Un protocolo optimizado para el ensayo de cambio de movilidad electroforética utilizando oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente infrarrojo

Summary

Se describe aquí un protocolo optimizado de ensayos fluorescentes cambio de movilidad electroforética (FEMSA) utilizando purificados Sox-2 proteínas, junto con sondas fluorescentes infrarrojos marcado tinte de ADN como un estudio de caso para hacer frente a una importante cuestión biológica.

Abstract

Ensayos de movilidad electroforética (EMSA) son una herramienta fundamental para caracterizar las interacciones entre las proteínas y sus secuencias de ADN diana. La radiactividad ha sido el método predominante de marcaje de ADN en EMSAs. Sin embargo, los recientes avances en los tintes fluorescentes y métodos de exploración han impulsado el uso de la marcación fluorescente de ADN como una alternativa a la radiactividad de las ventajas de la fácil manipulación, ahorro de tiempo, la reducción de costes, y mejorar la seguridad. Recientemente, hemos utilizado la EMSA fluorescente (FEMSA) para abordar con éxito una importante cuestión biológica. Nuestro análisis FEMSA proporciona una visión mecanicista en el efecto de una mutación sin sentido, G73E, en el factor de transcripción de la HMG SOX-2 altamente conservada en la diversificación tipo de neurona olfativa. Se encontró que el mutante SOX-2 de proteínas ^G73E altera la actividad de unión de ADN específica, lo que provoca la transformación de identidad neurona olfativa. A continuación, presentamos una optimizada y rentable paso a paso el protocoloFEMSA para el uso de oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente infrarrojo que contienen los LIM-4 / SOX-2 sitios diana adyacentes y purificados SOX-2 proteínas (WT y mutantes SOX-2 proteínas ^G73E) como un ejemplo biológico.

Introduction

EMSAs se utilizan para analizar las interacciones entre el ADN y las proteínas mediante el uso de poliacrilamida nativo electroforesis en gel (PAGE) para resolver una mezcla de una proteína de interés y una sonda de ADN marcado que contiene los posibles sitios diana de la proteína ^1. Una sonda de ADN vinculados con la proteína migrará más lento en comparación con una sonda de ADN libre, y por lo tanto retraso en su migración a través de una matriz de poliacrilamida. El radiomarcado de ADN por ³² P ha sido el método predominante para la detección en EMSAs. Aunque la aplicación de radiomarcaje en la investigación bioquímica ha sido beneficioso, se....

Protocol

NOTA: EMSAs utilizando sondas de ADN marcadas con fluorescencia u otras formas de ADN marcado comparten los mismos protocolos para la proteína o preparación de extracto de células, reacción de unión proteína-DNA, y la preparación de gel de PAGE y se ejecuta (Figura 1A). Las principales diferencias son procedimientos de ADN de etiquetado, las etapas de procesamiento de gel post-estreno y los métodos de detección.

1. Preparación del gel

1. Preparar 5% de gel de poliacrilamida nativo que contiene TBE 0,5x (45 mM de Tris-borato, EDTA 1 mM) y 2,5% de glicerol, utilizando un sistema de gel de la proteína mini (8,3 cm de ancho x 7,3 cm de es....

Results

Naranja G carga de colorante (6x: 0,12 g de Orange G en 100 ml de 30% de glicerol) se puede añadir a la reacción de unión antes de la carga para visualizar el progreso de la electroforesis. Serán detectados Otros colorantes de carga, incluyendo azul de bromofenol durante la exploración y por lo tanto interfieren con análisis de imagen (Figura 1B).

En algunos casos de EMSAs, especialmente si se utiliza la prepa.......

Discussion

fEMSAs son una herramienta eficaz para investigar las interacciones proteína-ADN, y son una alternativa a la marcación radiactiva de ADN. Los tintes fluorescentes tales como tintes de infrarrojos están disponibles comercialmente, y proporcionan un método más seguro y más respetuoso del medio ambiente en comparación con marcaje de ADN radiactiva. EMSAs utilizando fluorescentes infrarrojos oligonucleótidos marcados con colorante no requieren etapas de procesamiento gel postrun, y por lo tanto ahorrar tiempo y costes en co.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solución de acrilamida al 30%/Bis, 37.5:1	Bio-Rad	1610158	Acrilamida es perjudicial y tóxico.
6x-HIS Epitope Tag Antibody (HIS. H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anticuerpo M2 anti-bandera	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Albúmina sérica bovina (BSA) grado de biología molecular	New England Biolabs	B9000S
Oligos de ADN marcados con 5'IRDye700 Tecnologías de	ADN integradas	Oligonucleótidos de ADN personalizados	Estos se denominan "Oligós de ADN marcados con tinte 5' o fluorescentes infrarrojos" en el manuscrito. La compañía sintetizará de forma personalizada oligonucleótidos de ADN marcados con 5' IRDye. Requiere un mínimo de 100   μ Síntesis a escala M y purificación por HPLC.
Fragmento de Klenow (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN  Célula de electroforesis vertical	Bio-Rad	1658000FC	Esto se conoce como un "mini sistema de gel de proteínas" en el manuscrito. Se puede utilizar cualquier sistema electroforético siempre que sean placas de vidrio transparente de menos de 25 cm x 25 cm de tamaño.
Sistema de imágenes infrarrojas Odyssey CLx	LI-COR Biotechnology	Odyssey CLx Infrared Imagng System	Esto se conoce como un "sistema avanzado de imágenes infrarrojas" en el manuscrito.
Sistema de imágenes Odyssey Fc	dual Odyssey Fc de	LI-COR Biotechnology	Esto se conoce como un "sistema de imágenes fluorescentes de infrarrojo cercano principalmente para manchas occidentales" en el manuscrito.
Software Image Studio (versión 4.0)	Software LI-COR Biotechnology	Image Studio	Esto se conoce como un "software de imagen particular" en el manuscrito.
Naranja	G Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Colorante			0,25% Naranja G; 30% Glicerol
0,5x TBE			45 mM Tris-Borato; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM
EDTA 5x Tampón			de unión50 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM de NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8,0; TDT de 5 mM; 250 μ g/mL BSA