Un protocolo optimizado para el ensayo de cambio de movilidad electroforética utilizando oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente infrarrojo

Resumen

Se describe aquí un protocolo optimizado de ensayos fluorescentes cambio de movilidad electroforética (FEMSA) utilizando purificados Sox-2 proteínas, junto con sondas fluorescentes infrarrojos marcado tinte de ADN como un estudio de caso para hacer frente a una importante cuestión biológica.

Resumen

Ensayos de movilidad electroforética (EMSA) son una herramienta fundamental para caracterizar las interacciones entre las proteínas y sus secuencias de ADN diana. La radiactividad ha sido el método predominante de marcaje de ADN en EMSAs. Sin embargo, los recientes avances en los tintes fluorescentes y métodos de exploración han impulsado el uso de la marcación fluorescente de ADN como una alternativa a la radiactividad de las ventajas de la fácil manipulación, ahorro de tiempo, la reducción de costes, y mejorar la seguridad. Recientemente, hemos utilizado la EMSA fluorescente (FEMSA) para abordar con éxito una importante cuestión biológica. Nuestro análisis FEMSA proporciona una visión mecanicista en el efecto de una mutación sin sentido, G73E, en el factor de transcripción de la HMG SOX-2 altamente conservada en la diversificación tipo de neurona olfativa. Se encontró que el mutante SOX-2 de proteínas ^G73E altera la actividad de unión de ADN específica, lo que provoca la transformación de identidad neurona olfativa. A continuación, presentamos una optimizada y rentable paso a paso el protocoloFEMSA para el uso de oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente infrarrojo que contienen los LIM-4 / SOX-2 sitios diana adyacentes y purificados SOX-2 proteínas (WT y mutantes SOX-2 proteínas ^G73E) como un ejemplo biológico.

Introducción

EMSAs se utilizan para analizar las interacciones entre el ADN y las proteínas mediante el uso de poliacrilamida nativo electroforesis en gel (PAGE) para resolver una mezcla de una proteína de interés y una sonda de ADN marcado que contiene los posibles sitios diana de la proteína ^1. Una sonda de ADN vinculados con la proteína migrará más lento en comparación con una sonda de ADN libre, y por lo tanto retraso en su migración a través de una matriz de poliacrilamida. El radiomarcado de ADN por ³² P ha sido el método predominante para la detección en EMSAs. Aunque la aplicación de radiomarcaje en la investigación bioquímica ha sido beneficioso, se están empleando métodos de marcaje de ADN alternativa con sensibilidad comparable debido a los riesgos de salud y seguridad asociados con el manejo de la radiactividad. Estos métodos alternativos incluyen la conjugación de ADN con biotina ² o digoxigenina (DIG) ³ (ambos de los cuales a continuación, son detectados por los sistemas quimioluminiscentes), SYBR verde tinción de los geles página ^4,o la detección directa de los conjugados de tinte de ADN fluorescente mediante el escaneo de la ^5,6 gel.

Los geles resueltos de EMSAs utilizando sondas de ADN marcadas radiactivamente requieren un procesamiento postrun a través de películas de autorradiografía o un sistema PhosphorImager para detectar señales radiactivas ^1,7. Los geles de EMSAs utilizando biotina ² o DIG conjugados sondas ³ de ADN también se deben procesar y se transfirieron a una membrana adecuada y luego detectados por quimioluminiscencia ^6. SYBR verde tinción del gel requiere tinción de gel postrun y un escáner de fluorescencia ^4. Dado que se requieren etapas de procesamiento gel postrun para EMSAs utilizando estas técnicas de marcaje de ADN, el gel resuelto se puede ensayar sólo una vez. En contraste, las sondas de ADN marcadas con fluoróforos pueden ser detectados directamente en el gel en el interior de las placas de vidrio por un escáner. Por lo tanto, las interacciones ADN-proteína se pueden monitorizar y se ensayaron varias veces a diferentes puntos de tiempo durante la ejecución, quereduce significativamente el tiempo y el costo. Los conjugados de tinte de ADN fluorescente que se han utilizado para EMSAs incluyen Cy3 ^{6,8, 6,8} Cy5, fluoresceína ^9, y colorantes fluorescentes infrarrojos ^4-6.

