Este protocolo describe la forma de evaluar la expresión de una gran variedad de genes a nivel clonal. Una sola célula de RT-qPCR produce resultados altamente fiables con una fuerte sensibilidad para cientos de muestras y los genes.
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Artículo de método
Una sola célula de la expresión génica utilizando multiplex RT-qPCR para caracterizar heterogeneidad de las poblaciones linfoides Raras
En este artículo
Resumen
Resumen
la heterogeneidad de la expresión génica es una característica interesante investigar en poblaciones linfoides. La expresión génica en estas células varía durante la activación celular, el estrés, o la estimulación. Una sola célula de la expresión génica multiplex permite la evaluación simultánea de decenas de genes 1, 2, 3. A nivel de una sola célula, la expresión de genes múltiplex determina heterogeneidad de la población 4, 5. Se permite la distinción de heterogeneidad de la población mediante la determinación tanto de la mezcla probable de diversas etapas precursoras entre células maduras y también la diversidad de respuestas de las células a los estímulos.
Células linfoides innatas (CIT) se han descrito recientemente como una población de efectores innatos de la respuesta inmune 6, 7. En este protocolo, la heterogeneidad celular de la CIT secompartimento Patic se investigó durante la homeostasis.
En la actualidad, la técnica más utilizada para evaluar la expresión génica es la RT-qPCR. Esta expresión de genes método mide sólo un gen a la vez. Además, este método no puede estimar la heterogeneidad de la expresión génica, ya que se necesitan varias celdas para una prueba. Esto conduce a la medición de la expresión génica media de la población. Al evaluar un gran número de genes, RT-qPCR se convierte en un tiempo-, y el método reagent-, muestra que consume. Por lo tanto, las ventajas y desventajas limitan el número de genes o poblaciones de células que pueden ser evaluados, lo que aumenta el riesgo de perder la visión global.
Este manuscrito describe cómo multiplex de una sola célula RT-qPCR se puede utilizar para superar estas limitaciones. Esta técnica se ha beneficiado de los avances tecnológicos recientes microfluidos 1, 2. Las reacciones que se producen en multiplex chips de RT-qPCR no lo hacen excEED el nivel de nanolitros. Por lo tanto, la expresión de genes de una sola célula, así como la expresión de múltiples genes simultánea, se pueden realizar en un reagent-, muestra-, y de manera rentable. Es posible probar génica de células firma heterogeneidad a nivel clonal entre subconjuntos de células dentro de una población en diferentes etapas de desarrollo o en condiciones diferentes 4, 5. Trabajando en las poblaciones raras con un gran número de condiciones a nivel de una sola célula ya no es una restricción.
Introducción
En los últimos años, las células linfoides innatas (ILC) se han investigado cada vez más. A pesar de su falta de receptores específicos de antígeno, que pertenecen al linaje linfoide y representan centinelas importantes para la homeostasis de los tejidos y la inflamación. CIL se divide actualmente en tres grupos basados en su expresión de combinaciones específicas de factores de transcripción y de su capacidad para producir citocinas 6, 7.
ILC contribuyen a numerosas situaciones homeostáticos y fisiopatológicos en diversos órganos a través de la producción de citoquinas específicas 8, 9. Para poder entender el papel de estas células, es importante para determinar las diferentes subpoblaciones de la CDI por órganos e identificar sus relaciones de desarrollo. Además, los fenómenos de plasticidad entre los diferentes subconjuntos se han relacionado. Mediante el estudio de la heterogeneidadde las células presentes en un órgano, es posible delimitar su etapa de maduración y para distinguir sus funciones específicas.
