La terapia fotodinámica (TFD) es una opción alternativa para el tratamiento del cáncer de pulmón. Para aumentar el efecto terapéutico de la TFD, se desarrollaron nanopartículas dirigidas al cáncer de pulmón combinadas con quimioterapia. Se evaluaron las eficacias anticancerígenas tanto in vitro como in vivo de la TFD con nanopartículas preparadas.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Contra el cáncer eficacia de la terapia fotodinámica con nanopartículas orientada por cáncer de pulmón
En este artículo
Resumen
Resumen
La terapia fotodinámica (TFD) es un método no invasivo y no quirúrgico que representa una opción alternativa atractiva para el tratamiento del cáncer de pulmón. Los fotosensibilizadores se acumulan selectivamente en el tejido tumoral y provocan la muerte de las células tumorales en presencia de oxígeno y la longitud de onda adecuada de la luz.
Para aumentar el efecto terapéutico de la TFD, desarrollamos nanopartículas dirigidas al cáncer de pulmón cargadas de fotosensibilizadores y anticancerígenos. Se aplicaron tanto la focalización pasiva basada en el efecto de permeabilidad y retención mejoradas (EPR) como la focalización activa basada en la interacción entre el ácido hialurónico y el CD44. CD44 es un conocido receptor de ácido hialurónico que a menudo se introduce como biomarcador del cáncer de pulmón de células no pequeñas.
Además, en el presente estudio se adopta una combinación de TFD y quimioterapia. Este concepto de combinación puede aumentar los efectos terapéuticos contra el cáncer y reducir las reacciones adversas.
Elegimos la hipocrelina B (HB) como un nuevo fotosensibilizador en este estudio. Se ha reportado que el HB causa una mayor eficacia anticancerígena de la TFD en comparación con los derivados de la hematoporfirina1. El paclitaxel fue seleccionado como fármaco contra el cáncer ya que ha demostrado ser un tratamiento potencial para el cáncer de pulmón2.
Se compararon las eficacias antitumorales de la solución fotosensibilizadora (HB), las nanopartículas de ácido hialurónico-ceramida encapsuladas en fotosensibilizador (HB-NPs) y las nanopartículas de ácido hialurónico-ceramida encapsuladas (HB-P-NPs) encapsuladas en fotosensibilizador y anticancerígeno (paclitaxel) después de la TFD, tanto in vitro como in vivo. Se evaluó la fototoxicidad in vitro en células A549 (adenocarcinoma de pulmón humano) y la eficacia antitumoral in vivo en ratones portadores de tumores A549.
El grupo de tratamiento HB-P-NP mostró el efecto anticancerígeno más eficaz después de la TFD. En conclusión, los HB-P-NPs preparados en el presente estudio representan un potencial y novedoso sistema de administración de fotosensibilizadores en el tratamiento del cáncer de pulmón con TFD.
Introducción
La terapia fotodinámica (TFD) se compone de tres factores principales: fotosensibilizadores, luz y oxígeno. La TFD se ha reportado como un tratamiento prometedor para varios tipos de cáncer3. Cuando los fotosensibilizadores se administran en el paciente con cáncer, se acumulan selectivamente en los tejidos tumorales. Cuando se aplica la longitud de onda de luz adecuada, el oxígeno singlete altamente reactivo y otros radicales libres conducen al daño de las célulastumorales 4.
El cáncer de pulmón se introdujo como una de las primeras aplicaciones para la TFD a principios de la década de 19805. La TFD proporciona varias ventajas en el tratamiento del cáncer de pulmón. Dado que la TFD es un tratamiento no invasivo y no quirúrgico, es una opción alternativa atractiva para los pacientes en los que la resección quirúrgica es inapropiada.
Ha habido muchos desafíos para mejorar la eficacia de los fotosensibilizadores en la lucha contra el cáncer. El aumento de la acumulación de fotosensibilizadores en los sitios de cáncer y la disminución de la acumulación en los tejidos normales son los objetivos idénticos para los estudios dirigidos al cáncer. Se adopta una variedad de sistemas de administración de fármacos dirigidos, como polímeros, liposomas y nanopartículas, como portadores de fotosensibilizadores6-8. En nuestros estudios previos, las nanopartículas aumentaron efectivamente la capacidad de los fotosensibilizadores para atacar el cáncer9,10. Las nanopartículas son portadores ideales para atacar el cáncer, ya que poseen capacidades de ataque tanto pasivas como activas. Los vasos tumorales permeables brindan la oportunidad para que los portadores de tamaño nanométrico se acumulen fácilmente en los tumores, lo que se conoce como el efecto de permeabilidad y retención mejoradas (EPR)11,12. La interacción entre las nanopartículas y los receptores específicos de las células cancerosas permite la detección activa del cáncer. En este estudio, preparamos nanopartículas a base de ácido hialurónico para interactuar con CD44, el principal receptor de ácido hialurónico que se sobreexpresa en las células de cáncer de pulmón13.