Regulación transcripcional requiere interacciones proteína-ADN de factores de transcripción y sus genes diana. La coordinación de estas interacciones genera diversos tipos de células a partir de un antepasado común durante el desarrollo animal. Una pantalla de genética hacia adelante imparcial identificado una mutación de sentido erróneo, G73E, en el dominio de unión a ADN HMG altamente conservadas de la Caenorhabditis elegans factor de transcripción SOX-2. La mutación en una transformación de identidad celular de las neuronas olfativas AWB en AWC neuronas olfativas en los niveles moleculares, morfológicos y funcionales ^5,10. SOX-2 diferencialmente regula la diferenciación terminal de AWB y AWC neuronas mediante la interacción con factores de transcripción dependientes del contexto socio y respectivaSitios diana de ADN ^5,10. SOX-2 se asocia con LIM-4 (LHX) en el terminal AWB diferenciación neuronal, mientras Sox-2 socios con CEH-36 (OTX / OTD) en terminal de la diferenciación neuronal AWC. Ensayos de reportero de luciferasa muestran que Sox-2 y mutantes Sox-2 ^G73E proteínas tienen interacciones cooperativas con cofactores de transcripción LIM-4 y CEH-36 para activar un promotor expresado en AWB y AWC neuronas. Sin embargo, SOX-2 y mutante SOX-2 ^G73E muestran propiedades de activación diferencial del promotor. Para investigar la base molecular de las actividades de unión de ADN diferenciales de SOX-2 y SOX-2 ^G73E, fEMSAs se realizaron con estas proteínas y sus sitios diana potenciales.

En primer lugar, se tomó un enfoque de la bioinformática para identificar las secuencias de unión dentro de la región del promotor 1 kb utilizado en el ensayo de luciferasa de ADN biológicamente relevante. Desde múltiples Sox-2 posibles sitios de unión estuvieron presentes durante todo el promotor, nos concentramosen los sitios de unión de SOX-2 predichos adyacentes a putativo CEH-36 o LIM-4 sitios de unión y evolutivamente conservadas entre diferentes especies de nematodos. Estas secuencias se eliminan o mutadas, y posteriormente se probaron in vivo para determinar su actividad para expresar transgenes reportero GFP en AWB o AWC neuronas. A través de este enfoque, hemos identificado posibles LIM-4 / SOX-2 y de la CEH-36-2 SOX sitios diana adyacentes / que se requieren específicamente para la expresión de GFP en AWB y AWC neuronas ^5, respectivamente. Se investigaron las posibles diferencias en el ADN vinculante de SOX-2 y Sox-2 ^G73E usando FEMSA con las CEH-36 / SOX-2 sitios diana adyacentes identificados LIM-4 / SOX-2 y. Nuestro análisis mostró que la EMSA SOX-2 ^G73E no se unió la sonda de ADN que contiene los LIM-4 / SOX-2 sitios diana adyacentes (requeridos para la expresión de genes en AWB) tan eficientemente como WT Sox-2 lo han hecho. Sin embargo, Sox-2 y SOX-2 ^G73E no tenían ninguna diferencia en la unión de la sonda de ADN que contiene la CEH-36 / SOX-2 unasitio de destino djacent (necesario para la expresión de genes en AWC) ^5,10. Nuestra FEMSA analiza proporcionar una visión mecanicista de la naturaleza de la mutación ^G73E SOX-2 en afectar a la actividad de unión al ADN específico para la identidad de célula fenotipo de transformación AWB-a-AWC. A continuación, describimos un protocolo optimizado de FEMSA usando 6xHis-Sox-2 purificados o 6xHis-SOX-2 ^G73E junto con sondas de ADN marcados con colorante fluorescente infrarrojo que contienen los LIM-4 / SOX-2 sitios diana adyacentes como caso de estudio para abordar una importante cuestión biológica.