Para ilustrar la técnica de multiplexación de una sola célula de RT-qPCR, las CIL hepáticas fueron elegidos, con un énfasis particular en su heterogeneidad dentro del mismo grupo CIT (CIT tipo 1) 10. En primer lugar, mediante el uso de citometría de flujo, tres poblaciones distintas de la CIT se caracterizaron en el hígado. Grupo 1 CIT representa alrededor del 80% de los efectores innatos, mientras que las otras dos poblaciones son las poblaciones de la CDI hepáticas raras (menos del 5% de los efectores innatos). Esas poblaciones fueron ordenados usando ampliamente expresadas marcadores de la superficie celular de las poblaciones de la CDI. Como resultado, las poblaciones ordenadas CIT en el hígado miran uno similar en términos generales a otro.
Múltiplex de una sola célula de RT-qPCR ha emergido como una de las mejores técnicas para investigar con prontitud a la heterogeneidad de estas poblaciones 11 . Dos características principales se determinan tomando ventaja de la multiplex de una sola célula técnica de RT-qPCR. En primer lugar, al ver el nivel clonal, es posible recuperar la expresión génica específica de la célula para la comparación entre las células que aparentemente muestran etapas de desarrollo similares. Entonces, al ver una combinación preseleccionada de la expresión génica, vamos a determinar nuevas firmas de genes sobre la base de los patrones de expresión de genes de forma simultánea en un punto de tiempo. Estos aspectos permiten la recogida de una gran variedad de datos de expresión de un gran número de células, incluso en poblaciones raras, ya que la técnica se realiza a nivel clonal. De esta manera, la heterogeneidad CIT en el hígado se puede evaluar de manera adecuada.
A continuación, por clasificación de todas las células con un fenotipo ILC global, se obtiene una amplia visión general de la expresión de múltiples genes de las poblaciones de la CIT del hígado, a pesar de que representan poblaciones extremadamente raros. Un chip basada en la microfluídica permite la experimentación con inclusouna pequeña cantidad de material celular. Como consecuencia, los perfiles de expresión génica de las poblaciones de células raras se pueden obtener. El uso de software en línea de la firma de análisis de genes, núcleos de población de células y las relaciones celulares potenciales pueden ser investigados. En consecuencia, las pruebas funcionales pueden llevarse a cabo para validar los datos de agrupación a nivel in vivo.
Decenas de expresiones de genes podrían evaluarse de forma concomitante en cientos o más células individuales en el mismo chip 3, 11, 12. Diseño del ensayo es la parte más larga y más importante del experimento. La determinación de los genes correspondientes a la hipótesis de que ser probado es de suma importancia para obtener resultados relevantes. En segundo lugar, se necesita un control interno (tales como marcadores de superficie conocidos utilizados para la clasificación) y controles específicos. Esto es crucial para probar la especificidad de amplificación de cebador, la eficiencia de la amplificación, y tque la ausencia de competencia de imprimación. Por lo tanto, trabajando con multiplex de una sola célula RT-qPCR es una técnica de ahorro de tiempo, ya que la expresión de genes múltiples de una célula se evalúa al mismo tiempo.
Usando el mismo chip y mezcla de reactivos para todas las células limita los posibles errores de manipulación y permite la reproducibilidad entre las muestras. En total, los diferentes aspectos de multiplex de una sola célula RT-qPCR permite la producción de resultados altamente fiables a nivel clonal, con un gran nivel de sensibilidad para una amplia variedad de muestras y genes. Los resultados obtenidos ofrecen datos potentes y robustos para pruebas bioestadísticos.
Esto se puede lograr debido al aspecto de microfluidos del método, lo que permite para el trabajo en muy pequeñas cantidades de material y conduce a resultados exhaustivos. Por último, el uso de software en línea, es posible comparar las poblaciones deseadas.
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Protocolo
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Seguridad Instituto Pasteur, de acuerdo con el Ministerio de Agricultura de Francia y las directrices de la CEE.