Para maximizar la eficacia anticancerígena, se adopta una combinación de TFD y quimioterapia en el presente estudio. Este concepto de combinación puede permitir un mayor efecto terapéutico. Además, la disminución de las dosis tanto del fotosensibilizador como del fármaco contra el cáncer puede disminuir los efectos adversos. En el presente estudio seleccionamos la hipocrelina B (HB) como un nuevo fotosensibilizador. El HB se aísla del hongo medicinal chino Hypocrella bambuase. Shang et al. informaron que la TFD basada en HB posee una mayor eficacia anticancerígena en comparación con la TFD basada en derivados de hematoporfirina1. El paclitaxel fue seleccionado como el medicamento contra el cáncer ya que ha demostrado ser un tratamiento potencial para varios tipos de cáncer, incluido el cáncer de pulmón2.
Aquí, comparamos las eficacias anticancerígenas de la solución fotosensibilizadora (hipocrellina B, HB), las nanopartículas de ácido hialurónico-ceramida encapsuladas en fotosensibilizador (HB-NPs) y las nanopartículas de ácido hialurónico-ceramida encapsuladas (HB-P-NPs) con fotosensibilizador y agente anticancerígeno (paclitaxel) después de la TFD. Se evaluó la fototoxicidad in vitro en células A549 (adenocarcinoma de pulmón humano) y la eficacia antitumoral in vivo en ratones portadores de tumores A549.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
NOTA: Todos los protocolos de los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Hospital Bundang Universidad Nacional de Seúl (BA1308-134 / 072-01).
1. Síntesis de ácido hialurónico-ceramida (ECA)
- Solubilizar 12,21 mmol de ácido hialurónico oligómero (HA) y 9,77 mmol de hidróxido de tetra- n -butilamonio (TBA) en 60 ml de agua doblemente destilada (DDW). Se agita durante 30 min.
- Para sintetizar el enlazador DS-Y30, se disuelven 8,59 mmoles de ceramida DS-Y30 y 9.45 mmol de trietilamina en 25 ml de tetrahidrofurano (THF). Mezclar con 8,59 mmol de cloruro de 4-clorometilbenzoilo en THF. Se agita durante 6 horas a 60 ° C.
- Se disuelve el 8,10 mmol sintetizado de HA-TBA y 0,41 mmol de enlazador DS-Y30 en una mezcla de THF y acetonitrilo (4: 1, v / v). Se agita durante 5 horas a 40 ° C.
- Eliminar las impurezas mediante el filtrado con un agente de filtro, y eliminar el disolvente orgánico por evaporación a vacío. Se purifica el producto usando una membrana de diálisis (peso molecular de corte: 3,5 kDa) y se liofiliza.
2. Preparación de las nanopartículas
- Disolver 1 mg de HB y 1 mg de paclitaxel en 0,5 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) y se mezclan con 0,5 ml de DDW por vórtice de mezcla durante 5 min. Entonces, solubilizar HACE en la mezcla por vórtice mezcla durante otros 5 min.
- Para eliminar el disolvente, el calor a 70 ° C durante 4 h bajo una corriente suave de gas nitrógeno.
- Resuspender la película compuesta de ECA, HB, y paclitaxel con 1 ml de DDW. Filtrar con un filtro de jeringa (0,45 micras de tamaño de poro) para eliminar los medicamentos no encapsulados.
3. En Vitro fototoxicidad
- La adopción de las nanopartículas en líneas celulares de cáncer de pulmón
- Preparar (v / v) de suero RPMI-1640 10% que contenía medio-bovino fetal y 1% (w / v) de penicilina-estreptomicina.
- Células A549 semillas en placas de cultivo celular de 24 pocillos a una densidad de 1 x 10 5 células / pocillo (por triplicado para cadagrupo). Incubar durante 24 horas a 37 ° C en una atmósfera de aire de CO2 y 95% al 5% humidificado.
