Combinando húmedo y Técnicas de laboratorio de simulación para guiar la cristalización de proteínas grandes que contengan espiral de la bobina

Summary

Describimos un marco que incorpora análisis bioquímicos y computacionales sencillos para guiar la caracterización y cristalización de grandes dominios de bobinas enrolladas. Este marco puede adaptarse para proteínas globulares o ampliarse para incorporar una variedad de técnicas de alto rendimiento.

Abstract

Obtener cristales para la determinación de la estructura puede ser una propuesta difícil y que requiere mucho tiempo para cualquier proteína. Las proteínas y dominios en espiral se encuentran en toda la naturaleza, sin embargo, debido a sus propiedades físicas y su tendencia a agregarse, tradicionalmente se considera que son especialmente difíciles de cristalizar. Aquí, utilizamos una variedad de técnicas rápidas y simples diseñadas para identificar una serie de posibles límites de dominio para una proteína en espiral dada, y luego caracterizar rápidamente el comportamiento de estas proteínas en solución. Con la adición de una etiqueta fuertemente fluorescente (mRuby2), la caracterización de proteínas es simple y directa. La proteína objetivo se puede visualizar fácilmente con luz normal y se puede cuantificar con el uso de un generador de imágenes adecuado. El objetivo es identificar rápidamente a los candidatos que pueden eliminarse de la línea de cristalización porque es poco probable que tengan éxito, lo que permite más tiempo para los mejores candidatos y menos fondos gastados en proteínas que no producen cristales. Este proceso se puede iterar para incorporar la información obtenida de los esfuerzos iniciales de cribado, se puede adaptar para procedimientos de expresión y purificación de alto rendimiento, y se aumenta mediante el cribado robótico para la cristalización.

Introduction

Determinación de la estructura a través de la cristalografía de rayos X ha hecho contribuciones fundamentales a todos los campos de la biología moderna; proporcionar una visión atómica de las macromoléculas que sostienen la vida y la forma en que interactúan unos con otros en una variedad de contextos; lo que nos permite comprender los mecanismos que causan la enfermedad y proporcionar oportunidades para el diseño racional de fármacos para tratar la enfermedad. Cristalografía ha sido durante mucho tiempo la técnica experimental dominante para la determinación de la estructura macromolecular, y en la actualidad representa el 89,3% de la base de datos estructurales (www.rcsb.org). Esta técnica tiene muchas ventajas, incluyendo el potencial de muy alta resolución, la capacidad de visualizar macromoléculas con una amplia gama de tamaños, la recopilación de datos relativamente fácil, y la oportunidad de visualizar cómo la macromolécula interactúa con disolvente, así como ligandos.

A pesar de numerosas mejoras tecnológicas en la expresión de la proteína recombinante ^1,2, purification ^3, y la biología molecular utilizado para generar estos sistemas ^4, el mayor obstáculo en el proceso de cristalográfica sigue siendo la capacidad de crecer cristales de calidad de difracción. Esto ha sido especialmente cierto para las proteínas que contienen grandes dominios de doble arrollamiento. Se ha estimado que hasta un 5% de todos los aminoácidos se encuentran dentro de enrollado de las bobinas ^5,6, haciendo de esta una característica estructural muy común ^7, sin embargo, estas proteínas son a menudo más difíciles de purificar y cristalizar que las proteínas globulares ^8-10 . Esto se complica aún más por el hecho de que los dominios de enrollado de la bobina se encuentran a menudo en el contexto de una proteína más grande, por lo tanto, predecir correctamente los límites de estos dominios es crítico para evitar la inclusión de la secuencia no estructurada o flexible que es a menudo perjudicial para la cristalización.

Aquí presentamos un marco conceptual basado en la web que combina computacional analiza con experil datos de la banca, para ayudar a guiar a los usuarios a través de las etapas iniciales del proceso cristalográfica incluyendo: cómo seleccionar fragmento (s) de proteínas para estudios estructurales, y la forma de preparar y caracterizar muestras de proteínas antes de los intentos de cristalización. Nos centramos nuestro análisis en dos proteínas que contienen grandes dominios de doble arrollamiento, Shroom (SHRM) y Rho-quinasa (Rock). Se eligieron estas proteínas, ya que ambos contienen dominios de doble espiral y son conocidos para formar un complejo biológicamente relevante ^11-16. Hongo y Rho-quinasa (Rock) se prevé que contienen ~ 200 y 680 residuos de espiral de la bobina, respectivamente, muchas porciones de las cuales se han caracterizado estructuralmente ^17-20. El método aquí descrito proporciona un flujo de trabajo optimizado para identificar rápidamente fragmentos de proteína que contiene espiral de la bobina que va a ser susceptibles para la cristalización, sin embargo, las técnicas descritas pueden ser fácilmente adaptados para la mayoría de la proteína o proteína-complejos o modificados para incorporar approa de alto rendimientoches como disponibles. Por último, estos métodos son generalmente de bajo costo y puede ser realizada por los usuarios en casi todos los niveles de experiencia.