1. Preparar una placa de 96 pocillos de clasificación de celda única
- Preparar la mezcla de pre-amplificación en un tubo de 1,5 ml mediante la adición de 5,0 l de tampón de retro-transcripción específico, 1,3 l de bajo ácido etilendiaminotetraacético tampón (EDTA) TE (solución 10 TE mM, pH 8, y la solución de EDTA 0,1 mM; 0,2 mM filtró ), y 0,2 l de Taq ADN polimerasa por pocillo (Figura 1a).
- En una placa de 96 pocillos, distribuir 6,5 l de la mezcla de pre-amplificación en cada pocillo (hasta 48 pozos). Esta placa es la placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos.
NOTA: El uso de una pipeta electrónica se recomienda para este protocolo. Permite mediciones de volumen precisos y reproducibles y ahorra tiempo.
(A) En el 96 pocillos de una sola célula placa de clasificación, la mezcla pre-amplificación se distribuye primero, seguido de la mezcla de ensayo 0,2x. (B) El registro de cada posición de una sola célula debe mantenerse en una hoja de cálculo. Un bien sin una célula se denomina también "no entrada" y se puede utilizar como un control. Dos filas se puede ahorrar para controlar la eficiencia del cebador con la dilución de cDNA (secuencial uno de cada diez diluciones desde el equivalente de 10 5 células a una célula). (C) En la placa de ensayo de 96 pocillos, el reactivo de carga de ensayo se distribuye primero, seguido de la adición de los cebadores. No se olvide de mantener un diseño de cada posición de imprimación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Preparar una mezcla de ensayo 0,2x en un tubo de 1,5 ml mediante la adición de 1,4 l de cada cebador (cebadores 20x; hasta 48 sondas diferentes; ver Tabla 1). Ajustar el volumen final de 140 l con tampón de baja EDTA TE.
- Distribuir 2,5 l de la mezcla de ensayo 0,2x a los 48 pocillos en la placa de clasificación de una sola célula 96 pocillos que contiene la mezcla de pre-amplificación.
NOTA: El volumen final en cada pocillo de la placa de muestra de 96 pocillos debe ser de 9 l. - Sellar la placa con una lámina de cubierta. Agite la placa y girar hacia abajo a 280 xg durante 45 seg. Guarde la placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos a -20 ° C o usarlo inmediatamente.
2. La disociación de los organismos unicelulares
- El uso de un sistema de suministro de CO 2, la eutanasia a un ratón por la hipoxia. Fijar el ratón sobre una placa de disección y abrir la cavidad peritoneal longitudinalmente con unas tijeras.
- Recuperar las CIL desde el hígado.
- Antes del aislamiento del hígado, al ras del livcélulas er-circulación.
- Para llevar a cabo la vena porta, mover el pequeño y el intestino grueso en el lado izquierdo del ratón; la vena portal aparece como la vena más grande en la cavidad peritoneal.
- Con una jeringa de 10 ml y una aguja de 0,45 mm, lavar el hígado con un medio de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a través de la vena porta. Para facilitar el lavado de hígado, cortar la arteria gástrica con unas tijeras.
- Para extraer la vesícula biliar, pellizcar la base de la vesícula biliar con pinzas y separarlo del hígado con unas tijeras.
- Para aislar el hígado, pellizcar la base del hígado con fórceps, y el uso de tijeras, separar el hígado del resto de la cavidad peritoneal.
- Transferir el hígado en un tubo de alfarero con 5 ml de medio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) de suero de 2% de ternera fetal (FCS).
- Antes del aislamiento del hígado, al ras del livcélulas er-circulación.
- Disociar el hígado con una disociación mecánica usando una mano de mortero. Pasar el medio a un tubo de 15 ml. Llevar el volumen totala 14 ml con RPMI 2% de FCS. Deja la suspensión de células en hielo durante 15-20 minutos para decantar los hepatocitos.
- Recuperar el sobrenadante (sin los hepatocitos) en un nuevo tubo de 15 ml con una pipeta de 1 ml (12 ml de sobrenadante se puede esperar). Centrifugar a 120 xg durante 7 minutos a 10 ° C. Descartar el sobrenadante después de la centrifugación.