- Después de la unión celular, se elimina el medio y se lavan las células mediante la adición de 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Disolver las nanopartículas en PBS a una concentración final de 2 M / ml HB. A continuación, se incuban las células con 1 ml de PBS, NP vacías, HB-PN, o HB-P-NP en cada pocillo durante 4 horas en la oscuridad.
- Quitar toda la solución y se lavan las células mediante la adición de 1 ml de PBS frío. Repetir la etapa de lavado una vez más. Añadir medio de cultivo fresco.
- ensayo de viabilidad celular
- Coloque la placa de cultivo celular debajo de la fibra TFD (con 1 cm de distancia de la fibra PDT para el bienestar). Use gafas de seguridad láser e iluminar las células con un láser PDT (630 nm, 400 mW / cm2) en la oscuridad durante varios períodos de tiempo: 0, 5, 10, 20, 30 y 40 segundos (0, 2, 4 , 8, 12, y 16 J / cm 2). A continuación, se incuban las células durante 24 horas en la oscuridad.
- Aspirar el medio y lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS frío. Repetir la etapa de lavado una vez más.
- Añadir 10 l de solución de medición citotoxicidad a cada pocillo. Incubar en la oscuridad durante 2 hr.
- Medir la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas.
- El análisis microscópico
- Coloque la placa de cultivo celular debajo de la fibra TFD (con 1 cm de distancia de la fibra PDT para el bienestar). Use gafas de seguridad láser e iluminar las células con un láser PDT (630 nm, 400 mW / cm2) en la oscuridad durante 0, 20, o 40 segundos (0, 8, o 16 J / cm2). A continuación, se incuban las células durante 24 horas en la oscuridad.
- Aspirar el medio y lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS frío. Repetir la etapa de lavado una vez más.
- Añadir 50 l de anexina V-FITC y 50 l de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1,5 mg / ml). Agitar suavemente la placa y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
NOTA: Utilice la anexina V-FITC del kit microscopio de fluorescencia. - Lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS frío. Repetir la etapa de lavado una vez más. Mantener las células en PBS fresco. Identificar las células apoptóticas utilizando un microscopio óptico a un aumento de 100X.
- clasificación de células activadas por fluorescencia análisis (FACS)
- Coloque la placa de cultivo celular debajo de la fibra TFD (con 1 cm de distancia de la fibra PDT para el bienestar). Use gafas de seguridad láser e iluminar las células con un láser PDT (630 nm, 400 mW / cm2) durante 0, 20, o 40 segundos (0, 8, o 16 J / cm2). A continuación, se incuban las células durante 24 horas en la oscuridad.
- Aspirar el medio y lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS frío. Repetir la etapa de lavado una vez más.
- Resuspender las células en 1 ml de tampón de unión 1 x (diluir 1 parte del tampón de unión 10x; 0,1 M Hepes / NaOH (pH 7,4), 1,4 M NaCl, y 25 mM CaCl 2 a 9 partes de agua destilada) y la transferencia de 100 l de la solución de muestra a una 5-mltubo de cultivo.
- Añadir 5 l de anexina V-FITC y 5 l de yoduro de propidio (PI). vórtice suavemente el tubo y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad. Añadir 400 l de tampón de unión 1 ×.
NOTA: Utilice la anexina V-FITC y PI del kit microscopio de fluorescencia. - Identificar las células apoptóticas mediante FACS 14. Las líneas de láser de excitación de PI y la anexina V-FITC son 488 nm y 635 nm, respectivamente. Medir la emisión de fluorescencia del PI y la anexina V-FITC a 610 ± 20 nm y 660 ± 20 nm, respectivamente. Recoger las células adquiridas en el citómetro de flujo por cada 10.000 eventos.
4. Eficacia in vivo contra el cáncer en ratones portadores de tumores
- modelo de ratón inducida por el cáncer de pulmón
- Preparar 1 × 10 6 células A549 en 0,1 ml de medio RPMI-1640; mantenerlo en hielo.
- Anestesiar a los ratones con una inyección ip de un xilazina y una mezcla de tiletamina y zolazepam (1: 2, 1 ml /kg). Confirmar la anestesia adecuada pellizcando suavemente un pequeño pliegue de piel de ratón. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
NOTA: Si no se observa movimiento, el animal es suficientemente anestesiado para comenzar los experimentos. - Inyectar las células por vía subcutánea en los flancos izquierdo de / C macho ratones desnudos BALB (6 - 7 semanas de edad, 20 - 22 g).