Protocolo

NOTA: EMSAs utilizando sondas de ADN marcadas con fluorescencia u otras formas de ADN marcado comparten los mismos protocolos para la proteína o preparación de extracto de células, reacción de unión proteína-DNA, y la preparación de gel de PAGE y se ejecuta (Figura 1A). Las principales diferencias son procedimientos de ADN de etiquetado, las etapas de procesamiento de gel post-estreno y los métodos de detección.

1. Preparación del gel

1. Preparar 5% de gel de poliacrilamida nativo que contiene TBE 0,5x (45 mM de Tris-borato, EDTA 1 mM) y 2,5% de glicerol, utilizando un sistema de gel de la proteína mini (8,3 cm de ancho x 7,3 cm de espesor de longitud x 0,75 mm).
   1. Para preparar 30 ml de solución de gel para 4 geles, mezclar 5 ml de 30% de acrilamida / BIS (37,5: 1), 3 ml de 5x TBE (0,45 M Tris-borato, EDTA 10 mM), 1,5 ml de 50% de glicerol, 300 l de 10% de persulfato de amonio, 15 l de TEMED y 20,2 ml de _ddH2O a fondo.
      NOTA: La acrilamida es nocivos y tóxicos, manejar con el equipo de protección personal adecuado.
2. Reparto de la solución de gel inmediatamente. Después de la polimerización, envolver los geles en una envoltura de plástico transparente pre-humedecido con TBE 0,5x y almacenar a 4 ° C.

2. Preparación de sondas marcadas con colorante fluorescente infrarrojo

NOTA: Mantenga los oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente en el infrarrojo de la luz tanto como sea posible durante la preparación, almacenamiento y experimentos.

1. Crear y activar los oligonucleótidos.
   1. Diseñar oligonucleótido largo de ~ 51-meros.
      NOTA: La secuencia de oligonucleótidos largo de la sonda LIM-4 / SOX-2 es TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. oligonucleótidos largos no requieren PAGE o purificación por HPLC.
   2. Diseño de oligonucleótidos cortos complementarios para ~ 14-meros con modificación colorante fluorescente infrarrojo en el extremo 5 '(5'Dye) y una temperatura de fusión superior a 37 ° C.
      NOTA: La secuencia de oligonucleótidos cortos de la LIM-4 / SOX-2-sonda es 5'Dye GGGAGAAGATTTTG. La escala de síntesis mínima de oligonucleótidos cortos marcados con 5'Dye es de 100 nm. Por lo tanto, los oligonucleótidos requieren purificación por HPLC.
2. oligonucleótidos Resuspender en tampón 1x Tris-EDTA (TE: mM Tris-HCl 10, pH 8,0; EDTA 1 mM) hasta una concentración final de 100 mM.
3. Recocido corto (5'Dye) y los oligonucleótidos largos.
   1. Mezclar 0,6 l de 5'Dye-Short oligo (100 mM), 1,2 l de largo oligo (100 mM), y 28,2 l de tampón de cloruro de sodio-Tris-EDTA (STE: NaCl 100 mM; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 1 mM) en un tubo de 1,5 ml.
   2. Se coloca el tubo en agua hirviendo durante 5 minutos. Apagar la fuente de calor y dejar que el agua con los oligos hibridados se enfríen O / N en la oscuridad.
4. Rellena los salientes 5 'de los oligonucleótidos hibridados / 5'Dye largas-cortas con ADN polimerasa Klenow para hacer sondas de ADN de doble cadena.
   1. Preparar la reacción mediante la mezcla de30 l de recocido largos corto oligos / con la etiqueta 5'Dye, 8,5 l de tampón Klenow 10x, 1,7 l de dNTP 10 mM, 1,7 l de Klenow (3 '-> 5' exo) (5 u / l), y 43,1 l de _ddH2O en un tubo de 0,2 ml PCR.
   2. Incubar 60 min a 37 ° C en una máquina de PCR.
   3. Añadir 3,4 l 0,5 M EDTA para detener la reacción e inactivar por calor a 75 ° C durante 20 min en una máquina de PCR.
5. Diluir sondas cumplimentados (0,7 M) en STE para la concentración final de 0,1 mM.
6. oligos almacenar a -20 ° C en la oscuridad hasta que esté listo para su uso. Oligos se pueden almacenar durante un máximo de un año en esta condición.
   NOTA: Para generar sondas de ADN con sitios de unión de mutantes, versiones mutantes de oligonucleótidos largos se hibridan con oligonucleótidos cortos marcados con 5'Dye, seguido de relleno de 5 'domina con Klenow. Se ha demostrado que la sonda con una hebra marcada con un fluorescente en el infrarrojocolorante tiene solamente 30% de intensidad de la sonda con las dos cadenas marcadas con el colorante. Si la intensidad de la señal necesita ser fortalecida, largas oligos de ambas cadenas se marcan con tintes fluorescentes infrarrojos en términos 5 'y recocidos para hacer sondas marcados con colorante fluorescente en el infrarrojo.

