La observación y cuantificación de la conducta de apareamiento en el nematodo del pino, Bursaphelenchus xylophilus

Summary

Se presenta un protocolo para investigar el comportamiento de apareamiento del nematodo del pino, Bursaphelenchus xylophilus. Las características de comportamiento de B. xylophilus se describen en el proceso de apareamiento.

Abstract

Un método para observar y cuantificar el comportamiento de apareamiento del nematodo del pino, Bursaphelenchus xylophilus, se estableció bajo un microscopio estereoscópico. Para mejorar la eficiencia de acoplamiento de B. Xylophilus y para aumentar las posibilidades de observación de apareamiento, los adultos vírgenes se cultivaron y se utilizan para la investigación. Los huevos se obtuvieron manteniendo los nematodos en agua y permitiendo que las hembras ponen huevos para 10 min. Los juveniles de segunda etapa (J2) se sincronizaron mediante la incubación de los huevos durante 24 horas a 25 ° C en la oscuridad, y la temprana J4 se obtuvieron por cultivo de la J2 con el moho gris, Botrytis cinerea, por otra 52 h. En ese momento, la mayoría de los nematodos J4 podían distinguirse claramente como ser hombre o mujer usando su morfología genital. La hembra J4 macho y se recogieron y se cultivaron por separado en dos placas de Petri diferentes para 24 h para obtener nematodos adultos vírgenes. Un macho y una hembra virgen virgen fueron emparejados en una gota de water en el pozo de una diapositiva cóncava. El comportamiento de apareamiento fue filmado con un grabador de vídeo bajo un microscopio estereoscópico. todo el período del proceso de apareamiento fue del 82,8 ± 3,91 min (media ± DE) y se puede dividir en 4 fases distintas: la búsqueda, contacto, copulando, y persistentes. La media de minutos de duración fueron 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 y 7,2 ± 0,5, respectivamente. Se describen once sub-comportamientos: crucero, se acerca, el encuentro, tocando, zunchado, la localización, adjuntando, eyacular, la separación, la quietud, y la itinerancia. Curiosamente, se observó obvia la competencia intra-sexual cuando una mujer se agrupó con 3 machos o un macho con 3 hembras. Este protocolo es útil y valiosa, no sólo en la investigación del comportamiento de apareamiento de B. xylophilus, sino también en que actúa como referencia para los estudios etológicos de otros nematodos.

Introduction

El nematodo del pino, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner y Buhrer) Nickle, es una de las especies invasoras más destructivas, causando el marchitamiento y finalmente la muerte de los pinos. Se cree que este nematodo patógeno es originario de los EE. UU., pero fue transportado a varios países, incluidos China, Japón, Corea del Sur y Portugal. Recientemente, también se ha reportado en España, matando millones de pinos con enormes pérdidas económicas y amenazando la producción forestal y la estabilidad ecológica^1-5.

Una vez que un pino huésped es infectado por nematodos del pino, miles de millones de descendientes se propagan rápidamente dentro del tronco. Esto causa disfunción del xilema, lo que resulta en marchitamiento y, finalmente, en la muerte del árbol huésped⁶. Sin embargo, en la actualidad no existe una forma eficiente de controlar esta enfermedad. El comportamiento de apareamiento podría jugar un papel importante en la alta fecundidad de este nematodo⁷. Por lo tanto, investigamos el comportamiento de apareamiento de B. xylophilus en el laboratorio, tratando de encontrar una forma efectiva de perturbar su apareamiento y disminuir su fecundidad.

Este protocolo tiene como objetivo introducir los métodos detallados de cómo obtener los adultos vírgenes de B. xylophilus y cómo observar y analizar el comportamiento de apareamiento utilizando una grabadora de vídeo y un microscopio estereoscópico. Este protocolo también se puede utilizar como referencia para estudios de comportamiento de otros nematodos.

