + mu _n |. En esta ecuación, σ _p y σ _n son las desviaciones estándar para los pocillos de control positivos y negativos, respectivamente; μ _p y mu _n son los valores medios de los pocillos de control positivos y negativos, respectivamente.
   1. Para los ensayos de selección de alto rendimiento, el cálculo de las puntuaciones z estándar (o otra alternativa, las medidas estadísticas cuantitativos) para evaluar los efectos de los compuestos de ensayo de interés. Alternativamente, el cálculo de un simple pliegue de reducción o reducción veces log como potencialmente fisiológicamente más relevante medida de la magnitud del efecto para las bacterias geométricamente replicantes.

3. multi-dimensional (es decir, Synergy) dosis-respuesta Interpretación individual y pruebas y Datos

1. Preparar los macrófagos y las bacterias como se describe en el apartado 1 del protocolo.
2. Justo antes de la infección o la incubación axénicos, añadir antimicrobianos de interés experimental en una serie, duplicando serie de dilución, con el objetivo de spanning en el extremo superior una concentración que elimina completamente el crecimiento (es decir, la concentración inhibitoria mínima o MIC) y en la baja poner fin a una concentración que no muestra actividad obvia.
3. Utilizar un sistema de manipulación de líquidos automatizado para facilitar sola dosis-respuesta y la configuración de las pruebas de sinergia combinatoria a través de la adición directa y automatizada de diluciones antimicrobiana de acuerdo con el protocolo del fabricante.
4. Considerar el uso de diluciones sub-duplicar, por ejemplo,841 / 54841eq1.jpg "/> - doblar serie de dilución, y el ensayo se replica para aumentar la precisión y la reproducibilidad de los datos.
5. Para la infección de macrófagos, diluir las bacterias luminiscentes a diana de 2,5 x 10 ⁶ CFU (unidad formadora de colonias) / ml en medio de cultivo tisular. Añadir 20 l de mezcla a cada cultura J774A.1 así, el volumen de ensayo final de 50 l, concentración bacteriana final de 1 x 10 ⁶ UFC / ml; y se incuba a 37 ° C en 5% de _CO2 a 100% de humedad relativa.
   1. Para el ensayo de crecimiento axénicos, diluir las bacterias luminiscentes a la concentración final de 1 x 10 ⁶ UFC / ml en medio de AYE, añadir 50 l a cada pocillo de una placa de 384 pocillos y se incuba a 37 ° C en 5% de CO ₂ a 100% de humedad relativa.
6. Calcular el índice de concentración de inhibidor fraccional para las combinaciones antimicrobianas que inhiben el crecimiento bacteriano. Para cada fármaco en la combinación (a, b,.. N) que resulta en la inhibición completa o> 99% de g bacterianarecimiento, calcular la concentración inhibitoria fraccional individuo (FIC _{a, b, n...)} como sigue: FIC _a = la concentración de compuesto "a" dividido por la concentración de inhibidor mínima de "a" por sí mismo. _. Utilizando la misma fórmula, el cálculo de FIC _b, etc A continuación, calcular el índice FIC o combinatoria FIC FIC = _a + _b + FIC. . .FIC _N para cada combinación inhibidora.
   1. Utilice el índice combinatorio que se desvía más lejos de 1,0 para evaluar la sinergia. Considere un punto de corte de ≤0.5 como indicación conservadora de un efecto sinérgico y ≥4, un efecto antagonista. ¹²
   2. Parcela isobologramas, isocontorno isobologramas, y / o isosuperficie isobologramas ⁶ representaciones gráficas como alternativas de efectos combinatorios.

Resultados

ensayo de crecimiento intracelular de microplacas

Figura 1 Diagrama de las etapas del ensayo. Los pasos automatizados que se muestran se pueden realizar manualmente. Sin embargo, el rendimiento se facilita en gran medida el uso de sistemas de manejo de líquidos.

La Figura 2 muestra los resultados representativos de una microplaca de...