3. Preparación de las sondas sin etiqueta / Calor (competidores)

Nota: Los oligonucleótidos largos de secuencias complementarias (largos y LongR) fueron recocidos para hacer sondas no marcadas para el análisis de la competencia con sondas marcados con colorante fluorescente en el infrarrojo.

1. Mezclar 20 l de 100 mM largo, 20 l de 100 mM LongR oligonucleótidos, y 60 l de STE en un tubo de 1,5 ml.
2. Se coloca el tubo en agua hirviendo durante 5 minutos, apague la fuente de calor y dejar que el agua con los oligos hibridados enfriar durante la noche.

4. reacción de unión y Electroforesis

1. Preparar 1 ml de tampón de unión 5x mezclando 50 l60; de 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 10 l de NaCl 5 M; 200 l de 1 M KCl, 5 l de 1 M MgCl _2, 10 l de 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 l de DTT 1 M; 25 l de 10 mg / BSA ml, y 695 l de ddH ₂ O.
   NOTA: El 5x tampón de unión puede ser alícuotas y se almacenó a -20 ° C. Otro punto a considerar es que los diferentes factores de transcripción tendrán diferentes modificaciones en el tampón de unión.
2. Justo antes de la creación de reacciones de unión, antes de ejecutar el gel de poliacrilamida nativo al 5% en TBE 0,5x + 2,5% de glicerol para eliminar todo rastro de persulfato de amonio a 80 V durante 30 - 60 minutos, o hasta que el actual ya no varía con el tiempo.
3. Configurar la reacción de unión en el volumen final de 20 mL.
   1. Mezclar 4 l de tampón de unión 5x, 80 a 200 ng de proteína purificada A (en 50% de glicerol, es decir, SOX-2), 1 l de 0,1 M de sonda tinte conjugado (concentration: 5 nM), y _ddH2O
   2. Opcional: Cuando se requieren competidores sonda fría, añadir diversas concentraciones (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) de las sondas frías.
   3. Opcional: Cuando la interacción entre las proteínas A y B (es decir, SOX-2 y LIM-4) se prueba, añadir 80 a 200 ng de proteína purificada B (en 50% de glicerol, es decir, LIM-4).
   4. Opcional: Cuando se utiliza la preparación del extracto nuclear y la unión específica de la proteína A está para ser validado, añadir el anticuerpo específico para la proteína A (es decir, anti-6xHis, anti-FLAG, etc.).
   5. Incubar a R / T en oscuridad durante 15 min.
4. Cargar la totalidad de la reacción de unión en el gel y correr el gel a 10 V / cm a la distancia deseada.

5. Imaging

NOTA: El gel se escaneó directamente en las placas de vidrio con un sistema de imagen de infrarrojos avanzada. Por lo tanto, el gel se puede resolver más y escanear repetidamente (Figuras 1C y 2). Un sistema de imagen fluorescente del infrarrojo cercano principalmente para transferencias de Western se ensayó también para escanear el gel, pero sólo el sistema de imágenes de infrarrojos avanzada fue capaz de escanear el gel con buena resolución. La metodología descrita es específico de un software de formación de imágenes de infrarrojos particular, aunque se pueden usar otros paquetes de software.