- Mantener la observación de los ratones hasta que empiezan a moverse alrededor de la jaula.
NOTA: No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo. Mantener a los ratones bajo condiciones libres de patógenos específicos (SPF). - Medir el tamaño del tumor con calibres cada día. Calcular el volumen del tumor (mm 3) como (longitud x anchura 2) / 2. Cuando el tamaño del tumor alcanza aproximadamente 200 mm 3 en volumen, iniciar el experimento.
- estudio de eficacia contra el cáncer
- Aleatoriamente dividir los ratones en 4 grupos (n = 10 para cada grupo).
- Anestesiar a los ratones con una inyección ip de un xilazina y una mezcla de tiletamina y zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Confirmar la anestesia adecuada pellizcando suavemente un pequeño pliegue de piel de ratón. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
NOTA: Si no se observa movimiento, el animal es suficientemente anestesiado para comenzar los experimentos. - Disolver las nanopartículas en PBS a una concentración final de 2 mg / ml HB. Se inyecta PBS, libre de HB, HB-PN, o HB-P-NP a través de la vena de la cola (2 mg / kg como HB) dos veces en los días 0 y 7.
- Mantener la observación de los ratones hasta que empiezan a moverse alrededor de la jaula.
NOTA: No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta su completarecuperado. Mantener las jaulas oscuridad y bajo condiciones SPF específicos. - 24 horas después de cada inyección, anestesiar a los ratones con una inyección ip de un xilazina y una mezcla de tiletamina y zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Confirmar la anestesia adecuada pellizcando suavemente un pequeño pliegue de piel de ratón. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
NOTA: Si no se observa movimiento, el animal es suficientemente anestesiado para comenzar los experimentos. - Coloque el sitio del tumor bajo la fibra PDT (de 1 cm de distancia de la fibra PDT al tumor). Use gafas de seguridad láser, apague el interruptor, e iluminar el tumor con un láser PDT (630 nm, 400 mW / cm2) durante 500 seg (200 J / cm2) dos veces en los días 1 y 8.
- Mantener la observación de los ratones hasta que empiezan a moverse alrededor de la jaula. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que tiene undergone cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
- Mantener las jaulas en condiciones SPF. Mantener las jaulas en la oscuridad durante 24 horas después de tratamiento con láser.
- supervisar visualmente el volumen del tumor y los cambios en el sitio del tumor cada día. Medir el tamaño del tumor con calibradores, y calcular el volumen como (longitud x anchura 2) / 2 (mm 3). Tome fotografías de los sitios tumorales todos los días para verificar si hay alteraciones de la superficie del tumor después de la TFD.
- En el día 16, sacrificar cinco ratones por grupo con anestesia terminales utilizando isoflurano.
- Con pinzas y tijeras, corte la piel exterior y exponer los tumores 15. Cuidadosamente la cosecha. Fijarlos en formalina al 10%, incrustarlos en parafina, y teñirlos con hematoxilina y eosina (H & E) para el análisis histológico 16.
- Después de 45 días de seguimiento, sacrificar los ratones restantes por la anestesia terminales utilizando isoflurano.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Preparamos tanto HB-PN y HB-P-NP con las técnicas mencionadas anteriormente. Los diámetros medios de HB-NPs y HB-P-NP fueron 220,9 ± 3,2 nm y 211,9 ± 1,6 nm, respectivamente.
La viabilidad celular de las células A549 después de 4 horas de incubación con PBS, NP vacías, HB-PN, y HB-P-NP seguido de irradiación de luz (de 0 a 16 J / cm2) se muestra en la Figura 1. Sin luz, la grupo de tratamiento HB-NP...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El paso más crítico en este estudio es la selección de las condiciones apropiadas láser: longitud de onda, potencia y tiempo de irradiación. La longitud de onda apropiada de luz adecuada para el fotosensibilizador específica es necesaria para la PDT. Se utilizó un láser de 630 nm que era apropiado para hipocrelina B. La potencia de salida era otro factor importante, que se fijó en 400 mW / cm2 sobre la base de muchos estudios piloto. Potencias de salida superior a 400 mW / cm2 dañadas las células o...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por ninguna concesión. 14-2014-017 del Fondo de Investigación SNUBH.
