La congelación de inmersión: una herramienta para los estudios ultraestructurales e inmunolocalización de células en suspensión en Microscopía Electrónica de Transmisión

Resumen

Este manuscrito describe un método fácil de usar y criofijación bajo costo para la visualización de células en suspensión por microscopía electrónica de transmisión.

Resumen

Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) es una herramienta extraordinaria para estudiar la ultraestructura celular, con el fin de localizar las proteínas y visualizar complejos macromoleculares a muy alta resolución. Sin embargo, para llegar lo más cerca posible al estado nativo, es necesaria conservación de la muestra perfecta. la fijación convencional microscopía electrónica (EM) con aldehídos, por ejemplo, no proporciona una buena conservación ultraestructural. La penetración lenta de fijadores induce reorganización celular y la pérdida de los diversos componentes de la célula. Por lo tanto, la fijación EM convencional no permite una estabilización instantánea y la preservación de las estructuras y antigenicidad. La mejor opción para el examen de eventos intracelulares es utilizar criofijación seguido por el método de fijación de congelación-sustitución que mantiene a las células en su estado nativo. congelación de alta presión / de congelación-sustitución, que conserva la integridad de la ultraestructura celular, es el método más comúnmente utilizado, pero requiere expensicinco equipos. Aquí, se presenta un método fácil de usar y fijación de congelación bajo costo seguido de congelación-sustitución de cultivos de células en suspensión.

Introducción

Preparación de la muestra es crítico para el éxito de cualquier estudio de microscopía electrónica. Convencional fijación EM era el principal método para la fijación de tejidos o células para microscopía electrónica de transmisión (TEM) ^1. En primer lugar, aldehídos y tetróxido de osmio se utilizan para fijar químicamente el material a temperatura ambiente. Luego, el material se deshidrató con disolventes orgánicos, se infiltró, y se embebió en resina epoxi. Este método depende de la tasa de penetración de los fijadores en la célula. En consecuencia, los artefactos y la extracción de los contenidos celulares se observan generalmente

Protocolo

1. Preparación de Formvar cuadrícula Film

NOTA: Realizar la manipulación cloroformo bajo una campana de extracción usando el equipo de protección personal (guantes, bata de laboratorio, gafas). Utilice 400 rejillas de cobre de malla de microscopía electrónica. Con otros tipos de rejilla (otros tamaños de malla, de oro y de rejillas de níquel), la calidad de congelación es peor.

1. Preparar una solución de 100 ml de 0,3% formvar en cloroformo. Deje que se disuelva durante la noche sin agitación.
2. Ponga 400 de malla (número de agujeros por pulgada cuadrada) rejillas microscopycopper de electrones (diámetro 3,05 mm) en un vi....

Resultados

En este artículo, se presenta un método de congelación-fácil de usar y de inmersión de bajo costo para ultraestructurales (Figuras 1 y Figura 2) y immunolabeling (Figura 3) estudios. Se demuestra que no es necesario contar con un equipo especial para el procedimiento de congelación-sustitución y que el procedimiento de calentamiento tarda menos de 6 h en lugar de las 24 h utilizando un sistema dedic.......

Discusión

TEM es un método poderoso para la observación ultraestructural de los orgánulos, células y tejidos. Criofijación / congelación-sustitución es actualmente el mejor método para la conservación de ambos ultraestructura y la proteína de la antigenicidad. Fijadores químicos penetran y actúan muy lentamente permitiendo de este modo reordenamientos estructurales antes de la estabilización completa de la ultraestructura ^2. A la inversa, criofijación / congelación-sustitución estabiliza instantáneamente e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Rejillas	Ciencias de la Microscopía Electrónica	T400-Cu
Formvar	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15800
Propano N35
Nitrógeno
Aguja de disección de doble filo	Ciencias de la Microscopía Electrónica	72947
Crioviales	Ciencias de la Microscopía Electrónica	61802-02
Tetróxido de osmio	Ciencias de la Microscopía Electrónica	19130
Frasco de vidrio 8,5 mL	Ciencias de la Microscopía Electrónica	64252
Acetato de uranilo	Ciencias de la Microscopía Electrónica	48851
Acetona	Sigma	32201
Etanol 100%	Sigma	32221
Vidrio portaobjetos	VWR international	631-9439
Pinzas
Resina acrílica	Microscopía electrónica Ciencias 104371
Resina epoxi M	Sigma	10951
Resina epoxi M endurecedor	Sigma	10953
Ftalato de dibutilo	Sigma	80102
Resina epoxi M accelerateur	Sigma	10952
Cristalizador	Fischer scientific	08-762-9
Joseph paper	VWR international	111-5009
Tazas			hágalo usted mismo, tienda o hecho por usted mismo
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli
Caja hermética	Fischer scientific	7135-0001
Respirador purificador de aire	Fischer scientific	3M 7502
Cartucho para respirador	Fischer scientific	3M 6001
Filtro de partículas	Fischer scientific	3M 5N11

líquido de latón