1. Limpiar el lecho del escáner con _ddH2O y secar bien antes de escanear. Seque las placas de vidrio del gel y colocar las placas que contienen el gel sobre la superficie del escáner.
2. Abra el software de imágenes de infrarrojos y vaya a la pestaña 'Acquire'. Cuando la placa más delgada (1 mm) se coloca en la superficie del escáner, utilice la configuración de canales: 700, Intensidad: Auto, Resolución: 169 micras, calidad: medio, y Focus offset: 1,5 mm. Cuando la placa gruesa (3 mm) se coloca en la superficie del escáner, utilice la configuración de canales: 700, Intensidad: Auto, Resolución: 84 micras, calidad: medio, y Focus offset: 3,5 mm. desfase de enfoque depende de laespesor de la placa de vidrio.
3. Seleccione el área que ocupa el gel en el escáner. Haga clic en "Inicio" para comenzar la exploración.
4. Repita electroforesis y escanear adicionalmente según sea necesario.

Resultados

Naranja G carga de colorante (6x: 0,12 g de Orange G en 100 ml de 30% de glicerol) se puede añadir a la reacción de unión antes de la carga para visualizar el progreso de la electroforesis. Serán detectados Otros colorantes de carga, incluyendo azul de bromofenol durante la exploración y por lo tanto interfieren con análisis de imagen (Figura 1B).

En algunos casos de EMSAs, especialmente si se utiliza la prepa...

Discusión

fEMSAs son una herramienta eficaz para investigar las interacciones proteína-ADN, y son una alternativa a la marcación radiactiva de ADN. Los tintes fluorescentes tales como tintes de infrarrojos están disponibles comercialmente, y proporcionan un método más seguro y más respetuoso del medio ambiente en comparación con marcaje de ADN radiactiva. EMSAs utilizando fluorescentes infrarrojos oligonucleótidos marcados con colorante no requieren etapas de procesamiento gel postrun, y por lo tanto ahorrar tiempo y costes en co...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de acrilamida al 30%/Bis, 37.5:1	Bio-Rad	1610158	Acrilamida es perjudicial y tóxico.
6x-HIS Epitope Tag Antibody (HIS. H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anticuerpo M2 anti-bandera	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Albúmina sérica bovina (BSA) grado de biología molecular	New England Biolabs	B9000S
Oligos de ADN marcados con 5'IRDye700 Tecnologías de	ADN integradas	Oligonucleótidos de ADN personalizados	Estos se denominan "Oligós de ADN marcados con tinte 5' o fluorescentes infrarrojos" en el manuscrito. La compañía sintetizará de forma personalizada oligonucleótidos de ADN marcados con 5' IRDye. Requiere un mínimo de 100   μ Síntesis a escala M y purificación por HPLC.
Fragmento de Klenow (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN  Célula de electroforesis vertical	Bio-Rad	1658000FC	Esto se conoce como un "mini sistema de gel de proteínas" en el manuscrito. Se puede utilizar cualquier sistema electroforético siempre que sean placas de vidrio transparente de menos de 25 cm x 25 cm de tamaño.
Sistema de imágenes infrarrojas Odyssey CLx	LI-COR Biotechnology	Odyssey CLx Infrared Imagng System	Esto se conoce como un "sistema avanzado de imágenes infrarrojas" en el manuscrito.
Sistema de imágenes Odyssey Fc	dual Odyssey Fc de	LI-COR Biotechnology	Esto se conoce como un "sistema de imágenes fluorescentes de infrarrojo cercano principalmente para manchas occidentales" en el manuscrito.
Software Image Studio (versión 4.0)	Software LI-COR Biotechnology	Image Studio	Esto se conoce como un "software de imagen particular" en el manuscrito.
Naranja	G Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Colorante			0,25% Naranja G; 30% Glicerol
0,5x TBE			45 mM Tris-Borato; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM
EDTA 5x Tampón			de unión50 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM de NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8,0; TDT de 5 mM; 250 μ g/mL BSA