Protocol

NOTA: Un diagrama del marco conceptual o flujo de trabajo se describe en la Figura 1 como referencia. El protocolo se puede dividir en cuatro etapas: predicciones basadas computacionales o de secuencia, expresión y purificación de proteínas, caracterización bioquímica, y cristalización. Los ejemplos mostrados analizan dominios Shroom SD2 y / o complejos Shroom-Rock, pero se pueden utilizar con cualquier proteína.

1. Uso Establecido herramientas basadas en web para generar predicciones computacionales de los límites del dominio de doble arrollamiento

1. Recoge un conjunto de Evolutivamente diverso de homólogos secuencia.
   1. Ir a www.uniprot.org y el tipo de Shroom en la barra de búsqueda superior.
   2. Seleccione secuencias de descarga marcando la casilla junto a su número de acceso. Las secuencias con una estrella indican secuencias revisados ​​por Uniprot y son generalmente más fiable. Tener cuidado de asegurarse de que todas las secuencias son completos y exactos.
   3. Save the s seleccionadosequences haciendo clic en el botón Descargar.
   4. Alinear la colección de secuencias de Shroom utilizando Clustal-Omega ²¹ (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Haga clic en el botón "Examinar" para seleccionar el archivo con las secuencias de Shroom y luego haga clic en Enviar.
   5. Después de la alineación se ha completado, haga clic en el botón "Descargar archivo de alineación".
   6. Abra la alineación de secuencias múltiples generada en 1.1.5 usando Jalview (Archivo | Entrada de alineación | Desde archivo). Dentro de la nueva ventana de alineación, color de identidad (color | Porcentaje de Identidad).
2. Calcular predicciones de estructura secundaria, las predicciones de la secuencia flexible o desordenada, y predijo regiones de doble arrollamiento dentro de la proteína (s) de interés.
   1. Ir a http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, para calcular las predicciones de doble arrollamiento. Copiar y pegar la secuencia en el cuadro de secuencia y haga clic en Enviar.
      NOTA: Este análisis puede tardar un par de horas a complete. Como las secuencias Shroom son bastante grandes, las secuencias pueden tener que ser dividido en bloques de menos de 1.000 aminoácidos para encajar dentro de la restricción de tamaño del servidor web. Al analizar Shrm2, se recomienda que el C-terminal de 1.000 aminoácidos se utilizan como esta sección contiene el dominio SHRM SD2 que se sabe que contienen regiones de doble espiral. Al repetir este análisis con otras proteínas, se recomienda utilizar las secuencias de la proteína de longitud completa que sea posible. Si eso no es una opción, utilice el fragmento más grande posible o diseccionar la secuencia basado en datos bioquímicos o funcionales conocidos.
   2. Ir a http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, para calcular las predicciones de doble arrollamiento. Copiar y pegar la secuencia en el cuadro de secuencia y haga clic en Enviar.
3. Combinar los resultados de los pasos 1.1 a 1.2.2 en una sola anotación completa de la secuencia de Shroom.
   NOTA: es muy aconsejable incluir también cualquier y todo lo relevantenformación que se puede extraer de la literatura o de otras fuentes acerca de la función de proteínas o purificación en esta etapa.
4. Usando esta secuencia anotada completa, predecir los límites de dominio (o una serie de posibles límites) para la proteína, tratando de maximizar la conservación y pronosticado características estructurales y reducir al mínimo la cantidad de secuencia desordenada o flexible. Si se conoce, la proteína resultante debe conservar las propiedades funcionales de interés.

2. expresar y purificar proteínas con los límites de los dominios identificados en la Sección 1

NOTA: El objetivo de esta sección es el uso de una serie de ensayos rápidos y fácilmente cuantificables para detectar los límites de dominio hipotéticos generados en la Sección 1.