- Resuspender el precipitado obtenido en la etapa 2.4 en 14 ml de medio de gradiente de densidad (por ejemplo, Percoll 40%). Centrifugar a 600 xg durante 20 min a 20 ° C. Eliminar el sobrenadante por aspiración.
- Resuspender el precipitado en 1 ml de acetato de potasio (ACK). Dejar a temperatura ambiente durante 1 min. Después de 1 min, llevar el volumen total a 14 ml con solución de Hank equilibrada Salado (HBSS) 2% de FCS. Centrifugar a 120 xg durante 7 minutos a 10 ° C. Descartar el sobrenadante.
- Teñir las células.
- Resuspender el precipitado en 300 l de mezcla de anticuerpos con biotina (véase la Tabla de Materiales; añaden todos los anticuerpos con biotina mencionaned) y la transferencia de las células en 1,5 ml tubo. Dejarlo en la oscuridad durante 20 minutos a 4 ° C.
- Llevar el volumen total a 1 ml con HBSS 2% de FCS. Centrifugar a 120 xg durante 7 minutos a 10 ° C. Resuspender el precipitado en 300 l de mezcla de anticuerpos acoplados a fluorocromo y estreptavidina conjugada con fluorocromo (véase la Tabla de Materiales, añadir todos los anticuerpos-fluorocromo junto mencionados). Dejarlo en la oscuridad durante 20 minutos a 4 ° C.
- Llevar el volumen total a 1 ml con HBSS 2% de FCS. Centrifugar a 120 xg durante 7 minutos a 10 ° C. Eliminar el sobrenadante con una pipeta de 1 ml. Resuspender el precipitado en 1 ml de HBSS y yoduro de propidio (Pi; 1: 4.000).
NOTA: Al utilizar los marcadores de la superficie celular de la CDI ampliamente expresadas, se definen 3 poblaciones: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα +, y NKp46 - IL-7Rα +. Todas las poblaciones están ordenados linaje - CD3 - CD4 - CD45.2 +.
3. Una sola célula células activadas por fluorescencia (FACS)
- Utilice FACS para clasificar las células individuales 13.
NOTA: Los diferentes tipos de células pueden ser ordenados en la misma placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos (Figura 2).- Utilice FACS para ordenar una célula por pocillo que contiene la mezcla de ensayo 0,2x y la mezcla de pre-amplificación en la placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos. Use un plato de clasificación de una sola célula de 96 pocillos recién preparada o descongelar si se almacena a -20 ° C.
- Poner una placa de 96 pocillos sellada en el soporte de la placa de FACS. Utilice una placa de 96 pocillos vacíos como una prueba. Coloque la placa con la A1-bien de la izquierda y hacia el experimentador.
- Ajuste el soporte de la placa para obtener una gota en el centro de la A1-bien con los granos de verificación.
- Repita el paso 3.1.1.2 con todos los pozos de la línea A.
- Retire el sello de la placa de 96 pocillos y ordenar 100 perlas de verificación por pocillo. Compruebe si dformación rop en el centro de los pocillos.
- Cuando se ajusta adecuadamente, coloque la placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos en el soporte de la placa. Dibujar el diseño de la placa y el tipo 1 de células por pocillo.
NOTA: El posicionamiento apropiado de cada célula en la placa de clasificación 96 pocillos de una sola célula es esencial. Una disposición de la placa debe mantenerse en un software de hoja de cálculo. La disposición de la placa se utilizará en los próximos pasos (Figura 1B) 14. Deja un pozo que contiene la mezcla de ensayo de 0,2x y una mezcla de pre-amplificación en la placa de muestra de 96 pocillos sin células. Esto bien se utiliza como un control sin entrada. Dejar dos filas de 6 pozos para una dilución de ADNc. Estos pozos se utilizan como controles para la eficiencia del cebador (Figura 1b). - Guarde la placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos a -20 ° C o usarlo inmediatamente.