Protocol

1. Adquisición de Vírgenes nematodos adultos

1. Aislado nematodo del pino y condiciones de cultivo
   NOTA: El B. xylophilus aislar Nxy61 se extrajo originalmente de un massoniana Pinus enferma en la zona de Ningbo, provincia de Zhejiang en China.
   1. Preparar Papa Dextrosa Agar (PDA, consulte la Tabla de Materiales) placas para el cultivo de Botrytis cinerea.
   2. Para la inoculación, perforar un pedazo de alfombra de hongos con diámetro de 10 mm a partir de una estera de B. cinerea y lo puso en medio de una nueva placa de PDA. Cultura del B. cinerea durante 5 días a 25 ° C en la oscuridad.
   3. La cultura de los nematodos de madera de pino en la placa de Petri que contiene preparada B. cinerea a 25 ° C en la oscuridad.
2. Adquisición de B. xylophilus huevos
   1. Colocar un tubo de goma sujeta por debajo de un embudo y sostenga el embudo dispuesto en un bastidor para montar elaparato de embudo Baermann. Colocar dos capas de papel de filtro en lugar de gasa en la boca del embudo.
   2. La transferencia de los cultivos de hongos a la configuración de embudo y añadir agua hasta que está inmersa la flora fúngica. Esperar 2 h, y nematodos van a salir a partir del cultivo de hongos, cruce el papel de filtro, y establecerse en la parte más baja del embudo Baermann.
   3. Reunir la primera par de gotas de agua de la parte inferior del tubo en un tubo de 15 ml y recoger los nematodos liberando lentamente la abrazadera sobre el tubo.
   4. Centrifugar las colecciones anteriores a 3000 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente.
   5. Eliminar la capa superior de agua con una pipeta y resuspender con 1 ml de estéril doblemente destilada (dd) H ₂ O.
   6. Con una pipeta, transferir la resuspensión de arriba para un plato de Petri nuevo vidrio (6 cm de diámetro). Añadir 3 ml de estéril dd _H2O para la placa de Petri para asegurar que los nematodos son capaces de nadar libremente.
   7. Mantenga los nematodos en los glass placa de Petri durante 10 min a 25 ° C en la oscuridad. Los huevos serán puestos por las hembras embarazadas. Debido a su superficie la glicoproteína, los huevos se adhieren a la parte inferior de la placa de Petri de vidrio.
   8. Eliminar el agua y los gusanos con cuidado, sin molestar a los huevos. Añadir 3 ml de solución estéril de dd H ₂ O a la placa de Petri de vidrio inmediatamente para evitar que los huevos se sequen.
   9. Repita el paso 1.2.8 3x para eliminar todas las larvas y los adultos, y obtener los huevos puros. Añadir un extra de 2 ml (5 ml en total) de estéril dd _H2O para la placa de Petri.
3. La adquisición de los juveniles de Cuarta Etapa (larvas J4)
   1. Escotilla de los huevos recogidos durante 24 h en la oscuridad a 25 ° C para obtener larvas J2.
   2. Transferir las larvas J2 con una pipeta en un tubo de 15 ml, se centrifuga a 3.000 g durante 2 min, y quitar la capa superior de agua.
   3. Volver a suspender las larvas J2 con 200 l de estéril dd _H2O, y luego transferirlos ala placa de PDA que contiene B. cinerea.
   4. Cultura las larvas J2 durante 52 horas a 25 ° C en la oscuridad. En este punto de tiempo, la mayoría larvas J2 se habrá convertido en la primera etapa de larvas J4.
4. Adquisición de nematodos adultos vírgenes
   1. Preparar una aguja para recoger nematodos mediante la elaboración de un capilar de vidrio después de haberlo calentado sobre un mechero de alcohol.
      NOTA: La punta de esta aguja capilar por lo general tiene que ser 50 micras de diámetro, más o menos la anchura del cuerpo de un nematodo adulto, de manera que se puede utilizar como una herramienta para recoger un solo nematodos.
   2. Montar un embudo Baermann y extraer nematodos de los cultivos de hongos durante 2 h, tal como se describe en los pasos 1.2.1 - 1.2.3.
   3. Transferir el J4 con agua en una placa Petri limpia.
   4. Observar los nematodos bajo un estereomicroscopio y distinguir entre machos y hembras de la morfología genital, tal como se describe por Mamiya y Kiyohara ⁸ (Figura 1 ). Recoger un nematodo del sexo deseado con la aguja capilar preparado y transferirlo a la placa con hongos de cultivo apropiado para hombres o mujeres.
      NOTA: Hay más mujeres que hombres, con el porcentaje de hembras a 60 - El 70%. La vulva femenina es obviamente diferente de la espícula masculina. En comparación con el adulto, la espícula o la vulva en las primeras etapas del J4 es más pequeño, pero todavía pueden ser vistos y distinguida fácilmente. El nematodo está siempre en movimiento en el agua, que a veces aumenta la dificultad de distinguir machos y hembras.
   5. Cultura J4 las larvas durante otras 24 horas a 25 ° C en la oscuridad.
      NOTA: Todos los nematodos deben convertirse en adultos, pero como son desacoplados, que son considerados como adultos vírgenes.
   6. Montar dos embudos Baermann y extraer los adultos vírgenes procedentes de los cultivos de hongos durante 2 h, tal como se describe en los pasos 1.2.1 - 1.2.3, y transferir los machos adultos y hembras vírgenes en dos platos separados, limpios de Petri.