1. El uso de técnicas de biología molecular convencionales, generar un plásmido de expresión con la secuencia de codificación deseada en marco dentro del _Su-10 plásmido -mRuby2-XH2 (Ver Figura 3 para el mapa vectorial de unand detalles adicionales).
2. Los niveles de expresión de ensayo para cada plásmido de expresión usando BL21 (DE3) de E. coli u otra cepa de expresión adecuado en los medios de autoinducción ¹ a temperatura ambiente durante 18 a 24 hr.
   1. Transformar los plásmidos de expresión, así como un control plásmido vacío en BL21 (DE3) siguiendo las instrucciones que vienen con las células o utilizando robusto protocolo de transformación, tales como la de aquí (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -transformación/).
   2. A partir de la placa recién transformado, elegir una sola colonia y hacer crecer un cultivo iniciador 5 ml a 37 ° C durante la noche en caldo Lisogenia (LB) los medios de comunicación con 34 mg / ml de kanamicina.
   3. Al día siguiente, sedimentar la cultura y lavar el precipitado con LB. fresca
   4. Añadir el cultivo iniciador a 50 ml de medio de autoinducción con 34 g / ml de kanamicina. Deje que el cultivo crezca hasta saturación a temperatura ambiente oa 37 ° C. Típicamente, crecer durante ~ 18 a 24 hr.
   5. pellet celulars y congelar los sedimentos celulares resultantes a -80 ° C indefinidamente antes de la purificación.
   6. Comparación de extractos de células enteras a partir de cada cepa de expresión y el control de vector vacío por SDS-PAGE para determinar la cepa que produce la mayor parte de manera eficiente la proteína de fusión deseada. Para Sus ₁₀ proteínas de fusión -mRuby2-Shroom SD2, ejecute el 10% en geles de SDS-PAGE a 180 V durante ~ 50 min o hasta que el frente del colorante llega a la parte inferior del gel ^22.
   7. Gel de mancha con azul de Coomassie para visualizar las proteínas celulares totales dentro de cada cepa ^23.
3. Realizar un paso inicial cromatografía de afinidad en cada cepa que expresa la proteína éxito mRuby2-fusión. Por lo general, realice los pasos de purificación 2.3.2-2.3.7 a temperatura ambiente, a no ser que la proteína se beneficiará de las condiciones alteradas tales como la purificación a 4 ° C.
   1. Descongelar los sedimentos celulares procedentes de la etapa 2.2.5.
   2. Resuspender cada sedimento de células en 1,5 ml de tampón de lisis (10% de glicerol, NaCl 500 mM, 40imidazol mM, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM beta-mercaptoetanol). Suplemento el tampón de lisis con inhibidores de proteasa, según proceda.
   3. Añadir 30 l de 10 mg de lisozima / ml y se incuba a temperatura ambiente durante 20 min. Someter a ultrasonidos siguiendo las instrucciones para el instrumento que se utiliza.
   4. Transferir a un tubo de 1,5 ml y se centrifuga en una centrífuga de mesa durante 30 minutos a 14.000 xg para sedimentar el material insoluble o las células no lisadas. Ahorrar sobrenadante y el sedimento para su posterior análisis mediante SDS-PAGE.
   5. Realizar la purificación de afinidad de níquel, la incubación de la fracción soluble con 100 l de perlas de Ni-NTA. Se incuban las perlas con lisado soluble durante 5-10 min, invirtiendo varias veces para mezclar los granos.
   6. Centrifugar a 800 xg durante 30 seg en una centrífuga de mesa para sedimentar las perlas. Siga este por lavado del pellet 3-5 veces con tampón de lisis para limpiar los contaminantes no específicos.
   7. Eluir la proteína de fusión de rubíes de las perlas con tampón de lisis suplementado con 1imidazol M.
   8. Utilice SDS-PAGE para comparar el comportamiento de Sus-mRuby2-Shroom proteínas en la purificación "rápida y sucia" por encima.

