Cefoperazona tratados modelo de ratón clínicamente relevante Clostridium difficile R20291 Strain

Summary

Este protocolo se describe el modelo de ratón cefoperazona de la infección por Clostridium difficile (CDI), utilizando una cepa clínicamente relevante y genéticamente manejable, R20291. Énfasis en el seguimiento clínico de la enfermedad, C. difficile enumeración bacteriana, la citotoxicidad de la toxina, y los cambios histopatológicos en todo CDI en un modelo de ratón se detalla en el protocolo.

Abstract

Clostridium difficile es un patógeno entérico anaeróbico, grampositivo y formador de esporas que se asocia con un aumento de la morbilidad y la mortalidad y, en consecuencia, representa una amenaza urgente para la salud pública. La recurrencia de una infección por C. difficile (ICD) después de un tratamiento exitoso con antibióticos es alta, ocurriendo en el 20-30% de los pacientes, por lo que es necesario descubrir nuevas terapias contra este patógeno. Los modelos animales actuales de ICD dan lugar a altas tasas de mortalidad y, por lo tanto, no se aproximan a las manifestaciones crónicas e insidiosas de la enfermedad observadas en los seres humanos con ICD. Para evaluar la terapéutica contra C. difficile, se necesita un modelo de ratón que se aproxime a la enfermedad humana utilizando una cepa clínicamente relevante. Este protocolo describe el modelo de ratón cefoperazone de CDI utilizando una cepa clínicamente relevante y genéticamente tratable, R20291. En el protocolo se detallan las técnicas para el seguimiento clínico de la enfermedad, la enumeración bacteriana de C. difficile, la citotoxicidad de la toxina y los cambios histopatológicos a lo largo de la ICD en un modelo de ratón. En comparación con otros modelos murinos de ICD, este modelo no es uniformemente letal a la dosis administrada, lo que permite observar un curso clínico prolongado de infección concordante con la enfermedad humana. Por lo tanto, este modelo de ratón de cefoperazona de CDI demuestra ser una valiosa plataforma experimental para evaluar los efectos de nuevas terapias en la mejora de la enfermedad clínica y en la restauración de la resistencia a la colonización contra C. difficile.

Introduction

Clostridium difficile es un anaerobio,, Bacillus formador de esporas gram-positiva que causa diarrea que amenaza la vida ^1. Infección por C. difficile (CDI) se asocia con una mayor morbilidad y mortalidad humana y los resultados en más de $ 4.8 mil millones en costos de salud por año ^1-4. En 2013, los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades clasifican C. difficile como un riesgo de resistencia a antibióticos urgente, lo que indica que presenta una amenaza inmediata para la salud pública ^1. Actualmente, el tratamiento antibiótico con vancomicina y metronidazol se consideran el estándar de cuidado....

Protocol

Declaración de ética:
El Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) en Carolina del Norte Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Estatal (NCSU) aprobó este estudio. El Cuidado de Animales NCSU y usar la directiva aplica las normas y directrices establecidas en la Ley de Ley y Extensión Investigación en Salud Animal Welfare de 1985. Las instalaciones de los animales de laboratorio en la NCSU adherirse a las directrices establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Estados de salud de los animales se evaluaron diariamente y animales moribundos fueron sacrificados humanitariamente por asfixia con <....

Results

Durante un estudio representativo, 5 semanas de edad C57BL / 6 ratones WT fueron pretratados con cefoperazona en su agua potable (0,5 mg / ml) durante 5 días y se dejaron a 2 días a lavar con agua potable regular. Los ratones fueron retados con 10 ⁵ esporas de C. difficile R20291 mediante sonda oral en el día 0 (Figura 1A). Los ratones se controlaron para la pérdida de peso y los signos clínicos (letargo, inapetencia, diarrea, y la postura encorvada) .......

Discussion

Este protocolo caracteriza el curso clínico, incluida la pérdida de peso, la colonización bacteriana, la citotoxicidad de toxinas y los cambios histopatológicos en el tracto gastrointestinal, de ratones tratados con antibióticos desafiados con esporas de C. difficile R20291. Hay varios pasos críticos dentro del protocolo en los que la atención al detalle es esencial. El cálculo preciso del inóculo de esporas de C. difficile es fundamental. Este cálculo se basa en la enumeración original de la cepa de es.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#62 Limpiador desinfectante esporidicular perisept	SSS Navigator	48027	Este producto requerirá dilución según lo recomendado por el fabricante
0.22 μ m filter	Fisherbrand	09-720-3	Alternativa a la placa filtrante para muestras individuales probadas en el Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Necesita ser calentado en baño de agua a 37 ° C antes de usar
0.4% Azul de tripano	Gibco	15250-061
1% Peniciilina/Estreptomicina	Gibco	15070-063
10% inactivado por calor FBS	Gibco	16140-071	Necesita calentarse en baño de agua a 37 ° C antes de usar
jeringa de plástico de 1 ml	BD Medical Supplies	309628
1x PBS	Gibco	10010-023
Micro Centrífuga de 2 ml Tapón de rosca	Corning	430917
Placa de fondo plano para cultivo celular de 96 pocillos	Costar Corning	CL3595
Placa de filtro de 96 pocillos	Millipore	MSGVS2210
Junta adhesiva	ThermoScientific	AB-0558
Bacto Agar	Becton Dickinson	214010	Parte de las placas de TCCFA (ver abajo)
Bacto Proteose Peptona	Becton Dickinson	211684	Parte de las placas de TCCFA (ver abajo)
Cefoperazone	MP Bioworks	199695
Cefoxitine	Sigma	C47856	Parte de las placas de TCCFA (ver abajo)
Clostridium difficile Antitoxin Kit	Tech Labs	T5000	Utilizado como control para el ensayo de células Vero
Clostridium difficile Toxina Lista A	Biological Labs	152C	Control positivo para el ensayo de células Vero
D-cicloserina	Sigma	C6880	Parte de las placas de TCCFA (ver más abajo)
Agua destilada	Gibco	15230
DMEM 1x Media	Gibco	11965-092	Necesita calentarse en baño de agua a 37 ° C antes de usar
Fructosa	Fisher	L95500	Parte de las placas de TCCFA (ver abajo)
Hemocitómetro	Bright-Line, Sigma	Z359629
KH2PO4	Fisher	P285-500	Parte de las placas de TCCFA (ver abajo)
MgSO4 (anhidro)	Sigma	M2643	Parte de las placas de TCCFA (ver abajo)
Millex-GS 0,22 μ m filter	Millex-GS	SLGS033SS	Filtro para placas TCCFA
Na2HPO4	Sigma	S-0876	Parte de las placas TCCFA (ver abajo)
NaCl	Fisher	S640-3	Parte de las placas TCCFA (ver abajo)
Número 10 hoja de bisturí desechable	Miltex, Inc	4-410
Placas PCR	Fisherbrand	14230244
Placa de Petri de plástico	Kord-Valmark Marca 2900
Esparcidor de células estéril de plástico en forma de L	Fisherbrand	14-665-230
Jeringa paso	Dymax Corporation	T15469
Taurocolato	Sigma	T4009	Parte de las placas TCCFA (ver más abajo)
Agua destilada ultrapura	Invitrogen	10977-015
C57BL/6J Ratones	The Jackson Laboratory	664	Los ratones deben tener entre 5 y 8 semanas de edad
Microscopio óptico Olympus BX43F	Cámara Olympus Life Science
DP27	Olympus Life Science
cellSens Dimension software	Olympus Ciencias de la