- Utilice FACS para ordenar una célula por pocillo que contiene la mezcla de ensayo 0,2x y la mezcla de pre-amplificación en la placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos. Use un plato de clasificación de una sola célula de 96 pocillos recién preparada o descongelar si se almacena a -20 ° C.
4. Pre-amplificación
- Utilice una sola célula de clasificación OBT plato fresco o descongelado de 96 pocillosained en el paso 3.1.1.6. Agite la placa y lo hace girar hacia abajo (280 xg durante 45 seg).
- Coloque la placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos en el termociclador. Realizar la transcripción inversa y de pre-amplificación de acuerdo con el programa mencionado en la Figura 3 y la Tabla 2.
Figura 3: Programa de pre-amplificación. Con el fin de tener suficiente material, se requiere pre-amplificación de genes diana específicos en las células individuales ordenados. La placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos se carga en un termociclador para seguir el programa de pre-amplificación. Los productos de pre-amplificación se diluyen a continuación con baja EDTA tampón TE y se pueden utilizar inmediatamente o se congelaron a -20 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Se diluye el pre-amplificadorlified muestras mediante la adición de 36 l de tampón de baja EDTA TE en cada pocillo.
- Sellar la placa con una lámina de cubierta. Agite la placa y lo hace girar hacia abajo (280 g durante 45 segundos). Almacenar la, placa de 96 pocillos pre-amplificada de una sola célula de clasificación a -20 ° C o usarlo inmediatamente.
5. Preparar una placa de muestra de 96 pocillos
- Preparar 191 l de mezcla maestra mediante la adición de 175 l de qPCR mezcla maestra y 17,5 l de reactivo de carga de muestra.
- En una nueva placa de 96 pocillos, distribuir 3,6 l de mezcla maestra en cada pocillo (hasta 48 pozos). Esta es la placa de muestra de 96 pocillos.
- Transferir 2,9 l de cDNA pre-amplificado a partir de la placa de muestra de 96 pocillos a la nueva placa de 96 pocillos. Mantener la misma posición para cada muestra entre la placa de clasificación de células de 96 individual y la placa de muestra de 96 pocillos.
- Sellar la placa con una lámina de cubierta. Agite la placa y lo hace girar hacia abajo (280 xg durante 45 seg). Coloque la nueva placa de 96 pocillos en hielo protegido de la luz. Almacenar el 96 pocillos samplia placa a -20 ° C o usarlo inmediatamente.
6. Preparar una placa de ensayo de 96 pocillos
- En una nueva placa de 96 pocillos, distribuir 3 l de reactivo de ensayo de carga en cada pocillo (hasta 48 pozos). Esta placa se llama la placa de ensayo de 96 pocillos.
- Añadir 3 l de cebadores para cada pocillo. Mantenga un diseño en una hoja de cálculo (Figura 1c y en la Tabla 1, el uso de todos los primers que figuran en la Tabla 1). El correcto posicionamiento de cada cebador en la placa de ensayo de 96 pocillos es esencial para los próximos pasos.
- Si el número de muestras está por debajo de 48, añadir agua en lugar de los cebadores a los pocillos no utilizados.
- Sellar la placa con una lámina de cubierta. Agite la placa y lo hace girar hacia abajo (280 xg durante 45 seg). Guarde la placa de ensayo de 96 pocillos a -20 ° C o usarlo inmediatamente.
NOTA: Para evitar los ciclos de congelación y descongelación de los cebadores, distribuir los cebadores para la mezcla de pre-amplificación y para el 96-welplaca de ensayo l al mismo tiempo.