3. Caracterizar proteína de la muestra para identificar a aquellos con propiedades ventajosas

1. Utilice un conjunto espectrofotómetro a 280 nm para medir la concentración de la proteína de fusión Ruby, y luego evaluar la homogeneidad de la muestra mediante la carga de 1-5 g de proteína de fusión en un gel de PAGE nativa ^24. Dejar correr el gel nativo PÁGINA 10% a 4 ° C durante 140 min a 175 V.
   1. Image la PAGE nativa usando un reproductor de imágenes equipado para visualizar la fluorescencia, observando donde la fusión de etiquetado mRuby migra en este ensayo.
      NOTA: Tenga cuidado de observar proteína de fusión que se ha quedado atascado en el pozo ya que esta proteína es probable agregada. Si un generador de imágenes de fluorescencia no está disponible, a menudo se puede visualizar y muestras de imagen concentrada de Ruby proteína marcada con una luz de color negro o con una caja de luz UV.
2. Realizar la proteólisis limitada para identificar dominios de forma estable cruzados. Incubar 95 l de Rubí-SHRM SD2 fusión a ~ 1 mg / ml con 5 l de 0,025% Subtilisina A.
   1. Ejemplo de la reacción a los puntos de tiempo de 0, 0,5, 2, 5, 15, 60, y 120 min, la eliminación de 10 l de la reacción para cada punto de tiempo y la visualización del progreso de la reacción por medio de SDS-PAGE usando un gel de acrilamida al 15% .
   2. Se tiñen con azul de Coomassie como en el paso 2.2.7 y evaluar si una especie resistente de la proteasa pueden ser identificados.
3. Integrar los datos de la eficacia de la purificación, el comportamiento en PAGE nativa, y proteólisis limitada de las proteínas de fusión mRuby2-Shroom parcialmente purificadas en una evaluación exhaustiva del comportamiento global de estas proteínas en solución.
   1. (Opcional) Si un ensayo funcional adecuado disponible, comprobar si hay actividad en este punto.

4. La producción de cristales de alta calidad de la espiral de la bobina SD2Dominio de Shroom

NOTA: Todos los pasos dentro de la sección 4.1 se realizan a temperatura ambiente a menos que la proteína se beneficiaría de la purificación a una temperatura diferente, por lo general de 4 ° C.

1. Utilizando los 50 ml crecimientos como una estimación aproximada de la expresión y el potencial de la purificación, realizar expresiones a gran escala de mRuby2-Shroom SD2 con el objetivo de lograr 5-20 mg de muestra completamente purificado. Típicamente 2 l de cultivo proporciona material de partida adecuado. Después las células de pellets de crecimiento por centrifugación a 8000 xg durante 10 min.
   1. Resuspender el precipitado del crecimiento 2 L en tampón de lisis como antes, utilizando ~ 2 ml de lisis por gramo de sedimento celular congelado si el uso de lisozima para la lisis. Como alternativa, se vuelve a suspender en ~ 8 ml / g de sedimento si se utiliza un homogeneizador o prensa francesa. Se precipitan los desechos celulares mediante centrifugación a 30.000 xg durante 30 min.
   2. Lotes une la fracción soluble a partir de 4.1.1 usando 10 ml de resina Ni-NTA. Verter en la columna apropiada gravedady permitir que las proteínas no unidas drenen.
   3. Lavar la resina 3-5 veces con 40 ml de tampón de lisis, seguido por un lavado con tampón de lisis suplementado con 1 M NaCl.
   4. resina de lavado con 40 ml de tampón de lisis suplementado con imidazol 80 mM.
   5. Eluir la proteína de fusión Rubí-Shroom con 40 ml de tampón de lisis suplementado con 1 M imidazol. fraccionar manualmente la proteína eluida en 4-10 ml de fracciones.
   6. Confirmar fracciones que contienen proteína de fusión Rubí-Shroom utilizando 10% de SDS-PAGE.
   7. Dializar las fracciones apropiadas (por lo general las fracciones 2-4) en 8% de glicerol, NaCl 250 mM, imidazol 15 mM, 20 mM Tris pH 8,0, β-ME 1 mM, utilizando tubos de diálisis 6-8 kDa MWCO. Se añade 1 mg de proteasa TEV por cada 25-50 mg de proteína de fusión. Se dializa durante la noche a temperatura ambiente con agitación lenta.
   8. purificación por afinidad de níquel repita los pasos 4.1.2. a 4.1.6. El dominio de Shroom SD2 ahora debe permanecer en la fracción no unida, mientras que el ₁₀ -mRuby2 Su permanecerá unido ala resina y se encuentran en las fracciones de elución. Confirmar esto utilizando 12% de tinción de SDS-PAGE con azul de Coomassie.
   9. Dializar fracciones que contienen dominio Shroom SD2 en 8% de glicerol, NaCl 100 mM, 20 mM Tris pH 8,0, mM de tampón 5 beta-mercaptoetanol durante la noche.
   10. Se realiza una cromatografía de intercambio aniónico ²⁵ usando un FPLC, y eluyendo con un gradiente de NaCl 0,1 a 1,0 M NaCl. Analizar fracciones usando 12% de SDS-PAGE.
   11. El uso de un concentrador de giro (MWCO de 10 kDa o mayor dependiendo de la proteína en estudio), concentrar las fracciones pico a ~ 0 mg / ml, y luego realizar la cromatografía de exclusión de tamaño ^26, el análisis de las fracciones pico a través de 12% SDS-PAGE.
   12. Piscina fracciones de los picos y se dializan en 20 mM Tris pH 8,0, NaCl 50 mM, 2% de glicerol, 1 β-ME mM, y se concentran a 10 mg / ml antes de la cristalización.
       Opcional: Durante este paso, eliminar 5 muestras mu l a concentraciones de 1, 2, 5, y 10 mg / ml durante el curso de la concentración de la muestra.Ejecutar un nativo de carga de la página 2-5 l de cada muestra para mirar el comportamiento de la muestra durante este paso.
2. Detectar un pequeño conjunto de 12 condiciones para identificar una concentración de proteína óptima para los ensayos de cristalización. La composición de estas condiciones se describe en la Figura 7.
   1. El uso de 24 pocillos que se sientan bandejas de cristalización de gota, realizar ensayos de cristalización utilizando el método de difusión de vapor, de pipeteado 500 l de cada una de las 12 condiciones en pocillos separados seguido de gotas que contienen inicialmente 1 l de solución bien y 1 l de muestra de proteína en los cubreobjetos . Por favor, vea ²⁷ para obtener información adicional sobre esta técnica.
   2. sellar rápidamente la bandeja con cinta adhesiva transparente y coloque la bandeja en un ambiente controlado de temperatura adecuado que esté libre de vibraciones. La temperatura utilizada puede variar, pero 4 ° C, 16 ° C, y 20 ° C son bastante comunes.
   3. Examinar las gotas en las bandejas durante el próximo 3 days utilizando un microscopio de hasta 100 aumentos. Al final del período de 3 días, la puntuación de cada gota contiene ninguna precipitación (clara), la precipitación ligera, fuerte precipitación (marrón), o cristales. Una concentración de proteínas adecuada debe contener no más de 6 precipitaciones fuertes.
   4. El uso de la concentración de proteína identificada en 4.2, escrutar una amplia gama de pantallas de cristalización comercialmente disponibles. El uso de una manipulación o cristalización robot líquido acelera en gran medida este proceso y al mismo tiempo minimizar el error en las gotas. Se requiere mucho menos proteínas, así, que permite al usuario a la pantalla más condiciones con una sola muestra.
   5. Mejorar las condiciones iniciales identificados a partir de las pantallas amplias variando sistemáticamente cada una de las variables dentro de la gota de cristalización utilizando bandejas de 24 pocillos de detección como antes.