Los autores están en deuda con J. Patrick Barron, Profesor Emérito de la Universidad Médica de Tokio y Profesor Adjunto, Hospital Bundang Universidad Nacional de Seúl, por su pro bono edición de este manuscrito.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ácido oligohialurónico | Bioland Co., Ltd. | _ | |
| DS-Y30 (ceramida 3B; principalmente N-oleoil-fitoesfingosina) | Doosan Biotech Co., Ltd. | _ | |
| dihidrazida de ácido adípico | Sigma Aldrich | A0638 | |
| N-(3-dimetilaminopropil)-N′ -etilcarbodiimida | Sigma Aldrich | 39391 | |
| 4-(clorometil)benzoilo cloruro | Sigma Aldrich | 270784 | |
| Tween 80 | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | T0546 | |
| filtro de jeringa | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 17762 | 15 mm, RC, PP, 0,45 y micro; m |
| trietilamina | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Mini-GeBAflex tubos | Gene Bio-Application Ltd. | D070-12-100 | |
| Paclitaxel | Taihua Corporaciones | _ | |
| RPMI-1640 | Gibco Life Technologies, Inc. | 11875 | |
| Penicilina– estreptomicina | Gibco Life Technologies, Inc. | 15070 | |
| Suero fetal bovino | Gibco Life Technologies, Inc. | ||
| Celite (Agente filtrante) | Sigma Aldrich | 6858 | Ver paso 1.4 |
Referencias
- Shang, L., Zhou, N., Gu, Y., Liu, F., Zeng, J. Comparative study on killing effect of esophageal cancer cell line between hypocrellin B-photodynamic therapy and hematoporphyrin derivative-photodynamic therapy. Chin J Cancer Prev Treat. 12, 1139-1142 (2005).
- Huisman, C., et al. Paclitaxel triggers cell death primarily via caspase-independent routes in the non-small cell lung cancer cell line NCI-H460. Clin Cancer Res. 8 (2), 596-606 (2002).
- Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
- Pass, H. I. Photodynamic therapy in oncology: mechanisms and clinical use. J Natl Cancer Inst. 85 (6), 443-456 (1993).
- Sutedja, T. G., Postmus, P. E. Photodynamic therapy in lung cancer. A review . J. Photochem. Photobiol. 36 (2), 199-204 (1996).
- Peng, C. L., Shieh, M. J., Tsai, M. H., Chang, C. C., Lai, P. S. Self-assembled star-shaped chlorin-core poly(epsilon-caprolactone)-poly(ethylene glycol) diblock copolymer micelles for dual chemo-photodynamic therapies. Biomaterials. 29 (26), 3599-3608 (2008).
- Chen, B., Pogue, B. W., Hasan, T. Liposomal delivery of photosensitising agents. Expert Opin Drug Deliv. 2 (3), 477-487 (2005).
- Lee, S. J., et al. Comparative study of photosensitizer loaded and conjugated glycol chitosan nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 152 (1), 21-29 (2011).
- Chang, J. E., et al. Anticancer efficacy of photodynamic therapy with hematoporphyrin-modified, doxorubicin-loaded nanoparticles in liver cancer. J. Photochem. Photobiol. 140, 49-56 (2014).
- Chang, J. E., Cho, H. J., Yi, E., Kim, D. D., Jheon, S. Hypocrellin B and paclitaxel-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles for targeted photodynamic therapy in lung cancer. J. Photochem. Photobiol. 158, 113-121 (2016).
- Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. Nanoparticle delivery of cancer drugs. Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46 (12 Pt 1), 6387-6392 (1986).
- Penno, M. B., et al. Expression of CD44 in human lung tumors. Cancer Res. 54 (5), 1381-1387 (1994).
- Wilkins, R., Kutzner, B., Truong, M., Sanchez-Dardon, J., McLean, J. Analysis of radiation-induced apoptosis in human lymphocytes: Flow cytometry using Annexin V and propidium iodide versus the neutral comet assay. Cytometry. 48 (1), 14-19 (2002).
- Bannas, P., et al. Validation of nanobody and antibody based in vivo tumor xenograft NIRF-imaging experiments in mice using ex vivo flow cytometry and microscopy. J Vis Exp. (98), e52462(2015).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).
- Lam, S. Photodynamic therapy of lung cancer. Semin Oncol. 21 (6 Suppl 15), 15-19 (1994).
- Simone, C. B. 2nd, et al. Photodynamic therapy for the treatment of non-small cell lung cancer. J Thorac Dis. 4 (1), 63-75 (2012).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