7.-celular de chip único de expresión génica
- Coloque el circuito integrado de microfluidos (CFI) en el banco y comprobar las válvulas utilizando la jeringa con tapa. Abra la jeringa, lo coloca perpendicular a la válvula, y presione firmemente. La junta tórica debe moverse. Llenar el chip con el fluido de control (0,3 ml de tuberculina).
- Repita el paso 7.1 con la segunda válvula.
NOTA: No se derrama líquido debe ser sobre el chip. - Retire la película azul de la parte inferior del chip. Cargar el chip en el controlador de la CFI. En la pantalla del controlador de la CFI, seleccione "PRIME" y luego "Ejecutar". El control de las líneas de microfluidos duró 10 minutos.
- Expulsar el chip y volver a sellar la película azul en la parte inferior del chip.
Figura 4: Una sola célula múltiplex de expresión génica de carga de chip. Estos pasos requieren gprecisión reat, especialmente durante la transferencia de la placa de 96 pocillos para el chip de expresión génica multiplex de una sola célula. Para evitar errores de carga y extravíos, es muy recomendable para trabajar de forma secuencial. El volumen ocupado por cada transferencia debe ser controlado durante el proceso de pipeteado. Por último, es importante para evitar cualquier burbuja y para eliminar de ellos en caso de formación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Usando una pipeta de 8 canales, la transferencia de 5 l de la placa de ensayo de 96 pocillos en el lado A1 (lado izquierdo) del chip. Llenar el lado izquierdo del chip, como se indica en la Figura 4. Tenga cuidado para dibujar siempre el mismo volumen en las puntas.
- No crear burbujas. Si aparecen burbujas, sáquelas con 10 consejos l. Cambie las puntas de cada pocillo de la viruta.
- Repita el paso 7.5 en el lado derecho of el chip usando 5 l de la placa de muestra de 96 pocillos.
- Retire la película azul de la parte inferior del chip. Cargar el chip en el controlador de la CFI. En la pantalla del controlador de la CFI, seleccione "Ejecutar script" y luego "Ejecutar". La carga de las líneas de microfluidos dura 45 min.
- Expulsar el chip y volver a sellar la película azul en la parte inferior del chip.
8. Ejecutar el chip
- En el equipo de qPCR de microfluidos, seleccione el software "Data Collection". Una vez que se inicia, seleccione "Nueva Ejecutar".
- Seleccione "Expulsar", retire la película de color azul de la parte inferior del chip, y cargar el chip. Coloque el chip para obtener el A1 bien a la izquierda y hacia el experimentador.
- On "Proyecto", seleccione "Ninguno" y luego "Siguiente".
- Seleccione "Nuevo plazo chip", "Nuevo directorio chip" (crear una carpeta para el experimento), y "Siguiente".
- En "La expresión de genes", seleccione "; Referencia pasiva = ROX "(carboxi-X-rodamina) y" sonda individual; "seleccionar el filtro correcto de acuerdo con los cebadores Seleccionar." Siguiente ".
- Seleccione "Examinar" y seleccionar el programa correcto de acuerdo con los cebadores utilizados.
NOTA: "Default-10min-Hotstart.pcl" es el programa más utilizado para múltiplex de una sola célula de RT-qPCR. - Seleccione "Inicio Ejecutar". La reacción tarda aproximadamente 90 min.
- Una vez terminado, seleccione "Expulsar-Hecho".
Análisis de datos 9.
- Abra el software "Real-Time PCR Análisis", seleccione "Archivo" y "Abrir", busque la carpeta experimento, y seleccione "archivo ChipRun.bml."
- Haga clic en "Vista de Análisis", "Resultados En la tabla," y "Heat mapa;" casillas marcadas con una "X" están por debajo del nivel de detección de umbral y / o tenido malas curvas de amplificación.
- Nombre las muestras. Ir a "Configuración de ejemplo" y select "Nueva SBS 96." Haga clic en "Mapping" y seleccione "..." Copiar y pegar el diseño de la disposición de la muestra desde el software de hoja de cálculo. Definir el diseño pegado como "nombre de la muestra."