Results

Un diagrama que representa el flujo de trabajo utilizado en este sistema se muestra en la Figura 1 e incluye tres etapas principales. Análisis computacional de la secuencia se utiliza para desarrollar hipótesis acerca de los límites de los dominios de la proteína espiral de la bobina de interés. Un ejemplo de un análisis anotada del dominio Shrm2 SD2 se muestra en la Figura 2. En este diagrama, el objetivo fue identificar los posibles límites de dominio ...

Discussion

El protocolo descrito aquí está diseñado para ayudar al usuario a identificar los límites de dominio dentro de las grandes proteínas espiral de la bobina para facilitar su cristalización. El protocolo se basa en una incorporación integral de una variedad de datos de predicciones computacionales y otras fuentes para generar una serie de posibles límites de dominio. Estos son seguidos por una serie de experimentos bioquímicos que son rápida y económica, y que se utilizan para perfeccionar estas hipótesis iniciales. Con es...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BL21(DE3) Rosetta	Emd Millipore	70954-3
BL21(DE3) Star	ThermoFisher Scientific	C601003
BL21(DE3) Codon Plus	Agilent Technologies	230245
Lysozyme	Spectrum Chemical Mfg Corp	L3008-5GM
Resina Ni-NTA	Life Technologies	25216
SubtilisinA	Spectrum Chemical Mfg Corp	S1211-10ML
24 pozos Cryschem Plate	Hampton research	HR3-160
INTELLI-PLATE   96:	Art Robbins Instruments	102-0001-03
PEG 3350	Investigación de Hampton	HR2-591
PEG 8000	Investigación de Hampton	HR2-515
PEG 400	Investigación de Hampton	HR2-603
PEG 4000	Investigación de Hampton	HR2-605
pcDNA3.1-Clover-mRuby2	Addgene	49089
Sistema de autoinducción exprés nocturno 1	Emd Millipore	71300
Caldo de lisogenia en polvo	ThermoFisher Scientific	12795027