2. La observación y grabación de vídeo de la conducta de apareamiento

1. Preparar varias diapositivas cóncavas y añadir 200 l de estéril dd _H2O a cada uno de sus pozos.
2. Recoger el macho adulto o preparados virgen y hembra con una aguja capilar y poner sólo un nematodo en el agua de cada diapositiva cóncava.
3. Mantenga los adultos vírgenes en el interior del pozo durante 1 hora para dejar que se adapten al nuevo entorno acuoso.
4. Par una virgen masculina y femenina mediante la transferencia de uno de ellos de un pozo a otro utilizando una pipeta.
5. Observar el comportamiento de apareamiento de la 1♀ + combinación 1♂ en la diapositiva cóncava bajo un microscopio estereoscópico.
6. Para analizar la eficiencia de acoplamiento de los adultos vírgenes, calcular su tasa de éxito de apareamiento (R) y compararlo con el de parejas de adultos seleccionados al azar. Calcular R como el porcentaje de repeticiones en el que se observó la cópula en comparación con el número total de repeticiones estudiados.
7. Para investigar la elección de apareamiento y la competencia intrasexual, grupo y observar los nematodos vírgenes de dos combinaciones diferentes: 1♀ + 3♂ y 3♀ + 1♂.
8. Con el fin de recopilar datos para el análisis cualitativo y cuantitativo, filmar el comportamiento de apareamiento mediante microscopía de vídeo. Normalmente, todo el proceso de acoplamiento, desde el momento en el que los nematodos se colocan en el pozo de la corredera cóncava para el momento en que se alejan después de la copulación, se completa dentro de 2 h. Por lo tanto, el proceso de apareamiento grabar de forma continua durante al menos 2 h como una réplica. Completar al menos 30 repeticiones en total para cada combinación.
   NOTA: Añadir más estériles dd _H2O (por lo general 50 l) cada 0,5 h al pozo para compensar la evaporación durante el proceso de grabación.

3. Recolección de Datos

1. Ver todos los vídeos con cuidado sobre una pantalla de ordenador y caracterizar las sub-comportamientos cualitativamente.
2. Medir la duración de apareamiento usando THe fotograma a fotograma en función de la grabadora de vídeo. restar manualmente el tiempo de inicio desde el punto final.
3. Para la combinación 1♀ + 1♂, analizar cada grabación de vídeo y medir la duración de los eventos siguientes:
   1. Medir la duración de la búsqueda (es decir, el tiempo desde que la hembra y macho se introducen en el pozo de la corredera cóncava hasta el momento en que encuentran y en contacto entre sí).
   2. Medir la duración de contacto (es decir, el tiempo desde el primer contacto hasta el momento en que el macho se coloca precisamente en la vulva de la mujer para la primera copulación).
   3. Medir la duración de copulando (es decir, el tiempo desde cuando el macho se coloca precisamente en la vulva de la hembra hasta que se desliza hacia abajo del cuerpo de la hembra después de la eyaculación). Nota: Algunos nematodos pueden copular varias veces en 2 h. En tales casos, medir la duración de la copulación de la primera copulación hasta el final de la last uno, incluyendo el tiempo en el medio.
   4. Medir la duración de persistente (es decir, el periodo después de la copulación hasta que el baño macho y hembra de distancia unos de otros y están separados por una distancia de más de la longitud del cuerpo los nematodos '(normalmente 1 mm)).
4. Contar la frecuencia de la cópula y la duración de cada copulación y la duración media de todas las copulaciones en 2 h para cada una de las diferentes combinaciones (es decir, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂, y 1♀ + 3♂).
5. Calcular la tasa de éxito de apareamiento para el primer contacto (P) para las diferentes combinaciones como la tasa de éxito de apareamiento después de la primera toma de contacto, que se llevó a cabo de inmediato y sin ninguna interrupción. En la fase de contacto, varios contactos pueden ser observados antes de la copulación propiamente dicha.
   1. Cuando la distancia entre dos individuos es más que la longitud del cuerpo, considere uno de contactos de haber terminado. Para un replicado, ficha P como el 100% cuando la cópula is observó inmediatamente después de la primera toma de contacto, sin descanso, o 0.00%, si no se observó la cópula o si había copulación pero después de dos o más contactos.
      NOTA: Hubo 30 repeticiones para cada combinación descrita aquí.

Results

La tasa de éxito de acoplamiento (R) de los adultos vírgenes era 86,67% de media, que fue significativamente mayor que la de los adultos seleccionados al azar: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, P = 0,0001) (Figura 2). Este hallazgo sugiere que es más fácil de observar el comportamiento de apareamiento de B. xylophilus con adultos vírgenes que con adultos seleccionados al azar.

Cuan...

Discussion

Pruebas de comportamiento son un aspecto fundamental de la ecología química, la neurobiología, la biología molecular y la genética. Nematodos, y en particular de C. elegans, se usan ampliamente para estudios en estas áreas. El comportamiento de apareamiento de C. elegans se ha investigado previamente ^10-11. Sin embargo, B. xylophilus es gonochoristic y diferente de los hermafroditas C. elegans, y su proceso de apareamiento tiene diferentes características de comportamiento ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B. xylophilus aislado Nxy61			Extraído de Pinus massoniana en el área de Ningbo de China Cepa
		moho gris	Obtenido de la Academia Forestal de China
Embudos Baermann	Sengong
	Sengong
	Sengong
pipeta	Sengong
estéril dd H2O			Esterilizada por alta presión de vapor a 121 &00 grados; C durante 30 min.
Placas de Petri	Sengong
PDA mediano	Huankai Bio.	021050
incubadora	Sengong
Flujo laminar	Sengong
Estereoscopio	Leica LED5000	RL
microscopio estereoscópico invertido	Zeiss	A1
portaobjetos cóncavos	Sengong