- Nombrar los ensayos. Repita el paso 9.3 con los nombres de cebadores en "Configuración del detector." Definir el diseño pegado como "Nombre del Detector."
- Haga clic en "Vista de análisis" y "Analizar"; los nombres de las muestras y de cebadores se pueden atribuir automáticamente a las muestras y los cebadores (Figura 7).
- Calcula Ct, Delta Ct, y el doble cambio para cada muestra. Use un gen de mantenimiento como control interno (en este caso, GAPDH):
Ct = Ct de la muestra - control interno Ct
Doblar el Cambio = 2 - (control ΔCtsample-ΔCtnegative)- Haga clic en "Configuración del detector" y seleccione el pozo sin control de entrada (utilice la limpieza de genes como un control interno para normalizar la expresión génica). Seleccione "EDitor "," definir referencia "y" Actualizar ".
- Seleccionar todos los pozos a los cuales se aplicará el control interno definido anteriormente. Seleccione "Editor" y "definir como prueba." Seleccionar un gen de referencia adecuado y haga clic en "Update".
- Seleccionar "Configuración de ejemplo" para seleccionar bien el control negativo. Seleccione "Editor" y definir "de referencia". Haga clic en "Update".
- Seleccione "Vista de Análisis" y "Analizar"; el Delta Ct y el cambio veces se calculará automáticamente.
- Exportar los datos. Seleccione "Archivo" y "Exportar, guardar como" Resultados de la mesa ", seleccione la carpeta de destino, y pulsa" Guardar "y" Salir ".
- Repita el paso 9.7, pero en lugar de "Resultados de la mesa," Guardar como "HeatMap resultados."
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Resultados
poblaciones linfoides muestran una gran diversidad en la expresión génica. En este protocolo, la heterogeneidad hígado compartimento ILC se investigó utilizando multiplex de una sola célula de la expresión génica por RT-qPCR. A diferencia de otras técnicas de expresión génica, multiplex de una sola célula de la expresión génica por RT-qPCR permite el trabajo en varias poblaciones, incluso los más raros, al mismo tiempo. Esta especificidad, junto con una alta sensibilidad a nivel clonal, ...
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Discusión
Este protocolo se describe cómo obtener información exhaustiva de la expresión génica a nivel clonal. A continuación, se investigó la heterogeneidad de hígado CIT compartimento. Después de la clasificación de una sola célula de diferentes poblaciones de la CDI (basados en marcadores de la superficie de la CDI ampliamente expresados), las muestras fueron pre-amplificadas por los genes preseleccionados específicos. Entonces, el ADNc y los cebadores obtenida se cargaron en un chip microfluídico multiplex RT-qPCR. Por últ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Institut Pasteur, el INSERM, la Université Paris Diderot y por el Ministère de la Recherche (a S.C.); la Association pour la Recherche sur le Cancer (a S.C. y R.G.); el Programa de Inversión Futura REVIVE y la Agence Nationale de Recherche (ANR; subvención ''Twothyme'' a A.C.); Beca ANR ''Myeloten'' (a R.G.); y el Institut National du Cancer (Papel del microambiente inmunitario durante la carcinogénesis hepática, a R.G.). Agradecemos a la plataforma del Centro de Inmunología y Citometría Humana del Institut Pasteur por su apoyo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit qRT-PCR Cells Direct One Step | Applied Biosystems | 11753100 | Kit de detección de sonda de cebador. Contiene 2x mezcla de reacción, enzima SSIII Platinium. |
| Tampón EDTA de TE bajo | Affymetrix | 75793 100ML | |
| Placas de 96 pocillos | Thermofisher Scientific | AB 1100 | Placas de 96 pocillos adaptadas para la clasificación de células y el termociclado |
| Película de cubierta | Dominique Dutscher | 106570 | película de cubierta de aluminio; evitar la contaminación y la evaporación |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20x imprimación |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20x imprimación |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20x |
| imprimación Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20x |
| C-MYC | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20x Imprimación |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 20x | |
| Cd27 | Thermofisher Scientific Mm01185212_s1 | 20x imprimación | |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20x |
| imprimación CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20x imprimación |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20x imprimación |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20x imprimación |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20x |
| imprimación Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20x |
| imprimación Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20x |
| imprimación Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20x |
| imprimación Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20x imprimación |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20x imprimación |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20x |
| imprimación Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20x imprimación |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20x imprimación |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20x |