Discusión

Describimos ensayos en tiempo real para la detección simultánea del crecimiento bacteriano intracelular y la citotoxicidad de la célula huésped. Hay varios pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, para robusto rendimiento del ensayo, debe haber suficiente separación espectral entre lecturas bacterianas y de citotoxicidad. Tal separación es intrínseco para las combinaciones de los reporteros operón luciferasa y tintes fluorescentes de unión al ADN. Sin embargo, basándonos en nuestra experiencia (Tabla 1-3...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Células J774A.1 Colección	cultivos tipo americano	TIB-67	Célula huésped
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	Para hacer agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio de extracto de levadura tamponado
Extracto de levadura, ultrafiltrado	Becton-Dickinson/Difco	210929	Para la fabricación de agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio de extracto de levadura tamponado; los grados más bajos pueden causar un crecimiento deteriorado y/o alterar la sensibilidad de Legionella a los inhibidores del crecimiento
Ácido alfa-cetoglutárico, sal monopotásica	Sigma-Aldrich	K2000	Para la fabricación de agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio de extracto de levadura tamponado
Piruvato de sodio	Sigma-Aldrich	P5280	Para la fabricación de agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio de extracto de levadura tamponado
Fosfato de potasio, dibásico	Thermo Fisher Scientific	P288-500	Para la fabricación de agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio de extracto de levadura tamponada
L-cisteína	Sigma-Aldrich	C-7755	Para hacer agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio
de extracto de levadura tamponadoCitrato de hierro y amonio (III)	Sigma-Aldrich	F5879	Para hacer agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio de extracto de levadura tamponado; En su lugar, se puede usar pirofosfato férrico, pero es más difícil de pesar con precisión
Solución de hidróxido de potasio, concentrada	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	Para hacer agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio de extracto de levadura tamponado
Agua deonizada	N/A	N/A	Para hacer agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio de extracto de levadura tamponado
Timidina (grado de cultivo de tejidos)	Sigma-Aldrich	T1895	Para complementar tanto RPMI 1640 como extracto de levadura tamponado agar/medio — se puede usar timidina de grado inferior para este último, pero puede causar deterioro del crecimiento celular y/o muerte celular en RPMI 1640
RPMI 1640, formulación estándar	Corning a través de Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	Para el crecimiento de células J774A.1 antes de la siembra; incluye 2 mM de L-glutamina
RPMI 1640 sin rojo fenol	Corning a través de Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	Para la siembra de células J774A.1 en placas de 384 pocillos (no apto para el crecimiento antes de la siembra); también carece de L-glutamina y mdash; suplemento a 2 mM antes de usar
L-glutamina, 200 mM en NaCl al 0,85% (grado de cultivo de tejidos)	HyClone a través de Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	Para suplementar RPMI 1640 sin L-glutamina, hasta 2 mM de concentración final
Suero de ternera suplementado con hierro	Gemini Bioproducts	100-510	Para suplementar RPMI 1640, hasta una concentración final del 9,1%
Solución de azul de tripano	Sigma-Aldrich	T8154	Para la tinción para J774A.1 Determinación de la muerte celular mientras se cuenta la densidad celular
SYTOX Green, solución de 5 mM en DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	Para la tinción para la determinación de la muerte celular J774A.1 mediante lectura de fluorescencia o microscopía de epifluorescencia (junto con bacterias fluorescentes de color rojo anaranjado o rojo lejano). Utilizar a una concentración final de 125 nM.
Incubadora de cultivos celulares	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	Para la incubación de células J774A.1 (tanto antes como después de la infección); también se puede utilizar para la incubación de bacterias, o se puede utilizar una incubadora de atmósfera estándar en su lugar)
Agitador orbital	BellCo Glass	7744-01010	Para agitar la incubación de células J774A.1 antes de la infección; cabe dentro de la incubadora de cultivos celulares; incluye la base del agitador 7744-01000 y la bandeja 7740-01010 (también están disponibles por separado)
Matraces agitadores (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	Para la incubación por agitación de las células J774A.1 antes de la infección
Pinzas agitadoras para matraces (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	Para la incubación por agitación de las células J774A.1 antes de la infección
Matraces agitadores (1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	Para la incubación por agitación de las células J774A.1 antes de la infección
Pinzas agitadoras para matraces (1.000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	Para la incubación por agitación de las células J774A.1 antes de la infección
Tapones de espuma esponjosa para matraces (250 ml-1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	Para la incubación por agitación de células J774A.1 antes de la infección; reduce el riesgo de contaminación en relación con las tapas metálicas estándar
Bomba peristáltica multicanal programable MultiDrop Combi	Thermo Fisher Scientific	5840300	Para la dispensación de células J774A.1, medio y suspensión bacteriana que contiene fluoróforos a un gran número de placas de 384 pocillos
Colector de diámetro estándar Combi	Thermo Fisher Scientific	24072670	Volumen de predispensación predeterminado de 20 μ l es insuficiente para compensar el asentamiento — aumentar a 80 μ l
Platos blancos de 384 pocillos tratados para el cultivo de tejidos	Corning	3570	Para la lectura de luminiscencia y fluorescencia; Catálogo Greiner # 781080 también probado con éxito
DMSO (grado de cultivo de tejidos, en ampollas selladas)	Sigma-Aldrich	D2650	Para disolver compuestos de control positivo y prueba
Azitromicina	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibiótico control positivo
Saponina (de corteza de Quillaja)	Sigma-Aldrich	S-4521	Citoxicidad control positivo
Pipeta	multicanalThermo Fisher Scientific	Finnpipeta	Para la transferencia de cantidades fijas de compuestos de control positivo; la pipeta debe tener dispensación digital con retenes para permitir la dispensación repetitiva de volumen fijo
Robot de transferencia de pines Epson	Epson/ICCB-L	(Equipo personalizado)	Para la transferencia de cantidades fijas de compuestos de prueba desde matrices de bibliotecas
Sistema de dosificación digital D300	Hewlett-Packard a través de Tecan	D300	Para la transferencia de cantidades variables de compuestos de prueba que van desde 11 picolitros hasta 10 y micro; l
Cartuchos T8 + para el sistema de dispensación digital D300	Hewlett-Packard a través de Tecan	T8 +	Para dispensar compuestos de prueba
Microscopio de epifluorescencia con cámara digital conectada	a computadora Nikon	Ti	Para la obtención de imágenes de células vivas; cualquier microscopio fluorescente estándar puede sustituir, con contraste de fase u óptica DIC, capaz de obtener imágenes de fluorescencia verde (fluoresceína), rojo anaranjado a rojo (rojo Texas) y rojo lejano (Cy5), con aceite 100X objetivo para la más alta resolución
Placas de cultivo de tejidos con fondo de vidrio	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	Para la obtención de imágenes de células vivas. Antenas como la MatTek permiten la visualización microscópica con un aumento de 600X o 1.000X mediante el uso de un microscopio epifluorescente o confocal invertido. Estos platos específicos tienen un diámetro nominal de 3,5 cm, un diámetro interior de 3,3 cm, con cubreobjetos de 20 mm de diámetro #1,5 de espesor insertados en los fondos.
Photoshop CS6	Adobe		Photoshop o programas similares se pueden utilizar para pseudocolorear y fusionar imágenes ligeras, microscópicas y fluorescentes.
Mathematica 10	Wolfam		Para la generación de isobologramas de isocontorno bidimensionales e isobologramas de superficie tridimensionales.