| imprimación Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20x |
| imprimación Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20x imprimación |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20x imprimación |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20x |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific Mm01340213_s1 | 20x | |
| imprimación Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20x Imprimación |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 20x | |
| imprimación Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20x |
| imprimación Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20x imprimación |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20x imprimación |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20x |
| imprimación Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20x |
| imprimación Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20x |
| imprimación Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20x imprimación |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20x imprimación |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20x imprimación |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20x imprimación |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 20x imprimación | |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20x |
| imprimación Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20x Imprimación |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20x |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20x imprimación |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 20x | |
| Tox | Thermofisher Scientific Mm00455231_s1 | 20x primer | |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20x |
| primer Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20x primer |
| qPCR Master mix | BioSystems P | /N aplicado 4304437 | |
| 2x Reactivo de carga de ensayo | Fluidigm | N/P 85000736 | Ensayos de densidad específica de medio a carga en chip microfluídico RT-qPCR multiplex. |
| 2x Reactivo de carga de muestras | Fluidigm | N/P 85000735 | Medio de densidad específica para cargar muestras en un chip microfluídico RT-qPCR multiplex. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR chip microfluídico | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC para la expresión génica; chip para multiplex de una sola célula reacción RT-qPCR |
| 48.48 multiplex RT qPCR controlador de chip microfluídico | Fluidigm | 89000020 | 48.48 controlador IFC; control del chip sistema fluídico interno, carga de muestras y ensayos en cámaras de reacción |
| multiplex RT qPCR termociclador microfluídico | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array Termociclador IFC |
| placas de 96 pocillos | Thermofisher Scientific | AB 1100 | Placas de 96 pocillos adaptadas para la clasificación celular y el termociclado |
| C57Bl/6 ratones | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| jeringa de 10 ml | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Suero de ternera fetal estándar |
| Tubo Potter | N/A | ||
| Tubo de 15 ml | Corning | 352097 | |
| tubo de 1,5 ml | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Máquina FACS | N/ | ||
| centrífuga | Thermofisher Scientific 75004538 | ||
| 1.000 y micro; l consejos | Fisher Scientific 10313272 | ||
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Tubo Facs | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Anticuerpo de ratón contra la biotina | de Sony 1103520 anticuerpo | ||
| anti-CD19 Biotina contra ratones Anticuerpo de Sony | 1177520 | linaje anticuerpo | |
| anti-TCRab Biotin anticuerpo de ratón | BioLegend | 109204 | anticuerpo de linaje |
| anti-TCRgd Biotina anticuerpo de ratón | BD Biosciences | 553176 | anticuerpo de linaje |
| anti-Ter119 Biotina anticuerpo de ratón | BD Biosciences | 553672 | anticuerpo de linaje |
| anti-Gr1 Biotina anticuerpo de ratón | BD Biosciences | 553125 | linaje anticuerpo |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 anticuerpo de ratón | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 anticuerpo | de ratón ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 anticuerpo de ratón | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 anticuerpo de ratón | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE anticuerpo de ratón | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Estreptavidina | Sony | 2626025 | |
| Yoduro de propidio | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Pipeta electrónica | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 ml | Eppendorf | 30089405 | |
| Pipeta multicanal | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | perlas de verificación para FACS |
Referencias
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- Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
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- Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
- Monticelli, L. a, Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
- Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
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- Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
- Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
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